TÉCNICAS GERAIS

3.4.1 Transformação de Bactérias Quimiocompetentes

As transformações de bactérias com plasmídeos foram realizadas utilizando-se bactérias E. coli da linhagem TOP10 quimiocompetentes (em glicerol a 10% (v/v), CaCl2 a 100 mM e HEPES a 10 mM) por meio de choque térmico (SAMBROOK;

RUSSELL, 2001). No momento da transformação, uma alíquota de 100 μL de bactérias competentes (armazenada a -80ºC) foi descongelada em banho de gelo. O plasmídeo de interesse foi adicionado à suspensão bacteriana e misturado gentilmente com auxílio de uma ponteira. Essa mistura foi mantida por 30 min em banho de gelo, seguidos por 45 s a 42ºC e 1-2 min em banho de gelo. Após o choque térmico, foram adicionados 500 μL de meio SOC e a mistura foi mantida por 1 h a 37ºC sob agitação orbital a 200 rpm (New Brunswick Scientific, modelo Innova 4080), para recuperação celular. Alíquotas das células transformadas foram inoculadas em placas com meio LB ágar contendo 100 μg/mL de ampicilina, e as placas foram incubadas a 37ºC por aproximadamente 16 h. Após este período, 15 a 30 colônias isoladas, selecionadas aleatoriamente, foram transferidas com auxílio de palitos de dente estéreis para uma nova placa com meio LB ágar contendo ampicilina, onde cada clone bacteriano foi identificado com um número. Esta placa foi incubada a 37ºC por aproximadamente 16 h e então armazenada a 4ºC.

3.4.2 Seleção de Clones Bacterianos

A seleção dos clones bacterianos que potencialmente contêm o plasmídeo recombinante (plasmídeo contendo o inserto de interesse) foi realizada pela técnica de palitagem (BARNES, 1977) ou pela técnica de PCR de colônia.

3.4.2.1 Técnica de Palitagem

As colônias bacterianas a serem triadas foram transferidas para microtubos com auxílio de palitos de dente estéreis. A cada tubo foram adicionados 20 μL de solução de lise bacteriana, seguida por aquecimento a 65ºC durante 10 min. Estas amostras, bem como o plasmídeo nativo sem inserto (utilizado como controle), foram submetidas a eletroforese em gel de agarose a 0,8% corado com brometo de etídio (0,2 μg/mL). As prováveis colônias contendo o plasmídeo recombinante foram assim identificadas pela diferença de tamanho molecular quando comparadas com o controle.

3.4.2.2 PCR de Colônia

As colônias a serem triadas foram transferidas com auxílio de palitos de dente estéreis a microtubos contendo 15 μL de água ultrapura. Como controle positivo, foi adicionado o vetor utilizado na ligação, e como controle negativo, água ultrapura. Os tubos foram aquecidos a 98ºC por 10 min e, em seguida, centrifugados por 1 min a 12.000 xg. 1 μL do sobrenadante de cada tubo foi transferido a um microtubo de 200 μL contendo 1,5 μL de tampão comercial para reação de PCR (Invitrogen); 1,2 μL de dNTPs a 2,5 mM; 0,45 μL de MgCl2 a 50 mM; 0,075 μL de Taq DNA polimerase (5 U/μL – IBMP); 1,5 μL dos oligonucleotídeos apropriados (a 5 pmol/μL) e água ultrapura para volume final de 15 μL. Os tubos foram submetidos a 1 ciclo de 95ºC por 3 min e a 30 ciclos de 95ºC por 30 s, 50ºC por 30 s e 72ºC por 2 min e 30 s. Para visualização, 10 μL dos produtos da PCR foram submetidos a eletroforese em gel de agarose a 0,8% corado com brometo de etídio. Os clones bacterianos contendo o plasmídeo recombinante foram detectados por amplificação positiva de um fragmento de DNA de tamanho esperado.

3.4.3 Estocagem e Purificação de Plasmídeos

Uma vez selecionados os clones bacterianos que possivelmente contêm o plasmídeo recombinante, estes foram inoculados em 5 mL de meio LB contendo 100 μg/mL de ampicilina. Após crescimento por aproximadamente 16 h a 37ºC sob agitação (200 rpm), 2 mL da suspensão bacteriana foram armazenados a -80ºC em glicerol 25% (v/v). O volume restante foi utilizado para purificação do DNA plasmidial, utilizando-se o kit Wizard^® Plus Minipreps DNA Purification System (Promega), seguindo as instruções do fabricante.

Quando necessária maior quantidade de DNA plasmidial, 10 mL de suspensão bacteriana foram adicionados a 100 mL de meio LB contendo 100 μg/mL de ampicilina e incubados por 16 h a 37ºC sob agitação. O DNA plasmidial foi então purificado utilizando-se o kit Wizard^® Plus Midipreps DNA Purification System (Promega), seguindo as instruções do fabricante.

