Diversas metodologias “in vitro” foram desenvolvidas com o intuito de predizer a digestibilidade dos alimentos em ruminantes, sendo que a metodologia de dois estágios de Tilley e Terry (1963) ainda é utilizada nos dias de hoje com algumas modificações, por ser uma técnica com relativo baixo custo, boa precisão nos resultados e eficiente para ser utilizada em ensaios de digestibilidade que envolvem grande número de amostras.
A técnica de Tilley e Terry (1963) simula os dois estágios da digestão que ocorre em ruminantes. Em um primeiro momento, as amostras são submetidas a um período de fermentação de 48 horas com líquido ruminal e saliva artificial (McDougall, 1948) e posteriormente mais 24 horas de digestão com ácido clorídrico e pepsina, simulando a ação gástrica do abomaso.
A técnica in vitro semi-automática de produção de gases (Maurício et al., 1999) é um sistema desenvolvido a partir de adaptações feitas à técnica manual de produção de gases desenvolvida por Theodorou et al. (1994). A técnica semi-automática utiliza equações de regressão entre a pressão interna dos frascos e o volume de gases produzidos por um substrato, para estimar o volume através da pressão obtida pelo transdutor. Estas, quando adaptadas, tornaram a técnica mais precisa e mais rápida (Maurício et al., 2003) para a avaliação nutricional dos alimentos.
Segundo Mauricio et al., (1999) a técnica é capaz de fornecer dados não apenas da taxa e extensão da degradação, mas também da eficiência da fermentação e da cinética de fermentação. A técnica in vitro semi-automática de produção de gases pode auxiliar na seleção de genótipos superiores, comparação de substratos com diferentes quantidades de carboidratos solúveis (Noguera et al., 2004), além de avaliar princípios anti- nutricionais (Khazall et al., 1994). Diversos fatores podem afetar a eficiência da técnica de produção de gases, como a preparação da amostra, a qualidade do fluido ruminal, a temperatura e a pressão e o potencial de hidrogênio.
A preparação da amostra envolve um serie de fatores que devem ser considerados. A padronização do tamanho da partícula é de extrema importância. A moagem em um tamanho de partícula menor eleva a superfície de contato entre o microrganismo e o substrato, favorecendo a degradação microbiana. A maioria dos trabalhos envolvendo a técnica de produção de gases recomenda que o substrato seja moído em peneira de 1 mm (Menke et al., 1979; Pell e Schofiel, 1993; Theodorou et al., 1994; Mauricio et al., 1999). A temperatura de secagem da amostra pode causar grande influência na avaliação do alimento. Temperaturas de secagem muito altas podem levar a complexação de aminoácidos (principalmente a lisina) com açúcares redutores (reação de Mailard) diminuindo a solubilidade da fração nitrogenada e, consequentemente, a sua disponibilidade para os microorganismos do meio, subestimando a degradabilidade real do alimento testado.
O líquido ruminal contém os microorganismos (bactérias, protozoários e fungos) que serão responsáveis pela degradação do substrato, portanto deve-se tomar o máximo de cuidado para preserva-los no intervalo entre a retirada do inoculo do rúmen até a inoculação durante o experimento. A composição do líquido ruminal pode variar dependendo do dia, da hora, do tipo de animal e da dieta recebida pelo doador (Schofield, 2000). Segundo Williams (2000) os microrganismos presentes no líquido ruminal após 24 horas de coleta são menos ativos do que aqueles coletados duas horas após a refeição. Menke e Steingass (1988) recomendam que o líquido ruminal seja
coletado antes da refeição do animal. Esta metodologia tem sido adotada por vários autores (Blummel e Orskov, 1993; Pell e Schofield, 1993; Theodorou et al., 1994). A proporção de diluição do líquido ruminal com a solução tampão antes do inoculação também pode afetar a resposta de produção de gases. Segundo Tilley-Terry (1963), meios de cultura contendo de 20% a 25% de líquido ruminal apresentam os melhores resultados. Pell e e Schofield, (1993) pesquisaram o efeito da proporção líquido ruminal/meio e recomendaram a proporção de 20% de liquido ruminal. Hidayat et al., (1993) incubando diferentes forrageiras encontraram aumentos nas taxas de produção de gases em resposta ao incremento da densidade bacteriana.
