VÍRUS CHIKUNGUNYA

Inicialmente, foram produzidas as proteínas de envelope E1 e E2 de CHIKV em células de D. melanogaster. Essas proteínas foram selecionadas por serem as proteínas mais imunogênicas do vírus. Durante uma infecção por alfavírus, anticorpos neutralizantes são direcionados principalmente para a E2 e em menor extensão para a E1 (HUNT et al., 2010; STRAUSS et al., 1991; VRATI et al., 1988). Uma vez que o vírus ainda não circulava no Brasil no momento em que este trabalho foi iniciado, optou-se por desenhar os genes a partir da sequência consenso entre as sequências completas do genoma disponíveis no GenBank. Quanto ao sistema de expressão, como essas proteínas são glicosiladas, a expressão foi realizada em células de D.

melanogaster, pois possibilita a obtenção de proteínas com glicosilação semelhante à produzida por células de mamíferos, importante para a obtenção das proteínas mais próximas à sua forma nativa (BROOKS, 2004).

Vários trabalhos têm descrito a expressão de proteínas de CHIKV em sistema de baculovírus (CHO et al., 2008a, 2008b; KUMAR et al., 2014; KUO et al., 2011;

METZ et al., 2011). Esse sistema, no entanto, não possibilita um bioprocessamento contínuo, pois a proteína de interesse é obtida somente após a lise da célula infectada.

A utilização de células S2, por outro lado, permite a obtenção de um sistema de expressão contínuo e, consequentemente, de níveis mais altos de expressão (DESPRES; PAULOUS; CRUBLET, 2013).

Nesse trabalho, as proteínas E1 e E2 de CHIKV foram expressas e purificadas com sucesso. A proteína rE1-CHIKV, no entanto, foi obtida em pequena quantidade, sendo detectada apenas por western blot utilizando anticorpo anti-V5. Já a rE2-CHIKV foi obtida de forma relativamente pura e em maior quantidade. Uma vez que a proteína

E2 é a responsável pela ligação a receptores na célula hospedeira e é o principal alvo de anticorpos neutralizantes (GRIFFIN, 2013), optou-se por continuar o trabalho com esta proteína. Além disso, Cho et al. (2008) demonstraram que testes para diagnóstico sorológico de Chikungunya utilizando uma proteína E2 recombinante produzida em sistema de baculovírus apresenta maior sensibilidade que testes utilizando a proteína E1 produzida da mesma maneira.

Recentemente, foi verificado que a fusão da proteína de interesse à proteína SNAP, uma mutante da enzima de reparo de DNA O⁶ -alquilguanina-DNA-alquiltransferase (AGT), aumenta em pelo menos 50 vezes o rendimento proteico, além de aumentar a estabilidade da proteína produzida por células S2. No caso da proteína E2 de CHIKV, por exemplo, com esta estratégia, foram gerados lotes de proteína com concentração de aproximadamente 600 a 1200 μg/mL (DESPRES;

PAULOUS; CRUBLET, 2013). Nesse trabalho, foram obtidos aproximadamente 12,5 μg/mL, o que indica que essa é uma ótima estratégia para trabalhos futuros.

Além das proteínas recombinantes, foram produzidos três hibridomas secretores de AcM contra a rE2-CHIKV. Esses AcM, denominados 1G1, 3A12 e 12A6, foram caracterizados por ELISA, IFI e western blot contra a proteína rE2-CHIKV, reconhecendo essa proteína em todos os ensaios realizados. Nenhum AcM reagiu com a proteína rE1-CHIKV, nem com o MOCK (dados não mostrados).

Os AcM produzidos podem ter outras aplicações além de serem utilizados em teste imunoenzimático para detecção de anticorpos anti-CHIKV, que é o foco deste trabalho. Podem ser utilizados em pesquisa e testes diagnósticos para a detecção do vírus, por meio de ELISA de captura de antígeno, imunofluorescência, citometria de fluxo, immunoblot, teste imunocromatográfico e imunohistoquímica. Kumar, Sudeep e Arankalle (2012) e Bréhin et al. (2008) demonstraram a aplicabilidade de AcM anti-E2 em alguns desses testes. Okabayashi et al. (2014) desenvolveram um teste imunocromatográfico para a detecção de CHIKV utilizando AcM anti-E1, obtendo valores de sensibilidade e especificidade próximos a 90% quando comparados com RT-PCR. Um ensaio semelhante poderia ser desenvolvido utilizando os AcM anti-rE2-CHIKV produzidos neste trabalho.

