UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA
INSTITUTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
Nanopartículas de prata estabilizadas por ácido ricinoléico e seu epóxido
aplicadas como sensor de cisteína e agente antimicrobiano
Anderson Dias Viana
Tese de Doutorado Natal/RN, dezembro de 2019
ANDERSON DIAS VIANA
NANOPARTÍCULAS DE PRATA ESTABILIZADAS POR ÁCIDO RICINOLÉICO E SEU EPÓXIDO APLICADAS COMO SENSOR DE CISTEÍNA E AGENTE
ANTIMICROBIANO
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química, como um dos requisitos para obtenção do grau de Doutor em Química pela Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
Orientador: Prof. Dr. Luiz Henrique da Silva Gasparotto
Co-orientador: Prof. Dr. Fabrício Gava Menezes
NATAL
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Francisco Gurgel De Azevedo - Instituto Química - IQ
Viana, Anderson Dias.
Nanopartículas de prata estabilizadas por ácido ricinoléico e seu epóxido aplicadas como sensor de cisteína e agente
antimicrobiano / Anderson Dias Viana. - Natal: UFRN, 2019. 93f.: il.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências Exatas e da Terra - CCET, Instituto de Química. Programa de Pós-Graduação em Química (PPGQ).
Orientador: Dr. Luiz Henrique da Silva Gasparotto. Coorientador: Dr. Fabrício Gava Menezes.
1. Nanopartículas de prata - Tese. 2. Ácido ricinoléico -Tese. 3. Sensor de cisteína - Tese. 4. Efeito bactericida - Tese. I. Gasparotto, Luiz Henrique da Silva. II. Menezes, Fabrício Gava. III. Título.
RN/UF/BSQ CDU 54(043.2)
DEDICATÓRIA
À Marcella, minha companheira, por ter me auxiliado em toda essa jornada com seu amor, sua ajuda e contribuições à melhoria deste trabalho.
Aos meus pais, Almir, Hélder e Margarida, por todo apoio na minha formação profissional e como individuo.
AGRADECIMENTOS
Ao orientador, Prof. Dr. Luiz Henrique da Silva Gasparotto, pelo auxílio no desenvolvimento desta pesquisa.
Ao coorientador, Prof. Dr. Fabrício Gava Menezes, pelas contribuições a tese e aos artigos.
Ao Prof. Dr. Alcides de Oliveira Wanderley Neto e ao Laboratório de Tecnologia de Tensoativos pelo apoio na extração e modificação dos precursores.
À Profa Dra Maria Celeste Nunes de Melo e ao Laboratório de Bacteriologia Médica pelo apoio nas aplicações microbiológicas deste trabalho.
À Dra Ana Carolina de Oliveira Neves Menezes e ao Prof. Dr. Edgar Perin Moraes pela contribuição no tratamento quimiométrico dos dados microbiológicos.
Ao Instituto de Química pelo apoio experimental para o desenvolvimento desta pesquisa.
A todos os integrantes do Grupo de Pesquisa de Química Biológica e Quimiometria e do Laboratório de Eletroquímica e Nanopartículas Aplicadas pelas contribuições para a execução deste trabalho.
Aos colegas Camilo Morais, Éryka Nóbrega, Heloíza Athayde e Matheus Santinello pelas contribuições no desenvolvimento desta pesquisa.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior e à Escola Agrícola de Jundiaí pelo apoio financeiro para a realização desta pesquisa.
RESUMO
A produção de materiais em nanoescala consquistou lugar de destaque na ciência moderna. Novas sínteses com uso de produtos naturais vêm sendo utilizadas por tornar o processo mais ambientalmente amigável. Entretanto, o uso do produto natural bruto requer altas temperaturas ou um longo tempo de síntese. Neste trabalho utilizamos o ácido ricinoléico extraído do óleo de mamona por sua biodegrabilidade, maior solubilidade em água e disponibilidade, pois é uma planta característica do nordeste brasileiro. No ácido ricinoléico foi feito o processo de epoxidação para aumentar a capacidade redutora dessa substância. Neste trabalho foi otimizada a síntese de nanopartículas de prata com o tensoativo do ácido ricinoléico (AgSAR) e com sua forma epoxidada (AgSEAR) para serem aplicados como sensores de cisteína e agentes antibacterianos. Obtiveram-se absorbâncias máximas de UV-Vis de 420 nm para AgSAR e de 405 nm para AgSEAR, indicando formação de nanopartículas. Pelo planejamento de experimentos obteve-se como ponto ótimo da síntese a concentração de 0,5 mmol∙L-1
de Ag+ e de 20 mmol∙L-1 do tensoativo na síntese de AgSAR e de 0,3 mmol∙L-1
de Ag+ e de 20 mmol∙L-1 do tensoativo na síntese de AgSEAR. Há uma redução do tempo de síntese de 10 dias do AgSAR para 6 h no AgSEAR. Na MET obteve-se o tamanho médio da nanopartículas 16,70 nm para AgSAR e de 17,80 nm para AgSEAR, enquanto que no EDL obteve-se 75,42 nm para AgSAR e 82,10 nm para AgSEAR. Essa diferença de tamanho indica que os tensoativos se encontram como micela em torno da nanopartícula. As nanopartículas foram seletivas a cisteína apresentando limite de detecção de 3,49 μmol∙L-1 para AgSAR e de 16,67 μmol∙L-1 para AgSEAR. Na aplicação antibacteriana, houve inibição total de crescimento na concentração de 18 mg/L para o AgSAR e de 11 mg/L para AgSEAR.
