Sulfotransferases

A 2‐O‐sulfotransferase atua sobre ambos resíduos de ácido urônico, IdoA e GlcA, preferindo o primeiro sob a maioria das condições quando incubada com substrato contendo ambas as unidades, refletindo a variação na afinidade para substratos contendo ácido idurônico (Rong et al., 2000). Outros fatores aparentemente regulam a extensão da 2‐O‐sulfatação, que varia de 50 a 90% para resíduos de IdoA, e aumenta consistentemente em frequência conforme o tamanho do domínio NS aumenta (Safaiyan et al., 2000). As unidades de IdoA ocorrem tanto nos domínios NS quanto nos domínios NA/NS, sendo que os localizados no último tendem a ser não sulfatados (Maccarana et al., 1996). Interessantemente, a 2‐O‐sulfatação também pode afetar o grau de N‐deacetilação/N-sulfatação e 6‐O‐sulfatação dos resíduos de GlcNAc sob algumas circunstâncias (Bai and Esko, 1996; Merry et al., 2001), sugerindo que as modificações a nível polimérico provavelmente ocorrem simultaneamente.

Vertebrados e invertebrados possuem somente um gene óbvio para a heparam sulfato 2-O-sulfotransferase (HS2st) (Kusche-Gullberg and Kjellen, 2003), e mutações envolvendo perda de função foram estudadas em camundongos provocando agênese renal e desenvolvimento cortical (Bullock et al., 1998). A perda do gene HS2st em C. elegans causa problemas no crescimento axonal e defeitos na migração celular (Bulow and Hobert, 2004; Kinnunen et al., 2005). O gene pipe de D. melanogaster, que apresenta similaridades com as HS2sts, está envolvido no desenvolvimento do padrão dorso/ventral (Sen et al.), mas não está envolvido na biossíntese de HS (Zhu et al., 2005).

Tabela 2: Sítios putativos de ligação a PAPS das sulfotransferases. 5’-PBS e 3’-PB representam os sítios de ligação ao fosfosulfato 5’ e 3’ respectivamente. Os resíduos de Os resíduos de aminoácidos conservados estão mostrados em negrito (Habuchi et al., 2000).

Existem ainda duas atividades que catalisam reações envolvendo a transferência de sulfato em grupos hidroxil dos respectivos resíduos de glucosamina: HS 3O‐sulfotransferase (HS3STs) e HS 6O‐sulfotransferases (HS6STs). Ao contrário dos invertebrados, ambas as famílias estão expandidas nos vertebrados, havendo seis genes codificando para a HS3ST e três codificando para a HS6ST em camundongo. Três isoformas foram inativadas em camundongo, resultando em efeitos leves, como retardamento do crescimento intrauterino (Shworak et al., 2002; HajMohammadi et al., 2003). A isoforma de HS3ST específica na modificação que introduz o domínio de ligação à antitrombina foi silenciada em camundongos, não afetando entretanto a coagulação sanguínea desses animais, provavelmente por causa da redundância destas modificações (Shworak et al., 2002; HajMohammadi et al., 2003). Enquanto vertebrados possuem pelo menos três genes codificando para a HS6st, só foi encontrado um gene em D. melanogaster e em C. elegans. Experimentos de knockdown em zebrafish demonstraram que a 6O‐sulfatação está envolvida no desenvolvimento muscular e vascular (Bink et al., 2003; Chen et al., 2005), e knockdown mediado por RNAi em D. melanogaster levaram a problemas no desenvolvimento da traquéia similares aos encontrados no mutante para o receptor de crescimento de fibroblasto (FGFR),