Para a utilização nesses ensaios, é importante que os AcM sejam específicos para o CHIKV. Foi demonstrado que os AcM 1G1, 3A12 e 12A6 não apresentam reatividade cruzada com o alfavírus VEEV, nem com os flavivírus DENV sorotipos 1 a 4, SLEV e WNV. Além disso, foi demonstrado por ELISA indireto que a rE2-CHIKV,

proteína contra a qual os AcM foram produzidos, é reconhecida por anticorpos anti-CHIKV presentes no soro de pacientes infectados, o que sugere que a rE2-anti-CHIKV tem uma conformação próxima à E2 nativa. Juntos, esses resultados sugerem a especificidade dos AcM para o CHIKV, mas isso só poderá ser confirmado quando os AcM forem testados contra o vírus nativo.

Os AcM podem ser usados ainda em ensaios de imunoprecipitação de proteínas virais, de agregados proteicos ou de partículas virais. Técnicas de imunoprecipitação têm sido utilizadas na determinação de interações entre diferentes proteínas virais (ROMAN-SOSA; KIELIAN, 2011) e entre proteínas virais e do hospedeiro (WINTACHAI et al., 2012). Assim, os AcM podem ser úteis em estudos sobre o ciclo de replicação e mecanismos da patogenicidade viral (MASRINOUL et al., 2014).

AcM também têm sido utilizados para a identificação de determinantes antigênicos virais, inclusive no mapeamento de epítopos envolvidos na reatividade cruzada entre diferentes vírus da mesma família (BLACKBURN; BESSELAAR;

GIBSON, 1995; CHUA; CHAN; SAM, 2014; STRAUSS et al., 1991). Nos últimos anos, com a grande expansão do CHIKV pelo mundo, também tem sido estudada a utilização de AcM anti-CHIKV neutralizantes como ferramentas terapêuticas (GOH et al., 2013; SELVARAJAH et al., 2013; WARTER et al., 2011).

Nesse trabalho, os AcM anti-rE2-CHIKV não foram utilizados no ELISA para detecção de IgM anti-CHIKV, devido ao formato do ELISA padronizado. O AcM 12A6 foi conjugado com peroxidase e utilizado em um ELISA de captura de IgM, mas apresentou extensa reatividade inespecífica (dados não mostrados). Novas conjugações deste e dos demais AcM serão realizadas, para a posterior padronização de um MAC-ELISA. Talvez a alteração do formato do ELISA melhore a sensibilidade do teste, conforme será discutido mais adiante.

Com a crescente emergência do CHIKV desde 2004, diversos sistemas de ELISA têm sido desenvolvidos. Mas muitos deles se baseiam no uso da partícula viral ou das proteínas virais nativas. O teste que hoje é utilizado pelos laboratórios de referência para diagnóstico de CHIKV no Brasil utiliza o vírus produzido em cérebro de camundongos neonatos extraído pelo método de sacarose-acetona (BRASIL, 2014f). Além de todas as impurezas inerentes desse método, essa técnica é incoerente com o preceito ético segundo o qual cada vez mais tem se reduzido o uso de animais de laboratório quando existem alternativas. Entretanto, embora o CHIKV

infecte de forma produtiva e em altos títulos diferentes linhagens celulares em cultura, há a recomendação de que estas infecções sejam realizadas em laboratórios NB3 (BRASIL, 2010). Além disso, Khan et al. (2014) demonstraram que a proteína E2 ou uma mistura de E2 e E1 recombinantes apresenta resultado comparável ao vírus nativo produzido e purificado a partir de cultivo celular quando utilizadas em testes do tipo ELISA indireto e MAC-ELISA para detecção de IgM anti-CHIKV em soros de pacientes. Valores de sensibilidade mais baixos foram obtidos utilizando-se apenas a E1 recombinante.

Nos últimos anos, vários trabalhos têm descrito a produção das proteínas E1, E2 e C de CHIKV em E. coli e em sistemas de expressão em células de inseto e sua utilização em testes para diagnóstico de infecções por CHIKV (BHATNAGAR et al., 2014; CHO et al., 2008a, 2008b; KUMAR et al., 2014; PRIYA et al., 2014; TRIPATHI;

PRIYA; SHRIVASTAVA, 2014; YATHI et al., 2011). No presente trabalho, a proteína E2 produzida em células S2 de D. melanogaster foi utilizada em um ELISA indireto para detecção de IgM anti-CHIKV em soro de pacientes. Os resultados com essa proteína foram comparados com a proteína CHIK.sE2-SNAP, que tem sido utilizada em ensaios do tipo MAC-ELISA no Instituto Pasteur de Paris.

