Tamanho das nanopartículas

Nesta seção será apresentada o processo de caracterização do diâmetro das nanopartículas pelas técnicas de Espectroscopia do UV-Vis, Microscopia Eletrônica de Transmissão e Espalhamento Dinâmico de Luz. As nanopartículas foram sintetizadas sempre considerando as condições otimizadas. Depois da síntese e esperado o tempo de estabilização, elas foram neutralizadas para pH entre 7,0-8,0. A determinação do tamanho das nanopartículas é essencial para identificar possíveis propriedades e possibilidades de aplicação.

A Figura 24 mostra as imagens geradas pela MET. Pode-se observar a tendência da formação de nanopartículas esféricas e de tamanho relativamente uniforme. A Figura 25 apresenta a distribuição da frequência do tamanho das nanopartículas geradas a partir das imagens de MET. Nesses gráficos foram adicionadas curvas Gaussianas para mostrar a tendência da distribuição normal do tamanho das nanopartículas. O que se observa é uma diminuição do tamanho médio das nanopartículas quando alterado o pH para regiões mais ácidas, especialmente

57 para AgSEAR. O processo de acidificação do meio leva a protonação dos grupos carboxílicos que podem deixar a superfície da nanopartícula. Com essa saída do agente estabilizantes, as nanopartículas ficam mais expostas ao meio ácido que pode fazer com que os átomos de prata sofram oxidação do meio.

Figura 24 – Imagens das dispersões de nanopartículas obtidas por MET. (a) AgSAR m eio básico; (b) AgSAR m eio neutro; (c) AgSEAR m eio básico; (d) AgSEAR m eio

neutro.

(a) (b)

(c) (d)

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Figura 25 – Distribuição da frequência relat iva dos tamanhos das nanopartículas obtidas por MET.

(a) (b)

(c) (d)

Fonte: Autor (2019)

A Tabela 6 mostra valores da determinação do tamanho médio das nanopartículas por diferentes métodos. Observa-se que as dispersões apresentam valores de comprimento de onda que se alteram com pH, porém a tendência é o contrário do observado na MET, pois quanto maior o comprimento de onda maior deveria ser o tamanho da nanopartícula. Devido ao desvio-padrão os tamanhos indicados pelo MET são estatisticamente semelhantes o que pode explicar os valores próximos de comprimento de onda. Destaca-se também que o efeito de RPS não é decorrente apenas do tamanho da nanopartícula, mas também da constante dielétrica do meio que está inserido. Essa alteração do RPS pode decorrer também devido ao meio reacional e da carga elétrica do tensoativo.

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Tabela 6 – Tamanhos das nanopartículas nas dispersões em meio básico e neutro.

Dispersão pH Comprimento de onda com Absorbância Máxima (nm)

Diâmetro da nanopartícula (nm) MET Tamanho médio Z

AgSAR_B 12,3 420 16,70±5,71 75,42±0,89

AgSAR_N 7,6 421 14,46±5,62 61,13±1,47

AgSEAR_B 12,3 405 17,80±5,96 82,10±4,75

AgSEAR_N 7,25 409 13,56±4,84 70,71±0,71

Fonte: Autor (2019)

Ainda na Tabela 6 pode-se observar a grande diferença do tamanho de nanopartículas pelas metodologias MET e Tamanho médio Z (obtida por valores de EDL). Destaca-se que a MET detecta especialmente superfícies metálicas. O EDL baseia-se na medida do espalhamento de luz provocado, que independe da natureza do material, neste caso medindo tanto o núcleo metálico como as espécies químicas em volta (KASTURE et al., 2008).

Medidas de EDL foram feitas com soluções do tensoativos em concentração acima da CMC para verificar se elas poderiam explicar a grande diferença de valores entre o MET e o EDL das nanopartículas. A Tabela 7 mostra a medida do EDL das micelas de cada tensoativo. Observa-se que a magnitude dos tamanhos da micela se assemelham as magnitudes obtidas das nanopartículas, indicando que as nanopartículas estariam envoltas por micelas. O ponto ótimo de síntese das nanopartículas seria em concentrações acima da CMC devido a maior disponibilidade desses tensoativos no corpo da solução para reduzir e estabilizar as nanopartículas de prata.