Palavras-chave: Nanopartículas de prata; Ácido Ricinoléico; Sensor de cisteína; Efeito Bactericida
ABSTRACT
The nanoscale production of materials has consolidated its importance in modern science. New synthetic routes using natural products have been developed to make the process more ecofriendly. However, the use of raw natural product requires high temperatures or a long synthesis time. In this study, due to its biodegradability, higher water solubility and availability, we employed ricinoleic acid extracted from castor oil in the ecofriendly synthesis of silver nanoparticles. Ricinoleic acid epoxidation was carried out in order to increase the ricinoleate reducing capacity. The synthesis of silver nanoparticles with ricinoleic acid surfactant (AgSAR) and its epoxidized form (AgSEAR) was optimized to be applied as cysteine sensor and antibacterial agents. Maximum UV-Vis absorbances of 420 nm for AgSAR and 405 nm for AgSEAR were obtained, which indicated nanoparticle formation. The optimal condition of the experiment was the concentration of 0.5 mmol∙L-1
Ag+ and 20 mmol∙L-1 of surfactant in AgSAR synthesis and 0.3 mmol∙L-1
of Ag+ and 20 mmol∙L-1 of the surfactant in AgSEAR synthesis. Synthesis time decreased from 10 days with AgSAR to 6 hours with AgSEAR. The average nanoparticle size was 16.70 nm for AgSAR and 17.80 nm for AgSEAR, respectively, while for DLS 75.42 nm for AgSAR and 82.10 nm for AgSEAR size diameter were observed. This size difference indicates that surfactants are found as micelles around the nanoparticle. The nanoparticles were cysteine selective with a detection limit of 3.49 μmol∙L-1
for AgSAR and 16.67 μmol∙L-1
for AgSEAR. In the antibacterial application, there was total inhibition of growth at a concentration of 18 mg/L for AgSAR and 11 mg/L for AgSEAR.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Representação da Ressonância de Plasmon de Superfície (RPS). ... 18
Figura 2 – Processo de síntese de nanopartículas de prata por redução. ... 19
Figura 3 – Fórmula estrutural do ácido ricinoléico ... 20
Figura 4 – Fórmula estrutural do epóxido do ácido ricinoléico ... 21
Figura 5 – Fórmula estrutural da cisteína ... 22
Figura 6 – Propostas de atuação das nanopartículas na célula bacteriana. ... 23
Figura 7 – Principais regiões da bioespectroscopia de Infravermelho. ... 24
Figura 8 - Processo de extração do ácido ricinoléico do óleo de mamona ... 27
Figura 9 - Processo de epoxidação do ácido ricinoléico ... 28
Figura 10 - Metodologia de síntese das nanopartículas de prata ... 29
Figura 11 - Demonstração da LBMA em um espectro de UV-Vis. ... 30
Figura 12 – Procedimento de aplicação de AgNPs como sensor de cisteína. ... 33
Figura 13 - Aplicação dos agentes antibacterianos no teste de sinergia ... 36
Figura 14 – Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio do SAR (a) e do SEAR(b). ... 38
Figura 15 – Gráficos das medidas de Tensão Superficial para SAR (a) e SEAR (b) 40 Figura 16 – Absorbância na Região do UV-Vis para os quatro planejamentos realizados. ... 43
Figura 17 – Superfície de resposta de 1ª ordem da LBMA contra os fatores concentração de prata e concentração do tensoativo. ... 46
Figura 18 - Superfície de resposta de 2ª ordem da LBMA contra os fatores concentração de prata e concentração do tensoativo. ... 47
Figura 19 – Contribuição de variabilidade do LBMA por cada um dos fatores. ... 49
Figura 20 – Absorbância em diferentes tempos para os quatro planejamentos realizados. ... 51
Figura 21 – Cinética de formação das nanopartículas para os quatro planejamentos realizados. ... 52
Figura 22 – Precipitado formado durante a síntese de AgSAR ... 52
Figura 23 – Espectro de Raman de nanopartículas de prata estabilizadas por SAR e por SEAR. ... 54
Figura 25 – Distribuição da frequência relativa dos tamanhos das nanopartículas obtidas por MET. ... 58 Figura 26 – Dispersões de nanopartículas de AgSAR (a) e AgSEAR (b) com diferentes aminoácidos. ... 60 Figura 27 – Exposição da cisteína às nanopartículas de AgSAR (a) e de AgSEAR (b) ... 61 Figura 28 – Soluções de cisteína de 10 mmol·L-1
até 1 nmol·L-1 adicionadas a 1 mL de nanopartículas de AgSAR (a) e de AgSEAR (b). ... 62 Figura 29 – Espectros de UV-vis de cisteína em diferentes concentrações adicionadas a AgSAR (a) e AgSEAR (b) ... 63 Figura 30 - Gráfico de correlação da concentração de cisteína e da absorbância máxima medida para o AgSAR (a) e AgSEAR (b). ... 64 Figura 31 – Espectro de RMN da solução de cisteína (azul), de cisteína com adição de AgSAR (verde) e de cisteína com adição de AgSEAR (vermelho) ... 66 Figura 32 – Modelo de interação da cisteína com nanopartículas de AgSAR (a) e de AgSEAR (b) ... 67 Figura 33 – Curva de crescimento das bactérias E. coli (a) e S. aureus (b) ... 68 Figura 34 – Teste de inibição de crescimento para precursores de nanopartículas: SAR (a), SEAR (b) e Ag+(c) ... 70 Figura 35 - Teste de inibição de crescimento para nanopartículas de AgSAR (a) e AgSEAR (b) ... 72 Figura 36 – Análise de Componentes Principais (a) e Análise de Cluster (b) para amostras de bactérias submetidas a soluções de antibióticos e nanopartículas... 74 Figura 37 – Análise de Componentes Principais (a) e Análise de Cluster (b) para amostras de bactérias submetidas a spots (10µL) de antibióticos e nanopartículas. 76 Figura 38 - Análise de Componentes Principais (a) e Análise de Cluster (b) para amostras de bactérias submetidas a discos de antibióticos e nanopartículas. ... 78 Figura 39 – Placa com crescimento de S aureus com adição de antibiótico Gentamicina e AgSEAR em diferentes proporções. ... 80