No ELISA indireto utilizando a rE2-CHIKV foram obtidas seis amostras falso-negativas, enquanto com a CHIK.sE2-SNAP foram obtidas cinco. Essa diferença provavelmente é devido à maior absorbância obtida com a CHIK.sE2-SNAP, uma vez que entre as seis amostras falso-negativas no ensaio com a rE2-CHIKV, cinco também foram falso-negativas com a CHIK.sE2-SNAP e a amostra discordante está bem próxima ao valor de corte. Esses valores mais altos de absorbância podem ser devido à utilização de cerca de oito vezes mais proteína CHIK.sE2-SNAP no teste que rE2-CHIKV. Quando foi aumentada a concentração de rE2-CHIKV no ELISA, no entanto, foram obtidos valores mais altos de absorbância não apenas com a rE2-CHIKV, mas também com o MOCK. A CHIK.sE2-SNAP foi purificada por cromatografia de afinidade seguida por gel filtração, enquanto a rE2-CHIKV foi apenas purificada por cromatografia de afinidade. É possível que a composição do tampão da proteína também possa ter levado a essa diferença de absorbância. Está sendo testada uma segunda purificação para a rE2-CHIKV, na tentativa de melhorar esses resultados.

Foi analisada a reatividade cruzada da rE2-CHIKV com amostras de soro de pacientes com infecção aguda por DENV e com outras infecções agudas (EBV, CMV, VDRL-positivo e toxoplasmose). Não foi verificada reação cruzada com as amostras

de infecção por DENV testadas. Isso é um ótimo resultado, uma vez que o DENV e o CHIKV cocirculam no Brasil, há grande semelhança entre os sintomas causados por esses vírus, além de ambos os vírus possuírem reatividade antigênica cruzada (CAVRINI et al., 2009). Houve reação cruzada com uma amostra de toxoplasmose e uma de infecção por EBV. No teste comercial Chikungunya IgM micro-capture ELISA (IBL International, Hamburg, Germany) é especificado que pode haver reatividade cruzada com anticorpos contra Toxoplasma, Borrelia e CMV e que a estimulação policlonal de linfócitos B em uma infecção por EBV pode levar à detecção inespecífica de anticorpos da classe IgM. Ressalta-se que, nesta validação inicial, o valor de corte foi calculado utilizando-se apenas dez soros sabidamente negativos, para que os resultados pudessem ser comparados aos resultados utilizando a CHIK.sE2-SNAP.

Em uma etapa posterior, o valor de corte deverá ser novamente calculado utilizando-se um painel com mais amostras de indivíduos saudáveis.

Os testes comerciais disponíveis para detecção de IgM anti-CHIKV apresentam variados valores de sensibilidade e especificidade. Prat et al. (2014) avaliaram quatro testes para diagnóstico sorológico de CHIKV: dois testes imunocromatográficos e dois em formato de ELISA. Nas análises feitas por esses autores, um dos testes imunocromatográficos apresentou sensibilidade de 30% e especificidade de 73%, enquanto o outro apresentou especificidade de 93%, mas sensibilidade de 20%. Já os ensaios no formato ELISA apresentaram sensibilidade de 79% e 85% e especificidade de 88% e 82%, respectivamente. Ao se acessar a bula de um dos testes imunocromatográficos e de um ELISA, os valores de sensibilidade e especificidade explicitados são >90%, o que indica que esses valores são altamente dependentes do painel de soros utilizado na validação do teste e que há uma necessidade de se desenvolver testes diagnósticos melhor validados.

O ELISA padronizado neste trabalho apresentou sensibilidade de 70% e especificidade de 97%. Em relação à especificidade, a proteína rE2-CHIKV mostrou-se uma ferramenta promissora como insumo para diagnóstico. A baixa mostrou-sensibilidade, no entanto, indica que há necessidade de uma melhor padronização da técnica. É possível que a alteração do formato do ensaio para MAC-ELISA aumente essa sensibilidade. Um problema no ELISA desenvolvido é que, apesar de ter sido traçada uma linha corte com base nos resultados dos soros sabidamente negativos, a diferença entre as absorbâncias das amostras positivas e as absorbâncias das amostras negativas e falso-negativas não é muito nítida, com várias amostras

positivas próximas à linha de corte. Esse tipo de resultado, no entanto, também foi obtido por outros autores: Yathi et al. (2011), ao utilizar um fragmento de 11 kDa da E1, e CHO et al. (2008a), ao utilizar as proteínas E1 e E2 recombinantes, ambos em ELISA indireto para detecção de IgM; e Kumar et al. (2014), ao utilizar a proteína E1 recombinante em um ELISA de captura de IgG.