Tabela 7 – Diâmetro de micelas determinadas por EDL

Solução Tamanho médio Z (nm)

SAR 41,02±6,19

SEAR 22,49±3,17

60 5.4 Aplicação como sensor de cisteína

Utilizando as nanopartículas sintetizadas nas condições otimizadas, foi realizado o teste de interação com solução de diferentes aminoácidos. A Figura 26 mostra as dispersões de nanopartículas com a adição de aminoácidos na concentração de 10 mmol·L-1. Pode-se observar que apenas a adição de cisteína apresentou alteração de coloração, indicando que essas nanopartículas seriam seletivas na identificação desse aminoácido.

Figura 26 – Dispersões de nanopartículas de AgSAR (a) e AgSEAR (b) com diferentes

am inoácidos. Ala – alanina; Cis – Cisteína; Glu – Glutamina; His – Histidina; Lisina –

Lisina; Pro – Prolina; Ser – Serina e Tyr – Tirosina.

(a)

(b)

Fonte: Autor (2019)

A adição de cisteína provocou uma alteração na coloração das nanopartículas (Figura 27), porém apresentou comportamentos distintos para as nanopartículas feitas com SAR e com SEAR. Nas primeiras foi identificada a aquisição de uma tonalidade branca enquanto na segunda foi identificada a mudança para uma

61 tonalidade vermelha. O processo de mudança para coloração branca pode indicar a liberação do tensoativo para a solução, que em pH neutro começa a formar emulsão de óleo (ácido ricinoléico) em água (RIVERA-RANGEL et al., 2018). No caso das AgSEAR a cisteína provoca uma alteração do tamanho das nanopartículas pela aglomeração de várias delas que altera sua RPS para maiores comprimentos de onda indicando aumento do aglomerado.

Figura 27 – Exposição da cisteína às nanopartículas de AgSAR (a) e de AgSEAR (b)

(a) (b)

Fonte: Autor (2019)

Para verificar o limite de detecção, a cisteína foi diluída até a concentração de 1 nmol·L-1 e adicionada a 1 mL de nanopartículas em condições de síntese, conforme pode ser visto na Figura 28. Nota-se uma alteração visual até cerca de 1 mmol·L-1, porém por espectroscopia de UV-Vis pode-se constatar alterações em valores de concentração menores.

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Figura 28 – Soluções de cisteína de 10 mmol·L- 1

até 1 nm ol·L- 1 adicionadas a 1 m L de

nanopartículas de AgSAR (a) e de AgSEAR (b). O prim eiro tubo da esquerda refere -se as nanopartículas puras.

(a)

(b)

Fonte: Autor (2019)

Espectros de UV-Vis dessas soluções foram feitos após 1 h da adição para se determinar a região de variação linear da absorbância. Na Figura 29 são mostrados os espectros para a adição de cisteína em diferentes concentrações para cada uma das nanopartículas. A partir dos dados obtidos, o AgSAR apresentou a região de linearidade ficou de 100 a 1000 µmol·L-1 enquanto que o AgSEAR apresentou linearidade de 20 a 100 µmol·L-1.

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Figura 29 – Espectros de UV-vis de cisteína em diferentes concentrações adicionadas a AgSAR (a) e AgSEAR (b)

(a)

(b)

Fonte: Autor (2019)

A partir dos espectros de UV-Vis, foi construído o gráfico de absorbância máxima pela concentração de cisteína adicionada, apresentada na Figura 30. Os pontos apresentados são a média dos 3 valores obtidos para cada concentração com regressão linear de cada tipo de nanopartícula mostrada no gráfico. Pelos

64 valores de regressão linear obteve-se como limites de detecção de 3,49 µmol·L-1 pra o AgSAR e de 16,67 µmol·L-1 para o AgSEAR para um nível de confiança de 99,7% (NIC et al., 2005).

Figura 30 - Gráfico de correlação da con centração de cisteína e da absorbância m áxim a m edida para o AgSAR (a) e AgSEAR (b).

(a)

(b)

65 Para investigar as diferenças químicas da interação do AgSAR e do AgSEAR com a cisteína foram feitos análises de EDL para verificar alteração do raio hidrodinâmico da nanopartícula e RMN para observar os deslocamentos dos hidrogênios dos grupos amina e tiol da cisteína.