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Reagentes utilizados ... 26 Tabela 2 – Concentrações dos fatores em cada uma das condições dos quatro planejamentos. ... 42 Tabela 3 – Largura da Banda à Meia Altura em cada nível dos quatro planejamentos. ... 44 Tabela 4 – Coeficiente de correlação dos modelos matemáticos com os dados de cada planejamento. ... 48 Tabela 5 - Valores de potencial Zeta das dispersões de nanopartículas em meio básico e neutro conforme o tempo ... 55 Tabela 6 – Tamanhos das nanopartículas nas dispersões em meio básico e neutro. ... 59 Tabela 7 – Diâmetro de micelas determinadas por EDL ... 59 Tabela 8 – Diâmetro de nanopartículas de prata expostas a cisteína determinadas por EDL ... 65 Tabela 9 – Raio de inibição de crescimento de S aureus com soluções de antibióticos e AgSAR. ... 80 Tabela 10 - Raio de inibição de crescimento de S aureus com soluções de antibióticos e AgSEAR. ... 80
SUMÁRIO INTRODUÇÃO ... 13 2 OBJETIVOS ... 15 2.1 Objetivo Geral ... 15 2.2 Objetivos Específicos ... 15 3 REFERENCIAL TEÓRICO ... 16 3.1 Nanomateriais ... 16 3.2 Nanopartículas de prata ... 17
3.3 Síntese de nanopartículas com produtos naturais ... 18
3.4 Nanopartículas de prata para detecção de cisteína ... 21
3.5 Mecanismos de atuação das nanopartículas de prata em bactérias ... 22
4 MATERIAIS E MÉTODOS... 26
4.1 Regentes utilizados... 26
4.2 Síntese dos materiais precursores e das nanopartículas de prata ... 26
4.2.1 Extração do ácido ricinoléico ... 26
4.2.2 Epoxidação do ácido ricinoléico ... 27
4.2.3 Síntese das nanopartículas de prata ... 28
4.2.4 Planejamento experimental ... 29
4.3 Caracterizações dos materiais precursores e das nanopartículas ... 30
4.3.1 Medida de tensão superficial para determinar a concentração micelar crítica (CMC) ... 30
4.3.2 Ressonância Magnética Nuclear (RMN) ... 31
4.3.3 Espectroscopia Eletrônica na Região do Ultravioleta e Visível (UV-Vis) ... 31
4.3.4 Espectroscopia Vibracional na Região do Infravermelho por Transformada de Fourier (IVTF)... 31
4.3.5 Espectroscopia Vibracional Raman ... 32
4.3.6 Medida de Potencial Zeta ... 32
4.3.7 Espalhamento Dinâmico de Luz (EDL) ... 32
4.3.8 Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) ... 33
4.4 Aplicação como sensor de cisteína... 33
4.5 Aplicação microbiológica ... 34
4.5.1. Amostras ... 34
4.5.2 Curva de crescimento bacteriano ... 34
4.5.3 Determinação da concentração mínima inibitória por microdiluição ... 34
4.5.4 Estudo das alterações estruturais de bactérias expostas a antibióticos por espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier ... 35
4.5.5 Estudo do efeito de sinergia entre nanopartículas e antibióticos. 36 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 37
5.1 Caracterização dos precursores ... 37
5.1.1 Caracterização do ácido ricinoléico e do ácido ricinoléico epoxidado ... 37
5.1.2 Determinação da Concentração Micelar Crítica (CMC) ... 39
5.2 Otimização de síntese ... 41
5.2.1 Planejamento de experimentos ... 41
5.2.2 Largura da Banda a Meia Altura das condições de síntese ... 42
5.2.3 Determinação do ponto ótimo de síntese ... 45
5.3 Caracterização das nanopartículas... 50
5.3.1 Tempo de formação das nanopartículas ... 50
5.3.2 Estudo da superfície das nanopartículas ... 53
5.3.3 Tamanho das nanopartículas ... 56
5.5 Aplicação microbiológica ... 67
5.5.1 Curva de crescimento bacteriano ... 67
5.5.2 Determinação da concentração mínima inibitória por microdiluição ... 68
5.5.3 Alterações estruturais de bactérias expostas a antibióticos acompanhadas por espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier ... 73
5.5.4 Efeito de sinergia entre nanopartículas e antibióticos ... 79
6 CONCLUSÃO ... 82
13 INTRODUÇÃO
Nanomateriais apresentam diversas aplicações nas áreas de saúde, eletrônica, meio-ambiente e catálise (MARAMBIO-JONES; HOEK, 2010). Costuma-se definir nanomateriais como estruturas com uma das dimensões de 1 a 100 nm (NIC et al., 2005), porém pode-se ampliar a definição para todos aqueles que apresentam propriedades inexistentes em fase bulk. Caracterizam-se também por apresentarem alta relação entre área superficial e volume, podendo penetrar em regiões de difícil acesso a materiais na escala micrométrica (ROCO; MIRKIN; HERSAM, 2011).
