SUPLEMENTAÇÃO DE ENZIMAS AMILOLÍTICAS EM VACAS LEITEIRAS

De acordo com o resumo dos resultados (Tabela 7, página anterior) com a adição de enzimas amilolíticas em dietas de vacas leiteiras, independentemente da fase de lactação, produção de leite, volumoso utilizado, teor de amido da dieta e outros fatores, sugere-se que as enzimas amilolíticas não melhoram a digestibilidade aparente total da MS e a produção de leite dos

animais. Dentre 10 estudos que avaliaram enzimas amilolíticas na alimentação de vacas leiteiras, apenas no de Tricarico et al. (2005) verificou-se efeitos positivos na produção de leite dos animais.

9.1. PERSPECTIVAS

Antes do desenvolvimento e aplicação das disciplinas “-ômicas”, o único modo de identificação de espécies microbianas do rúmen era por cultura isolada. Essa técnica conseguiu identificar aproximadamente de 60 a 70 gêneros e 300 a 400 espécies de bactérias, protozoários e fungos. No entanto, isso representa menos de 10% do total de espécies microbianas que habitam o rúmen (Krause et al., 2007). A diversidade e a complexidade do ecossistema ruminal são os principais desafios em relação a determinação da funcionalidade e a prevalência de diversas carboidrases produzidas pelos microrganismos ruminais durante uma gama de variações nas condições dietéticas (Morgavi et al., 2012). Apesar do genoma de três das bactérias cultiváveis com maior atividade fibrolítica (Fibrobacter succinogenes, ruminococcus albus e ruminococcus flavefaciens) terem sido sequenciados, as estratégias enzimáticas utilizadas por cada uma dessas espécies para hidrolisar a celulose não estão elucidadas (Krause et al., 2003). Consequentemente, abordagens independentes de culturas isoladas como a metagenômica, metatranscriptoma e proteômica tem sido utilizadas para caracterizar as carboidrases produzidas no rúmen sem a necessidade de atribuir a presença das mesmas a um único microrganismo específico. Com os avanços acelerados que estão ocorrendo nas tecnologias de sequenciamento, uma figura integrada e holística do potencial metabólico e atividade do complexo ecossistema microbiano está sendo gerado.

O principal objetivo da metagenômica é de desenvolver um catálogo de todos os genes presentes no rúmen. Recentemente, hess et al. (2011) agrupou 15 genomas microbianos e mais de 27000 genes que codificam carboidrases. A metagenômica funcional visa utilizar esses catálogos ou bibliotecas para identificar e isolar enzimas hidrolíticas específicas envolvidas na digestão da parte estrutural da planta no rúmen (Zhao et al., 2010). Ferrer et al. (2005) identificou 9 endoglucanases, 12 esterases e 1 ciclodextrinase dentro de uma biblioteca metagenômica derivada do rúmen de uma vaca leiteira. O interesse atual está focado na degradação de celulose e hemicelulose por enzimas da família glicosídeo hidrolase 5 (Morgavi et al., 2012). Essa família representa as celulases mais abundantes nas bactérias ruminais, tanto as que foram cultiváveis como as não-cultiváveis (Krause et al., 2003; Ferrer et al., 2005).

A capacidade celulolítica do rúmen não limita a digestão de celulose; ao invés disso, é a área de superfície disponível para a aderência de enzimas que limita a digestão de lignocelulose no rúmen. A lignina é o polímero mais recalcitrante dentre os três principais polímeros que compõem a lignocelulose

(himmel et al., 2007; Sanchez, 2009). A formação de complexos de ferulato- polissacarídeo-lignina que entrelaçam os polímeros da parede celular é o maior fator limitante na taxa e na extensão da dissolução enzimática da parede celular uma vez que isso interfere com a hidrólise por impedir a ligação de xilanases aos seus substratos (Hatfield et al., 1999; Buanafina et al., 2008). A degradação verdadeira da lignina ocorre por um processo oxidativo realizado principalmente por fungos aeróbios. Sendo o rúmen um ambiente anaeróbico, a lignina não é verdadeiramente degradada, mas a sua solubilização é um processo chave para aumentar a quantidade de celulose e hemicelulose disponível para a fermentação microbiana. O pré-tratamento químico com ácido (himmel et al., 2007) ou soluções alcalinas objetiva aumentar a susceptibilidade da celulose a hidrólise enzimática por quebrar as ligações ésteres que ligam a lignina com a parede celular da planta (Buanafina et al., 2008).

