Suportes para imobilização de enzimas

A utilização de um suporte adequado para a imobilização de enzimas é um fator-chave para o desenvolvimento de biocatalisadores eficientes (Bickerstaff, 1997). Embora não haja um suporte universal, existem características primordiais a serem observadas para a escolha do mesmo, tais como: área superficial, afinidade, grupos reativos, permeabilidade, insolubilidade, capacidade de regeneração e reutilização, morfologia, composição, resistência ao ataque microbiano, resistência mecânica, custos, entre outras (Lei and Bi, 2007; Mateo et al., 2007).

A escolha também deve avaliar as características do processo, como o tipo de reator utilizado (batelada, tanque agitado, coluna e fluxo pistonado), características do meio reacional (aquoso, solvente orgânico ou sistema bifásico), o sistema de reação (pasta, líquido- líquido, as condições do líquido-sólido ou sólido para sólido) e as condições do processo (pH, temperatura e pressão) (Cao et al., 2003).

A natureza física dos suportes pode variar desde materiais gelatinosos até superfícies rígidas recobertas com substâncias capazes de interagir com a enzima. Sua escolha também dependerá das características peculiares da enzima e das condições de uso da biomolécula imobilizada (Miletić et al., 2009). Assim, para alcançar uma imobilização eficiente é indispensável conhecer previamente as características da enzima, do suporte e das possíveis interações entre eles, as quais irão conferir propriedades químicas, bioquímicas, mecânicas e cinéticas específicas para o biocatalisador (Tischer and Kasche, 1999). Um suporte adequado pode aumentar o tempo de meia-vida da enzima imobilizada, porém a escolha incorreta pode afetar não só a estabilidade, mas o desempenho global do sistema (Mendes et al., 2011).

Os suportes podem ser classificados de acordo com sua composição e morfologia, como mostra a Tabela 2.

Tabela 2. Classificação dos suportes de acordo com a composição.

SUPORTES

Orgânicos Inorgânicos

Naturais Sintéticos Minerais Fabricados

Polissacarídeos Proteínas Poliestireno Areia Vidro

Celulose Colágeno Poliacrilatos Bentonita Cerâmica

Agarose Albumina Polivinilos Homeblenda Sílica

Ágar Gelatina Nylon Pedra-pome Aluminossilicato

Quitosana Seda Poliamidas Óxido de Ferro

Amido Vinil Óxido de Níquel

Policrilamidas

Os suportes podem ser ainda classificados como porosos ou não-porosos. Os suportes porosos têm grande área superficial interna disponível para a imobilização, que protege a enzima contra turbulências externas. Contudo, é importante que o diâmetro dos poros do suporte seja suficientemente grande para acomodar a enzima e permitir o acesso do substrato e a difusão dos produtos (Dalla-Vecchia et al., 2004). Já os não-porosos tem a desvantagem de não possuir grande área para a imobilização, mas diminuem o problema de transferência de massa interna (Galvão, 2004).

Nos últimos anos, além dos suportes tradicionais, as partículas magnéticas vêm ganhando destaque em várias áreas de aplicação, em especial, na imobilização de enzimas, devido à sua baixa toxicidade, boas propriedades mecânicas, estabilidade térmica, elevada área superficial, resistência a solventes orgânicos e ao ataque microbiano, e, principalmente, devido à rápida separação do meio reacional pela simples aplicação de um campo magnético externo (Tischer and Kasche, 1999). Estudos de imobilização enzimática mostraram que esse material pode ser uma alternativa capaz de manter eficientemente a atividade catalítica (Liao et al., 2010; Altun et al., 2015; Feng et al., 2016; Xie and Zang, 2016).

A magnetização surge como uma possível solução para materiais que são de difícil remoção do meio de reação (Barbosa et al., 2012). O uso de suportes com núcleo magnético diminui a necessidade de centrifugação, indesejável diluição da amostra e perda do suporte durante as lavagens, fatores que muitas vezes complicam o uso em reatores de enzimas não magnéticas (Tüzmen et al., 2012). As separações magnéticas são relativamente rápidas, fáceis e requerem aparelhagem simples. Portanto, técnicas de separação magnética têm atualmente encontrado muitas aplicações em áreas diferentes das ciências biológicas, incluindo aplicações biomédicas e ambientais (Jordan et al., 2011). Além disso, enzimas imobilizadas em partículas magnéticas vêm sendo aplicada em reatores revestidos por um campo magnético, o qual promove uma boa dispersão das enzimas no seu interior, melhorando a

transferência de massa do reator (Al-Qodah et al., 2017).

A imobilização de enzimas ou biomoléculas em partículas magnéticas normalmente é alcançada pela interação com grupos reativos da sua superfície. Grupos funcionais podem ser produzidos de diversas formas, porém geralmente envolve um revestimento da partícula magnética com um polímero ou biomacromoléculas (Neri et al. 2008). Como são muito reativas, as partículas magnéticas são facilmente oxidadas e sua estrutura pode ser alterada quando expostas ao meio reacional, resultando em perda do magnetismo. Portanto, para muitas aplicações é crucial que as partículas sejam revestidas com surfactantes, polímeros ou material inorgânico, para prevenir sua possível oxidação e aglomeração. Além disso, o material de revestimento pode fornecer grupos funcionais para ligação de outras moléculas, como enzimas e fármacos (Lu et al., 2007).