As nanopartículas são uma das classes dos nanomateriais em que metais nobres, como ouro e prata, são utilizados na síntese, pois passam a apresentar novas propriedades como magnetismo, maior reatividade e efeito catalítico (GÓMEZ VILORIA et al., 2018; VIDHU; PHILIP, 2014). Esses materiais permitem novas aplicações utilizando uma menor quantidade de material que corresponde a um menor impacto ambiental e a um menor custo (HOLZINGER; GOFF; COSNIER, 2014).
No que tange rotas sintéticas, tipicamente a redução de íons metálicos à forma de nanopartículas é realizada pela exposição à agentes redutores como, por exemplo, o borohidreto. A reação com o borohidreto mostra-se viável devido a sua efetividade e alta taxa de reação, porém o seu uso apresenta riscos devido a sua toxicidade (IRAVANI, 2011). Nesse sentido, houve o desenvolvimento de agentes redutores ambientalmente mais amigáveis, e nessa perspectiva começou-se a utilizar produtos de origem natural (KUPPUSAMY et al., 2014), como extratos de plantas que apresentavam grupos oxigenados capazes de provocar a redução de ouro e prata, por exemplo. Entretanto, mesmo com a utilização destes novos materiais, ainda havia a necessidade da utilização de altas temperaturas, longo tempo de reação ou adição de outras substâncias tóxicas para viabilizar a reação (KHARISSOVA et al., 2013). O uso de substâncias isoladas de origem natural pode gerar condições de síntese mais brandas, pois moléculas com atividade redutora são separadas das demais que provocam reações paralelas. Neste trabalho,
isolou-14 se o ácido ricinoléico presente no óleo de mamona para obter uma síntese mais ambientalmente amigável.
Soluções coloidais de nanopartículas de prata apresentam uma coloração amarela devido ao fenômeno de Ressonância de Plasmon de Superfície. Essa característica permite uma fácil detecção no processo de síntese, pois a coloração da solução sofre grande alteração por causa do tamanho dos aglomerados. Esse material pode ser utilizado como sensor, uma vez que a prata interage muito fortemente com o enxofre, alterando a coloração da solução facilitando a identificação dessa substância (BAMDAD et al., 2016).
Antes do século XX, o nitrato de prata era a principal substância utilizada para combater infecções bacterianas, especialmente relacionadas à pele e aos olhos. A solução poderia gerar efeitos adversos relacionados à sua bioacumulação no organismo (RAI; YADAV; GADE, 2009). Nanopartículas de prata tornaram-se objetos de pesquisa por apresentarem, em pequenas doses, o mesmo poder bactericida do íon prata, pois diminuiria os efeitos adversos, como a bioacumulação (CHEN; SCHLUESENER, 2008).
O objetivo deste trabalho é sintetizar nanopartículas de prata a partir do tensoativo do ácido ricinoléico, extraído do óleo de mamona, e com sua forma epoxidada. Devido a forte interação química da prata com o enxofre, será avaliado o uso dessas nanopartículas para detecção do aminoácido cisteína (com grupos tióis), como também seu uso para inibição de crescimento de bactérias.
No terceiro capítulo será feita uma retomada da literatura dos principais temas em discussão deste trabalho como nanomateriais, nanopartículas de prata, síntese de nanopartículas, sensor de cisteína e atuação antibacteriana. No quarto capítulo é feita uma descrição dos experimentos e das técnicas realizadas. No quinto capítulo os resultados são apresentados e discutidos mostrando o processo de preparação dos precursores, da otimização da síntese, da caracterização das nanopartículas, da aplicação como sensor de cisteína e da aplicação como agente antibacteriano. No sexto capítulo são feitas as conclusões finais deste trabalho.
15 2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Sintetizar nanopartículas de prata a partir do tensoativo obtido do ácido ricinoléico e de sua forma epoxidada.
2.2 Objetivos Específicos
Otimizar, via planejamento experimental, a síntese de nanopartículas de prata pelo uso do tensoativo de ácido ricinoléico e de sua forma epoxidada que atuam como agente redutor/estabilizante.
Caracterizar as nanopartículas por meio das técnicas de Espalhamento Dinâmico de Luz (EDL), Espectroscopia Eletrônica na Região do Ultravioleta e Visível (UV-Vis), Espectroscopia Vibracional Raman (Raman), Medida de Potencial Zeta, Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) e Ressonância Magnética Nuclear (RMN).