leva a defeitos no crescimento neuronal similares aos da perda das enzimas epimerase e HS2st (Bulow and Hobert, 2004). Existem pelo menos cinco isoformas da 3‐O‐sulfotransferase (Shworak et al., 2002). A 3‐O‐sulfatação dos resíduos de glucosamina é uma modificação importante durante a biossíntese de pelo menos dois domínios de ligação caracterizados (antitrombina e glicoproteína gD do vírus da Herpes simplex). A 3OST1 é a única isoforma capaz de produzir sequências com alta afinidade de ligação para a antitrombina por causa de sua afinidade por resíduos contendo GlcA‐GlcNS ou GlcA‐ GlcNS6S (Shworak et al., 2002). Entretanto, essa isoenzima também reage com resíduos de IdoA‐GlcNS e IdoA‐GlcN6S, se esses resíduos não possuírem 2‐O‐sulfatação (Zhang et al., 2001), sugerindo que essa modificação no terminal não redutor do resíduo‐alvo normalmente bloqueia a ação da 3OST1. A 3OST2 transfere o sulfato para unidades de GlcA2S‐GlcNS e IdoA2S‐GlcNS, enquanto 3OST3A e B transferem o sulfato para unidades de IdoA2S‐GlcNS e IdoA2S-GlcNH2 (Liu et al., 1999), gerando um seqüência com alta afinidade para a glicoproteína gD do vírus da Herpes simplex (Shukla et al., 1999).

As 3OSTs são similares as NDSTs, especialmente, nos domínios sulfotransferases C‐terminais (~50%). A especificidade das enzimas reside nessa região, mas os resíduos de aminoácidos responsáveis pelas preferências ao substrato ainda são desconhecidas (Yabe et al., 2001). Interessantemente, as 3OSTs não demonstram homologia significativa com as 6OSTs, exceto pelos domínios de ligação ao PAPS conservados (Shworak et al., 1999; Habuchi et al., 2000). Uma visão geral da biossíntese de glicosaminoglicanos encontra-se na figura 6.

Figura 6: Biossíntese de Glicosaminoglicanos: modificações poliméricas

1.3.7. Sítio de ligação ao PAPS e mecanismo de ação da STS

Um domínio strand‐loop‐helix e strand‐turn‐helix constituem o sítio de ligação ao PAPS, promovendo a maioria das interações da enzima em todas as estruturas das STs. Um loop (PSB loop) interage com o fosfato 5’ da molécula de PAP, enquanto a hélice 6 do domínio strand‐turn‐helix, paralelo ao loop PSB promove a interação com o fosfato 3’ (Figura 7). Não somente as estruturas, mas também as seqüências de aminoácidos dos domínios de ligação ao

fosfato estão conservados em todas as STS, citosólicas e de membrana. As seqüências consenso PKT/SGTTW/AL e IT/YV/I/LLRNPA/KDR/VL/AVSYY/Q para os domínios de ligação ao fosfato 5’ e 3’, respectivamente, sendo denominados 5’PSB e 3’PB (Kakuta et al., 1998).

Figura 7. Alinhamento mútiplo das sulfotransferases. 5´PSB e 3´PB representam os

domínios de ligação ao fosfato 5´‐e 3´‐, respectivamente, deduzidos da estrutura cristalográfica da sulfotransferase de estrógeno (EST). O loop PSB é mostrado em magenta e a região em

coil é representada em azul, logo após a α-hélice 11 em amarelo.

Um resíduo de lisina no 5’PSB está conservado em virtualmente todas as STs. O nitrogênio coordenado da cadeia lateral desse resíduo de serina forma uma ponte de hidrogênio com um átomo de oxigênio do fosfato 5’ nas STs ligadas ao PAP. No domínio de ligação 3’PB, um resíduo de serina fornece o hidroxil da cadeia lateral, que interage com um átomo de oxigênio do fosfato 3’. Ainda, o resíduo de lisina pode doar seu próton para o oxigênio nascente, auxiliando a dissociação do grupamento sulfato do PAPS e, após a ligação ao substrato, o resíduo de histidina remove o próton do grupo aceptor, tornando‐o um nucleófilo que ataca o átomo de enxofre da molécula de PAPS. Finalmente, o desenvolvimento de cargas negativas força a troca do nitrogênio para a serina do oxigênio nascente, e a dissociação do sulfato acontece (Figura 8).

Figura 8. O mecanismo proposto de reação para a transferência do sulfuril catalizada pelas STs. Os números dos resíduos são tomados com base na sulfotransferase de estrógeno

(hEST).

1.4. Considerações sobre a corrente hipótese sobre a biossíntese de