3.4.4 Análise de Proteínas por Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE) e Western blot

A análise da expressão de proteínas por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) foi realizada sob condições desnaturantes (LAEMMLI, 1970), utilizando o sistema Electrophoresis cell (BioAmerica, modelo D7C2-24DNBA). As amostras foram misturadas com tampão de amostra 4X, na proporção de três partes de amostra para uma parte de tampão, aquecidas por 3 min a 95ºC, aplicadas em gel de poliacrilamida a 13% e submetidas à eletroforese com corrente elétrica de 100 V, durante aproximadamente 2 h. As bandas proteicas foram visualizadas por coloração do gel com solução de azul de Coomassie, seguida de descoloração com solução de descoloração de geis. A massa molecular aparente da proteína foi estimada utilizando-se padrões de massa molecular conhecidos (WEBER; OSBORN, 1969), na faixa de 10 a 220 kDa (BenchMark^TM Protein Ladder, Invitrogen) ou 10 a 260 kDa (Spectra^TM Multicolor Broad Range Protein Ladder, Thermo Scientific).

Para análise por western blot, as proteínas submetidas a SDS-PAGE foram transferidas para membrana de nitrocelulose (Hybond C, Amersham Biosciences), utilizando-se uma corrente elétrica de 100 V por 1 h a 4ºC. Após a transferência, as bandas proteicas foram visualizadas por coloração da membrana com solução de Ponceau. Em seguida, a membrana foi descorada utilizando-se água deionizada e incubada com TBS contendo 5% (m/v) de leite desnatado (Molico^®, Nestlé), para bloqueio dos sítios inespecíficos. Após três lavagens (5 min cada, sob agitação) com TBS, a membrana foi incubada com anticorpos específicos para a proteína analisada, seguido por um anticorpo secundário conjugado com fosfatase alcalina diluído em TBS contendo 5% de leite desnatado. Todas as etapas de incubação foram realizadas por 1 h a temperatura ambiente, sob agitação. Entre cada etapa, foram realizadas três lavagens com TBS. A reação foi revelada com NBT (nitroblue tetrazolium) e BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate) (Promega) em tampão de fosfatase alcalina, seguindo as instruções do fabricante. A revelação foi interrompida por lavagem da membrana com água corrente.

3.4.5 Criopreservação de Linhagens Celulares

As células geradas neste trabalho foram regulamente estocadas em nitrogênio líquido para criopreservação, sendo congeladas em múltiplos criotubos, em diferentes dias e com diferentes alíquotas do meio de congelamento.

Para o congelamento, quando a cultura celular atingiu a concentração desejada, as células foram centrifugadas por 10 min a 400 xg e, então, recuperadas em meio de congelamento (90% SBF e 10% DMSO) em volume suficiente para obter-se uma concentração de 2 x 10⁶ a 1 x 10⁷ células/mL. As células foram distribuídas em criotubos (1 mL por criotubo), mantidas por 2-3 h a -20ºC, seguido por 4-16 h a -80ºC e, após, transferidas para nitrogênio líquido.

Cada lote de células congeladas foi verificado pelo descongelamento de um criotubo. Para o descongelamento, o criotubo foi retirado do nitrogênio líquido e imediatamente aquecido a 37ºC até que a suspensão celular descongelasse. O volume total do criotubo foi diluído em 10 mL de meio de cultura e centrifugado por 10 min a 400 xg. Ao precipitado celular, foram adicionados 10 mL de meio de cultura e

as células foram transferidas para uma garrafa de 25 cm² e mantidas a 37ºC em atmosfera com 5% de CO2 (LAFON, 1996).

3.4.6 Imunofluorescência Indireta

Para a realização de imunofluorescência indireta (IFI), células de interesse foram cultivadas em placas de 96 poços e, então, fixadas e permeabilizadas com metanol:acetona (1:1) por no mínimo 20 min a -20ºC. No momento de sua utilização, o metanol:acetona foi descartado e as placas foram secas a temperatura ambiente.

As células foram incubadas com o anticorpo primário de interesse (100 μL/poço) durante 30 min a 37ºC, seguido de anticorpo secundário conjugado com um fluoróforo diluído em PBS contendo 0,2 μg/μL de azul de Evans (50 μL/poço, 1 h a 37ºC ao abrigo da luz). Os núcleos celulares foram corados com 300 nM de 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) por 5 min a 37ºC ao abrigo da luz. Entre cada etapa, foram realizadas três lavagens com PBS. Por fim, os focos fluorescentes foram observados em microscópio de fluorescência (Nikon, modelo Eclipse TE300). Quando as imagens foram fotografadas, foi utilizado um microscópio Leica AF6000 Modular System.

3.5 PADRONIZAÇÃO DE ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO PARA DIAGNÓSTICO