Avaliar a atuação das nanopartículas como sensores do aminoácido cisteína. Avaliar a atividade antibacteriana das nanopartículas pela determinação da
concentração mínima inibitória (CMI), acompanhando a interação por meio da Espectroscopia Vibracional na Região do Infravermelho por Transformada de Fourier (IVTF) e verificar a existência de sinergia das nanopartículas de prata com antibióticos.
16 3 REFERENCIAL TEÓRICO
3.1 Nanomateriais
Nanomateriais são materiais que possuem alguma de suas dimensões entre 1 e 100 nm (NIC et al., 2005). Entretanto, na prática, podemos ampliar esta definição para todos aqueles materiais que em escala nanométrica, passam a apresentar propriedades diferentes da fase bulk. Os nanomateriais possuem uma alta relação área por volume, além de poderem penetrar em regiões de difícil acesso aos seus correspondentes microestruturados. Percebe-se que esses materiais desenvolvem novas características que não existem na fase bulk (RODUNER, 2006), como, por exemplo, o magnetismo das nanopartículas de ouro (GÓMEZ VILORIA et al., 2018).
Historicamente, nanopartículas de metais nobres já eram utilizadas desde da Idade Média para fornecer diferentes cores aos vitrais das igrejas (KRUKEMEYER et al., 2015). Em 1857, Michael Faraday descreve uma dispersão coloidal de nanopartículas de ouro, o que chama sua atenção pela sua cor característica (roxo) que diferia da cor da solução dos íons de ouro (amarela) (SUDHA et al., 2018). Em 1908, Gustav Mie desenvolve, utilizando as leis de Maxwell, uma teoria que explica a interação da luz com as nanopartículas (JEEVANANDAM et al., 2018). Em 1959, Richard Feynman concebe a palestra que é o marco inicial da era dos nanomateriais.
Atualmente, o setor dos nanomateriais se consolidou com uma movimentação de capital bilionária com expectativas de chegar ao marco de 125 bilhões de dólares no ano de 2024 (GREWAL, 2019). O governo americano é o maior investidor no ramo, financiando cerca de 1 bilhão de dólares anualmente em fomento de pesquisa e desenvolvimento (DICKHERBER; MORRIS; GRODZINSKI, 2015). Neste ramo, do montante total investido cerca de 12% é dedicado ao setor de saúde, 9,5% ao setor de eletrônica, 9% ao de energia e 9% ao de catálise (BHUSHAN, 2016).
17 3.2 Nanopartículas de prata
Desde da Idade Média o nitrato de prata era utilizado no tratamento de água, de ferimentos, de doenças oculares e venéreas. A aplicação da solução tinha poder bactericida, impedindo a proliferação dos agentes microbianos (FONTENOY; KAMEL, 2011). Entretanto esta aplicação poderia ser acompanhada por casos de intoxicação pela ingestão de excesso de prata.
Com o advento dos antibióticos no início do século XX, a prata teve uma queda de uso. Na década de 1960, o nitrato de prata voltou a ser utilizado associado ao antibiótico sulfadiazina em pomadas de tratamento de queimaduras. Com a contínua proliferação das bactérias resistentes, o interesse sobre da prata como bactericida voltou a aumentar (HUH; KWON, 2011).
As nanopartículas (NPs) são uma das classes de nanomateriais. Metais nobres, como ouro e prata, têm sido utilizados para a síntese gerando materiais de grande área superficial, com a presença do efeito de Ressonância de Plasmon de Superfície e com facilidade de funcionalização de sua superfície (REVERBERI et al., 2016). Além disso, nanopartículas de metais nobres passam apresentar novas características comparadas a fase bulk, como uma maior reatividade (RAI et al., 2016). Esses aglomerados de átomos de dimensões nanométricas possuem de 20 a 15000 átomos (CHEN; SCHLUESENER, 2008). As nanopartículas sofrem menor bioacumulação do que a prata metálica, porém mantendo um alto poder bactericida, especialmente se estiverem em tamanho muito reduzido (ZAZO; COLINO; LANAO, 2016).
As nanopartículas metálicas podem apresentam uma forte coloração quando se encontram em dispersões coloidais decorrente do fenômeno de Ressonância de Plasmon de Superfície (RPS). Essa ressonância surge da interação do campo magnético de uma onda luminosa que oscila os elétrons livres presente na superfície da nanoestrutura metálica (BARNES; DEREUX; EBBESEN, 2003). A partir dessa interação surge uma ressonância com comprimentos de onda que variam conforme a composição, o tamanho e o formato da nanopartículas. Na Figura 1 observa-se o
18 processo de interação do campo magnético da onda luminosa com a nuvem eletrônica presente na superfície das nanopartículas.
Figura 1 – Representação da Ressonância de Plasmon de Superfície (RPS).
Fonte: Adaptado de (KELLY et al., 2003)
O fenômeno de RPS torna facilmente identificável a formação das nanopartículas permitindo com que o processo seja acompanhado por espectroscopia eletrônica na região do ultravioleta e visível (UV-Vis) ou até mesmo a olho nu. Cada metal na forma nanoparticulada passa a apresentar cores características dependendo de seu metal, forma e tamanho (SACI; RITCEY, 2016) como amarelo para prata e roxo para o ouro. Com o comprimento de onda da absorbância máxima é possível inferir o tamanho médio das nanopartículas (HORVATH, 2009), com a ressalva em que se conheça o seu formato. A largura da banda a meia altura (LBMA) é um recurso matemático que permite identificar a distribuição dos tamanhos de nanopartículas pelos espectros obtidos. As nanopartículas tendem a ter tamanhos conforme uma distribuição gaussiana sendo que quanto menor a sua largura, mais homogênea será a distribuição do tamanho de nanopartículas.