Na Tabela 8 pode-se observar que o raio hidrodinâmico das nanopartículas foram menor do que aqueles apresentados na Tabela 6. Essa diferença pode decorrer da substituição do agente estabilizante em torno da nanopartícula. Os tensoativos se apresentam como micelas em volta do núcleo metálico, em que o enxofre da cisteína é mais reativo com a prata e substitui os agentes estabilizantes anteriores. Há uma grande diminuição do raio hidrodinâmico, pois as moléculas de cisteína são bem menores do que a micela. O tamanho obtido na Tabela 8 se aproxima muito do valor da MET em que se considera apenas o núcleo metálico, já que o tamanho da molécula de cisteína é muito menor do que o tamanho da nanopartícula.

Tabela 8 – Diâmetro de nanopartículas de prata expostas a cisteína determinadas por

EDL

Dispersão Tamanho médio Z (nm)

AgSAR + Cys 14,37±0,31

AgSEAR + Cys 17,18±0,85

Fonte: Autor (2019)

O espectro de RMN (Figura 31) mostra as modificações das bandas de cisteína após a adição das AgNPs. Em ambos os sistemas, há um pequeno deslocamento para o campo mais alto do multipleto associado com o grupo metino da cisteína, adjacente ao átomo de enxofre, que é provocado pela formação da ligação S-Ag. Este comportamento é esperado devido a forte interação entre os grupos tióis e a prata (HAN et al., 2014). A adição de cisteína para ambas as dispersões de AgSAR e AgSEAR levou o tensoativo a se agregar saindo da superfície da nanopartícula e iniciou a formação das nanopartículas revestidas por cisteína (AgCys). Há um deslocamento mais evidente, também para campo alto, no triplete associado com o grupo metileno quando a cisteína é adicionada ao AgSEAR.

66 Esse resultado auxilia as interações eletrostáticas entre o meio α-amino ácido e os grupos carboxilados da cisteína e o tensoativo, respectivamente, concomitantemente a interação entre as cadeias funcionalizadas do tensoativo. A aglomeração de AgCys na presença de compostos orgânicos adicionados está em concordância com outros estudos como detecção de glucose e cisteína (ADNAN et al., 2019; DAVIDOVIĆ et al., 2017). Por outro lado, a troca de ligantes após a adição de cisteína com adição de AgSAR induz a formação de micelas. Esse fato é evidenciado pelas alterações do espectro de UV-Vis e pela turvação apresentada em solução, que concordam com uma baixa CMC obtida experimentalmente. A CMC obtida para o SEAR foi maior que para o SAR o que fornece mais evidências para o mecanismo proposto. Uma proposta do modelo de atuação da cisteína no AgSAR e no AgSEAR é mostrado na Figura 32.

Figura 31 – Espectro de RMN da solução de cisteína (azul), de cisteína com adição de AgSAR (verde) e de cisteína com adição de AgSEAR (verm elho)

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Figura 32 – Modelo de interação da cisteína com nanopartículas de AgSAR (a) e de AgSEAR (b)

Fonte: Autor (2019)

A partir desse estudo não somente foi mostrada a efetividade do uso das AgSAR e AgSEAR como sensores de cisteína, como também foi apresentada uma proposta de explicação dos diferentes comportamentos das nanopartículas frente ao aminoácido.

5.5 Aplicação microbiológica

5.5.1 Curva de crescimento bacteriano

Foi realizado um estudo da cinética de crescimento das bactérias para identificação dos melhores tempos de aplicação dos antibióticos e dos agentes antibacterianos das próximas seções. A Figura 33 mostra a curva de crescimento das duas espécies utilizadas.

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Figura 33 – Curva de crescimento das bactérias E. coli (a) e S. aureus (b)

(a) (b)

Fonte: Autor (2019)

A fase logarítmica é aquela em que ocorre um crescimento da absorbância, indicando que a concentração de bactérias vai aumentando com o tempo. A fase estacionária é aquela em que a absorbância fica constante, indicando que se chegou ao limite de concentração bacteriano. Pode-se identificar que o final da fase de crescimento logarítmico ocorre às 4 h para E. coli e às 9 h para S. aureus, que são os melhores momentos de aplicação do agente antibacteriano.