De acordo com Mould et al. (2005), diferenças na composição da solução tampão (proporção fosfato:bicarbonato) e na proporção dos produtos finais oriundos da fermentação podem afetar a produção de gases, reduzindo assim a acurácia na determinação da cinética de degradação dos alimentos.
A fermentação dos alimentos no rúmen tem como função principal produzir ácidos graxos voláteis (AGV), que são a fonte energética para os ruminantes, e servir como substrato para a microbiota ruminal. A técnica de produção de gases mede apenas a quantidade de substrato utilizada para a produção de AGV e outros gases, não levando em consideração a quantidade de substrato utilizado no crescimento microbiano (Getachew et al., 2004). Para Fondevila e Barrios (2001), o volume de gases depende da quantidade e proporções de AGV produzidos, sendo esses parâmetros inversamente relacionados com a síntese microbiana.
A energia necessária para promover o crescimento dos microorganismos ruminais é originada principalmente da fermentação dos carboidratos, gerando acetato, propionato e butirato (Wolin, 1975). As técnicas in vitro de produção de gases medem os gases gerados pela forma direta na fermentação das pentoses e hexoses e de forma indireta na neutralização dos ácidos graxos voláteis pelo tampão bicarbonato presente no líquido ruminal ou saliva artificial (Getachew et al., 1998). As reações estequiométricas da fermentação das hexoses foram descritas por Hungate (1996):
1 mol Hexose + 2 H2O → 2 Acetato + 2 CO2 + 4 H2
1 mol Hexose + 2 H2→ 2 Propionato + 2 H2O
1 mol Hexose → 1 Butirato + CO2 + H2
CO2 + 4 H2→ CH4 + 2 H2
Uma das principais limitações da técnica, é que ela se baseia apenas na produção de gases pelo inoculo a partir dos alimentos incubados. Assim, substratos que permitem um maior crescimento microbiano no rúmen, terão produções de gases menores do que aqueles que apenas geram manutenção da população microbiana. Dessa forma,
Blümmel et al. (1997) afirmaram que há uma relação inversa entre a produção de gases e a produção de microorganismos.
Outro fator importante está relacionado ao tipo de fermentação do material incubado. Alimentos que favorecem maior produção de acetato em relação ao propionato tendem a apresentar uma maior produção de gases, devido ao fato da via de produção de acetato levar a produção de metano, enquanto a de propionato não. Porém, alimentos que geram uma maior produção de propionato, mesmo apresentando uma menor produção de gases
in vitro, possuem maior valor nutricional para os animais, já que ele é melhor utilizado
em relação ao acetato.
Assim, para uma correta interpretação dos resultados é fundamental o ajuste dos dados ao modelo utilizado para descrever a cinética da fermentação ruminal (Fondevilla e Barrios, 2001), sendo que diferentes modelos matemáticos não lineares, exponenciais ou sigmoides, uni ou multi-compartimentais têm sido propostos para estimar os parâmetros de degradação por meio das curvas de produção de gases, todos apresentando vantagens e desvantagens de ajuste dependendo das condições experimentais e do tipo de substrato avaliado (Noguera et al., 2004). A escolha do modelo depende do ajuste obtido às características do alimento avaliado, o que varia entre diferentes forrageiras, concentrados e subprodutos (López et al., 2011; Sahin et al., 2011).
A cinética da produção cumulativa de gases pode ser descrita empregando-se o modelo matemático unicompartimental de France et al. (1993):
Y = A x {1 – exp [ – b * (t – L) – c x (√ t – √ L)]
em que,
Y = produção acumulativa de gases (ml);
A = máxima produção acumulada de gases (ml); L = é a tempo de colonização (h);
b (h-1) e c (h-0,5) = taxas fracionais constantes; t = tempo (h).
A taxa fracional média (h-1) de produção de gases (μ) foi calculada como:
μ = b + c 2√t em que,
μ = taxa de produção de gases (h-1); sendo os demais termos definidos anteriormente.