3.3 Síntese de nanopartículas com produtos naturais
A síntese de nanopartículas metálicas é baseada em duas abordagens: a top-down e a bottom-up (CHAN; KWOK, 2011). Na primeira, o material na fase bulk é
19 degradado a aglomerados menores utilizando lasers, por exemplo. Já a segunda forma é aquela em que os íons são agregados em conjuntos maiores, especialmente pelo processo de redução formando uma dispersão coloidal.
Na síntese por redução é necessário uma solução do íon metálico, um agente redutor e um agente estabilizante (NATSUKI, 2016). O agente redutor confere elétrons ao íon metálico provocando sua passagem para o estado reduzido. Por aglomeração esses átomos se reúnem formando estruturas maiores. O agente estabilizante reduz o processo de aglomeração, fazendo com que os particulados fiquem em nanoescala (THANH; MACLEAN; MAHIDDINE, 2014). Sem a presença do agente estabilizante o processo de aglomeração continuaria até a formação do estado bulk. A Figura 2 representa o processo de conversão de íons em nanopartículas com auxílio do agente estabilizante.
Figura 2 – Processo de síntese de nanopartículas de prata por redução.
Fonte: Autor (2019)
As primeiras sínteses utilizavam agentes redutores fortes, como o borohidreto de sódio (NaBH4). Porém ele é altamente reativo e apresenta alta toxicidade,
dificultando aplicações biológicas (IRAVANI, 2011). Com a necessidade de um agente estabilizante, pesquisas passaram a utilizar compostos de função dupla (redutora/estabilizante). Tornaram-se usuais as sínteses que utilizam o citrato de sódio (MURPHY et al., 2015), a polivinil-pirrolidona (ABOU EL-NOUR et al., 2010) e o acetato de polivinila (PENCHEVA; BRYASKOVA; KANTARDJIEV, 2012; SHARMA; YNGARD; LIN, 2009).
20 Cadeias orgânicas com grupos oxigenados tornaram-se presentes em sínteses de nanopartículas, pois o grupo oxigenado auxilia na redução do íon prata (GOMES et al., 2015) enquanto a cadeia orgânica envolve a nanopartículas impedindo a aglomeração com outros núcleos metálicos (FARAMARZI; SADIGHI, 2013; HEDBERG et al., 2012). Pesquisas começaram a utilizar extratos naturais, retirados de folhas, flores e frutos para a função dupla na síntese (BHATTACHARYA et al., 2013; KUPPUSAMY et al., 2014).
A vantagem de utilizar esses produtos naturais é a sua facilidade de obtenção, rapidez de preparo e biodegradabilidade. Entretanto, o problema do uso desses materiais in natura é a presença da diversidade de substâncias que atenua a função redutora/estabilizante (KALAICHELVAN et al., 2015). O uso desses produtos naturais brutos também pode aumentar o tempo de reação e gerar a necessidade de altas temperaturas, levando ao aumento do tamanho médio da nanopartícula e sua distribuição de tamanho (KHARISSOVA et al., 2013). Outros trabalhos se direcionaram a utilizar a substâncias isoladas com a função dupla (LE et al., 2010) para superar alguns dos problemas levantados.
O óleo de mamona é extraído da semente da planta Ricinus communis bastante presente no nordeste brasileiro. O óleo é utilizado na área de cosméticos e na área medicinal, como laxante (ZAMIRI et al., 2011). O ácido ricinoléico compõe cerca de 90% dos ácidos graxos presente neste óleo (CALTUN et al., 2012) sendo observado um aumento da capacidade regenerativa dos ferimentos (NADA et al., 2015). A estrutura do ácido ricinoléico é mostrada na Figura 3.
Figura 3 – Fórmula estrutural do ácido ricinoléico
Fonte: Autor (2019)
O grande diferencial deste ácido graxo é a presença do grupo hidroxila no carbono 12 da molécula, conferindo-lhe uma maior solubilidade em água comparada
21 aos demais ácidos graxos de estrutura semelhante (BILDARD et al., 2015). Essa maior solubilidade gera dispersões coloidais mais estáveis (MORAIS et al., 2015), o que dificultaria a aglomeração rápida.
A ligação dupla existente no carbono 9 pode ser utilizada para modificações, como, por exemplo, o processo de epoxidação. O epóxido formado possui um oxigênio a mais em sua estrutura, que quando exposto ao meio fortemente básico força a abertura do anel oxirânico gerando duas novas hidroxilas. Essas hidroxilas aumentam o caráter nucleofílico da estrutura, atuando mais intensamente como doador de elétrons (COSTA et al., 2017), o qual pode auxiliar no processo de formação de nanopartículas pela geração de grupos alcoóxidos em meio básico (GOMES et al., 2015). Sua estrutura é mostrada na Figura 4. As modificações também podem ser realizadas para melhorar interações das nanopartículas com alvos específicos (DE OLIVEIRA et al., 2017; RAVINDRAN; CHANDRAN; KHAN, 2013).