Em usinas ou biorefinarias, os alimentos fibrosos são submetidos a estratégias como um pré-tratamento termo-químico, no qual ácido sulfúrico diluído é aplicado até 200°C, tornando a celulose mais acessível para as enzimas sacarificantes. De modo alternativo, a aplicação de álcalis por meio de processos como a expansão da fibra por amônia também aumenta a susceptibilidade da celulose a hidrólise (himmel et al., 2007). Esses pré- tratamentos podem reduzir a recalcitrância da hidrólise enzimática da celulose; no entanto, são de elevado custo, necessitam de calor ou pressurização e podem reduzir a disponibilidade de carboidratos fermentescíveis (Weimer et al., 2009).

Carboidrases tem vantagens sobre o uso de tratamentos químicos, pois estes podem ser prejudiciais a digestibilidade de outros componentes e desnaturar as enzimas associadas as plantas (Mathew & Abraham, 2004). Esterases de ácido ferúlico, produzidas por Aspergillus oryzae, realizam uma função similar a de desesterificação das ligações entre lignina e hemicelulose nas paredes celular das plantas (Tenkanen et al., 1991). Esteresases de ácido ferúlico agem sinergicamente com xilanases e pectinases por facilitar o acesso de hidrolases ao suporte dos polímeros da parede celular. Porém, a fonte o tipo de esterase de ácido ferúlico pode influenciar a quantidade de ácido ferúlico liberado e consequentemente o acesso a celulose (Faulds et al., 2006). As enzimas podem ser também modificadas de maneira química, introduzindo metais ou cofatores resultando em novas atividades catalisadoras (Qi et al., 2001). interessantemente, enzimas artificiais e catalizadores químicos estão sendo desenvolvidos e podem complementar ou substituir enzimas naturais em futuro próximo (Motherwell et al., 2001).

Recentemente, estratégias de engenharia proteica tem objetivado construir enzimas com novas ou melhoradas atividades, especificidades e estabilidades (Wen et al., 2009). A engenharia proteica tem sido largamente

utilizada na indústria de biocombustíveis para aumentar a eficiência de degradação da lignocelulose. A hidrólise enzimática esta entre os processos mais custosos na produção de biocombustíveis a partir de celulose, devido a baixa eficiência catalítica enzimática. Para atingir a mesma eficiência da produção de biocombustível a partir do milho, 40 a 100 vezes mais enzimas são necessárias para degradar a celulose (Merino & Cherry, 2007). Portanto, o desenvolvimento de enzimas que melhoram a eficiência catalítica torna-se necessário. Na tentativa de suprir essa demanda, enzimas bio-sintéticas estão sendo produzidas e testadas (Wen et al., 2009). Em outra vertente, enzimas quiméricas têm sido produzidas para aumentar a estabilidade a variações de pH e temperatura. Jermutus et al. (2001) manipularam a estrutura química de uma fitase de origem fúngica restaurando interações iônicas e pontes de hidrogênio na superfície da fitase; após essas alterações os autores descreveram melhoras na termo-estabilidade sem alteração na capacidade catalítica da enzima.

10. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Apesar de diversos experimentos terem sido realizados avaliando a suplementação de enzimas na alimentação de ruminantes, as respostas produtivas ainda são variáveis e dependentes de diversas condições tanto relacionadas às dietas como também ao estágio produtivo dos animais. A suplementação de vacas leiteiras com enzimas amilolíticas parece não afetar a eficiência de produção dos animais, ao contrário do que frequentemente é descrito quando se utiliza enzimas fibrolíticas. o desenvolvimento de enzimas com auxílio da engenharia proteica e manipulação de estrutura química pode, em um futuro próximo, aumentar a efetividade e especificidade das enzimas na nutrição de ruminantes.

11. AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem a Universidade de São Paulo e aos funcionários do Laboratório de Pesquisa em Bovinos de Leite pela infraestrutura e auxílio aos experimentos. Os autores expressam gratidão a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo pelas bolsas de pesquisas relacionadas aos experimentos com enzimas (processo: 14/13202-3; processo: 14/13607-3; e processo: 15/06108-3).

12. REFERÊNCIAS bIbLIOGRÁFICAS

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CAPÍTULO VII

MUDANÇAS PROTEOLÍTICAS EM MÚSCULO DE