A presença de grupos hidroxila sobre a superfície da partícula magnética pode permitir a ligação de compostos funcionais. Além disso, a modificação da superfície, por exemplo, com aminopropiltrietoxisilano (APTES) ou 3-aminopropiltrimetoxisilano (APTMS), conduz a um revestimento que ajuda a estabilizar e proteger as partículas magnéticas contra a oxidação e proporciona pontos de ligações (grupos amina) para diferentes moléculas (Xu et al., 1997; Netto et al., 2009). Em geral, a modificação da superfície das partículas magnéticas é necessária para o processo de imobilização. Na Figura 6 é demonstrado um esquema da funcionalização da partícula magnética com APTMS, seguida da reticulação com glutaraldeído e imobilização da enzima.

Figura 6. Modificação da superfície das partículas magnéticas, seguido da ativação com glutaraldeído e imobilização da enzima.

Fonte: Adaptado de Tang et al. (2011).

O uso de quitosana como suporte ou material de revestimento tem demostrado bons resultados, modificando as propriedades superficiais das partículas magnéticas e melhorando a interação com as moléculas de interesse (Grenha, 2012). A quitosana possui grupos amino e hidroxila livres que permitem a ligação a uma diversidade de grupos e íons químicos, sendo utilizada em uma série de aplicações, como a adsorção de proteínas e metais, a administração de medicamentos, ressonância magnética, engenharia de tecidos e imobilização enzimática (Linlin et al., 2007; Sasaki et al., 2008; Fang et al., 2009; Liu et al., 2009; Ruge et al., 2011; Kuo et al., 2012; Xie and Wang, 2012).

A quitosana já tem demostrado bons resultados para a imobilização de enzimas, apresentando características como elevada afinidade com proteínas, alta recuperação da atividade enzimática, disponibilidade de grupos funcionais reativos para reações diretas com

enzimas, hidrofilicidade, biocompatibilidade, reduzida adsorção não específica, resistência à degradação química, propriedades antibacterianas e facilidade de preparação em diferentes formatos físicos (Lei and Bi, 2007; Adriano et al., 2008). Além disso, a quitosana apresenta um custo relativamente baixo, já que é derivado da quitina, o segundo polímero natural mais abundante depois da celulose (Krajewska, 2004; Biró et al., 2008).

A imobilização de enzimas em suporte de quitosana é facilmente realizada utilizando um reagente bifuncional, como o glutaraldeído, uma vez que os seus grupos funcionais (-CHO) reagem simultaneamente com os sítios de ligação da quitosana (-NH2) e o grupo

amino da enzima (Figura 7) (Krajewska, 2004). Além disso, pectinases imobilizada em quitosana exibem uma maior resistência ao tratamento térmico e a diferentes pHs (Lei and Bi, 2007).

Figura 7. Possível mecanismo de imobilização de enzimas na partícula de quitosana revestida.

Fonte: Lei e Bi (2007).

A agarose é outro polissacarídeo natural que vem se destacando como suporte na imobilização de enzimas. Geralmente extraída de algumas algas vermelhas pertencentes à classe Rhodophyceae, a agarose é um dos principais componentes do ágar, composta por unidades repetitivas de agarobiose, que é um dissacarídeo composto de β-D-galactose e 3,6- anidro-α-L-galactose, ligados por ligações glicosídicas β (1–4) (Zucca et al., 2016).

As esferas à base de agarose são altamente porosas, resistentes mecanicamente, quimicamente e fisicamente inertes, e hidrofílicas, tornando-as particularmente adequadas

para imobilização enzimática, através de uma ampla gama de métodos de modificação química das hidroxilas do polímero (Zucca et al., 2016). Além disso, as características das esferas de agarose podem ser moduladas por reticulação covalente, conferindo elevada resistência física, química, mecânica e térmica, sendo encontrada em uma grande variedade de tamanhos e de diâmetro de poros (Mateo et al., 2006; Zucca et al., 2016).

O caráter hidrofílico da agarose é responsável por sua reatividade, onde suas hidroxilas podem ser ativadas com uma grande variedade de reagentes. Dessa maneira, vários grupamentos químicos podem ser adicionados ao longo das cadeias poliméricas, como amina, carboxil, sulfonato, ciano, diclorotriazinil, entre outros (Zucca et al., 2016). A preparação do suporte glioxil-agarose tem sido descrito como uma ferramenta muito adequada para obter uma ligação covalente multipontual entre enzima e suporte (Mateo et al., 2006). O suporte é preparado por eterificação dos grupos hidroxilas do suporte com glicidol, que são posteriormente oxidados com periodato de sódio para obter o grupo glioxil (López-Gallego et al., 2013).

A partir desse suporte, é possível introduzir grupos aminos na superfície do mesmo, por meio da incubação em uma solução concentrada de etilenodiamina, preparando o suporte MANAE, o qual pode ser facilmente ativado com glutaraldeído. Para a ligação covalente de enzimas em MANAE, é possível usar suportes pré-ativados ou adicionar glutaraldeído após troca iônica da enzima no MANAE (López-Gallego et al., 2005).

Além disso, a agarose ativada com grupos vinilsulfona também revela boas propriedade para obter uma intensa ligação covalente multipontual (dos Santos et al., 2015a). Este grupo reage com diferentes aminoácidos das proteínas, como histidina, lisina, cisteína, tirosina, entre outros, e sua reatividade é alta em pH alcalino. Uma das principais características desse suporte é o braço espaçador relativamente grande, que reduz a rigidez induzida pela ligação covalente (dos Santos et al., 2015a; dos Santos et al., 2015b).

Dessa forma, a partir dos diferentes métodos de ativação da agarose é possível direcionar a imobilização enzimática pela área mais rica em grupos reativos da proteína (Zucca et al., 2016).