Figura 4 – Fórmula estrutural do epóxido do ácido ricinoléico
Fonte: Autor (2019)
3.4 Nanopartículas de prata para detecção de cisteína
Cisteína é um aminoácido que possui em sua estrutura um grupo tiol (Figura 5) sendo ele importante para os processos metabólicos devido a reatividade do enxofre (CEBI et al., 2017). A cisteína quando se encontra na corrente sanguínea em concentrações abaixo de 250 µmol·L-1 pode indicar alteração metabólica (DAVIDOVIĆ et al., 2017) relacionado a doenças como mal de Parkinson, Alzheimer, dano do fígado e artrite reumatoide (BECEREN et al., 2017; DAI et al., 2016; GU; ROBINSON, 2016).
22
Figura 5 – Fórmula estrutural da cisteína
Fonte: Autor (2019)
As análises consolidadas para quantificação de cisteína consistem no uso de cromatografia líquida de alta eficiência e da reação com reagentes como bromobimano e iodoacetamida (TCHERKAS; DENISENKO, 2001; WANG et al., 2005). Outras técnicas com menor consumo de tempo e de menor custo já foram propostas como o uso de Fluorescência, Espectroscopia Raman e Espectroscopia de UV-Vis, porém requerem preparação das amostras (BAZYLEWSKI; FANCHINI, 2017; CEBI et al., 2017; LIU et al., 2016; YIN et al., 2015).
Nanopartículas de prata vem sendo utilizadas como sensores devido ao seu baixo custo de produção, baixo impacto ambiental e facilidade de detecção (ADNAN et al., 2019). A prata possui forte interação com o enxofre, como mostrado em nosso trabalho anterior (NÓBREGA et al., 2019). Neste trabalho, foram utilizadas nanopartículas para detectar enxofre em águas de reuso. Essa facilidade de detecção decorre das alterações da Ressonância de Plasmon de Superfície que permite detecção a olho nu ou por espectroscopia de UV-Vis (SHUKLA et al., 2019).
3.5 Mecanismos de atuação das nanopartículas de prata em bactérias
Nanopartículas de prata já se consagraram no uso antibacteriano, porém ainda não há consenso sobre seu mecanismo de atuação na célula bacteriana (NAKAZATO et al., 2015). Prata interage muito bem com os átomos de enxofre, nitrogênio e fósforo, que estão presente em diversas macromoléculas celulares (SIDDIQI; HUSEN; RAO, 2018).
23 A principal proposta da forma de atuação é o ataque ao peptidoglicano presente na parede celular bacteriana (PELGRIFT; FRIEDMAN, 2013). Devido a maior espessura da parede celular, bactérias gram-positivas são mais resistentes ao ataque das AgNPs do que as gram-negativas (DURÁN et al., 2010). As nanopartículas acabam sendo mais direcionadas a células bacterianas devido a presença da carga negativa da parede celular (DAKAL et al., 2016).
Entretanto alguns produtos metabólicos podem indicar a formação de espécies reativas de oxigênio (ERO) que atacam diversas regiões das células (WANG; HU; SHAO, 2017). Também foi observado que devido ao reduzido tamanho, nanopartículas podem atravessar o canal celular e provocar a degradação a partir do interior (ZHANG et al., 2016). A grande superfície relativa das nanopartículas pode facilitar o processo de liberação dos íons prata que auxiliariam na atuação bactericida (FRANCI et al., 2015).
Devido a forte interação da prata com enxofre, elas podem interagir nas pontes de dissulfeto presente em proteínas (MURPHY et al., 2015). Além de atacar as proteínas prontas, podem interferir em outros estágios da síntese proteica (RIZZELLO; POMPA, 2014). Nanopartículas podem alterar a conformação do Ácido Desoxirribonucléico (ADN) devido as interações intermoleculares (MARAMBIO-JONES; HOEK, 2010), dificultando a atuação da ADN helicase e polimerase. Os principais mecanismos de atuação das nanopartículas propostas estão representadas na Figura 6.
Figura 6 – Propostas de atuação das nanopartículas na célula bacteriana.
24 Observa-se que as principais classes de antibióticos apresentam alvos similares as nanopartículas, podendo atuar na parede celular, nos ribossomos, no ADN e no ARN. Ao contrário das nanopartículas, esses mecanismos de atuação já são consolidados na literatura (KOHANSKI; DWYER; COLLINS, 2010).
Metodologias de investigação da atuação das nanopartículas em bactérias foram realizadas utilizando-se Espectroscopia de Vibracional Raman (GUO et al., 2015; NEUGEBAUER et al., 2006), Cromatografia Gasosa (MIRZAJANI et al., 2011) e Microscopia Eletrônica de Transmissão (LI et al., 2010). Essas metodologias permitiram uma maior compreensão sobre o processo de interação de nanopartículas, entretanto são técnicas caras e com alta demanda de tempo que dificulta o estudo da diversidade de materiais sintetizados.
A Espectroscopia na Região do Infravermelho vem se desenvolvendo no ramo das pesquisas biológicas, devido a sua rapidez e facilidade do preparo de amostra. Esta técnica se tornou possível pela existência da região de fingerprint caracterizado pelos sinais obtidos dos números de onda de 1800-900 cm-1 em que cada biomolécula apresenta um sinal específico (BEEKES; LASCH; NAUMANN, 2007). A Figura 7 apresenta os principais sinais de biomoléculas obtidas em um espectro de infravermelho.