5.5.2 Determinação da concentração mínima inibitória por microdiluição

Esse estudo foi realizado com intuito de verificar se as nanopartículas sintetizadas podem agir como agentes antibacterianos e quantificar o fator inibitório dessas substâncias. Nesse estudo foi utilizada a metodologia da microdiluição em microplaca (BALOUIRI; SADIKI; IBNSOUDA, 2016). O princípio dessa metodologia é comparar a absorbância de um meio com inoculo bacteriano com o controle (sem inoculo de bactérias), pois o crescimento de bactérias leva a um aumento da absorbância.

Inicialmente foi verificado o fator inibitório dos precursores das nanopartículas: os tensoativos e íon prata, conforme pode ser visto na Figura 34. O SAR não apresentou atividade inibitória de crescimento. Em todas as medidas com o SAR

69 observa-se que os poços inoculados com bactérias das duas cepas apresentaram absorbância maior do que no poço controle (sem adição de bactéria). Esse aumento da absorbância indica uma maior presença de bactérias que absorvem parte da luz irradiada. Entretanto a partir da concentração de 2,5 g/L há uma diminuição da absorbância, mostrando que esse tensoativo pode interferir no processo de crescimento das bactérias.

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Figura 34 – Teste de inibição de crescimento para precursores de nanopartículas: SAR

(a), SEAR (b) e Ag+(c)

(a)

(b)

(c)

71 O SEAR apresentou um fator inibitório de crescimento total na concentração de 10 g/L. Nesse valor, a absorbância dos poços inoculados ficou no mesmo valor do poço sem inoculo bacteriano (controle). O íon prata se apresentou como um melhor inibidor de crescimento, pois a partir de concentrações de 20 mg/L havia total supressão do crescimento bacteriano. Há um ganho de absorbância, mesmo nas soluções de controle, que poderia ser um indicio de interação dos íons prata com os substratos orgânicos presente no meio de cultura, como proteínas e íons cloreto (SOUTER et al., 2019).

Foi analisado o fator inibitório das AgSAR e AgSEAR, sendo seus resultados apresentados na Figura 35. O AgSAR apresentou um fator de inibição na concentração de 18 mg/L de prata, valor próximo ao encontrado para o íon prata. Entretanto devemos lembrar que esse valor de 18 mg/L refere-se à concentração de prata no momento da síntese. A formação de aglomerados nanoparticulados que possuem vários átomos de prata numa mesma nanopartícula pode fazer com que a concentração de nanopartículas seja na escala dos µmol·L-1, ou seja, mesma quantidade de átomos de prata concentrado em alguns pontos da solução. Essa aglomeração dos átomos apresentaria o mesmo poder inibidor do que os íons livres, o que pode facilitar como mecanismo de entrega e de estabilidade (ZAMIRI et al., 2011).

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Figura 35 - Teste de inibição de crescim ento para nanopartículas de AgSAR (a) e AgSEAR (b)

(a)

(b)

Fonte: Autor (2019)

Na Figura 35, pode-se observar que o AgSEAR possui um fator de inibição total na concentração de 11 mg/L de prata, que seria menor do que a concentração dos íons prata. Isso indica que o AgSEAR se apresenta como um melhor agente de inibição do que os íons prata ou do que o próprio AgSAR. Essa diferença pode ser decorrente da proteção conferida pelas micelas a nanopartícula que facilitam a interação com a parede celular das bactérias.

73 Esse estudo mostrou que as nanopartículas possuem poder inibitório de crescimento bacteriano, igual ou semelhante ao dos íons prata. Esse resultado pode ser considerado satisfatório, já que aglomerados nanoparticulados costumam apresentar fator inibitório menor do que íons livres, devido a sua menor capacidade reativa (LALUEZA; ARRUEBO; MONZO, 2011). Entretanto sua apresentação na forma de nanopartículas concentra mais esses átomos em uma região, facilitando o transporte, como a proteção conferida pela micela aumenta sua estabilidade em um meio adverso.

5.5.3 Alterações estruturais de bactérias expostas a antibióticos