Figura 7 – Principais regiões da bioespectroscopia de Infravermelho.
25 A bioespectroscopia de infravermelho já é utilizada para o estudo de macromoléculas (RODRIGUEZ-SAONA et al., 2001) como para verificar alterações estruturais de partes da bactéria (NIVENS et al., 1993; SUCI; VRANY; MITTELMAN, 1998). Com o uso de análise multivariada se tornou possível analisar a grande quantidade de dados gerados em um espectro de infravermelho (LI et al., 2016). Quimiometria vem sendo empregada para poder identificar e quantificar contribuições de comprimentos de onda na variabilidade dos dados. Com isto pode-se determinar que estruturas estão pode-sendo modificadas a partir do tratamento experimental utilizado (SIQUEIRA; LIMA, 2016).
26 4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Regentes utilizados
Todos os reagentes químicos utilizados neste trabalho foram de grau analítico e utilizados conforme recebidos. Na Tabela 1 são apresentados os reagentes empregados na síntese dos compostos.
Tabela 1 - Reagentes utilizados
Reagentes Fórmula
molecular
Pureza Fabricante
Acetona C3H6O 99,5% Labsynth Produtos para Laboratório Ltda.
Ácido Fórmico CH2O2 99,0% Êxodo Científica
Ácido Sulfúrico H2SO4 98,0% Neon Comercial Ltda.
Anidrido Acético C4H6O3 99,9% Labsynth Produtos para Laboratório Ltda.
Etanol C2H6O 99,5% Neon Comercial Ltda.
Éter dietílico C4H10O 99,9% Labsynth Produtos para Laboratório Ltda.
Hidróxido de Potássio KOH 85,0% Merck Brasil
Hidróxido de Sódio NaOH 98,0% Vetec – Química Fina
Nitrato de Prata AgNO3 99,0% Sigma-Aldrich
Permanganato de Potássio KMnO4 99,0% Dinâmica – Química Contemporânea Ltda.
Peróxido de Hidrogênio H2O2 30,0% Vetec – Química Fina
Sulfato de sódio Na2SO4 99,5% Anidrol Produtos para Laboratório
Fonte: Autor (2019)
4.2 Síntese dos materiais precursores e das nanopartículas de prata 4.2.1 Extração do ácido ricinoléico
A extração do ácido ricinoléico foi realizada do óleo de mamona comercial conforme metodologia apresentada em (CASTRO DANTAS et al., 2002). Na Figura 8 tem-se a representação das principais etapas do processo de extração. Misturaram-se 120 g de óleo de mamona a 24 g de hidróxido de potássio e 240 mL de etanol. A mistura foi posta em um balão de reação com um sistema de refluxo e
27 mantida por 2 h. O produto obtido foi colocado em um balão de separação, lavado com água destilada e solução de ácido sulfúrico 30% para separar as fases aquosas e oleosa. Quando o pH estava próximo de 4,5, foi colocado éter dietílico para aumentar a partição entre óleo e fase aquosa. Desprezou-se a fase aquosa. Foi adicionado sulfato de sódio no óleo para se retirar água que estivesse dispersa. O óleo ficou em repouso por 48 h a temperatura ambiente para absorção da água pelo sulfato de sódio. Foram adicionadas 2,5 vezes o volume do óleo em acetona e o sistema foi resfriado por 48 h a cerca de -15 ºC. O sistema foi então filtrado retendo o sulfato de sódio e os cristais dos ácidos graxos mais leves. O óleo obtido foi misturado a uma solução de hidróxido de sódio na proporção de número de mols de 1:1. O sistema foi agitado com bastão de vidro até obter uma massa homogênea que foi espalhada em um almofariz para secar. Após 3 dias, o sólido obtido foi desaglomerado e peneirado. O material obtido foi denominado de sabão de ácido ricinoléico (SAR).
Figura 8 - Processo de extração do ácido ricinoléico do óleo de m am ona
Fonte: Autor(2019)
4.2.2 Epoxidação do ácido ricinoléico
A epoxidação do ácido ricinoléico foi conduzida segundo a metodologia de (COSTA et al., 2017). Na Figura 9 têm-se as principais etapas do processo de epoxidação realizado. Para formar o ácido peracético, 11,64 mL de peróxido de
28 hidrogênio foram gotejados lentamente em um balão de reação com 12,48 mL de anidrido acético. O sistema foi mantido sob agitação magnética, à temperatura ambiente, por 24 h. O ácido peracético formado foi gotejado lentamente em um balão de reação com 19,98 g de ácido ricinoléico (óleo) e mantido sob agitação durante 3 h. O produto obtido foi passado para um balão de decantação onde foi lavado com água destilada para retirar as substâncias polares. Depois de lavado, foi adicionado éter dietílico para aumentar a partição da fase óleo e da fase aquosa. A parte aquosa foi desprezada. Adicionou-se sulfato de sódio para retirar água dispersa na fase óleo. O sistema ficou em repouso por 24 h. O produto foi filtrado e o óleo obtido foi misturado com uma solução de hidróxido de sódio na proporção de número de mols de 1:1. O sistema foi agitado com bastão de vidro até obter uma massa homogênea que foi espalhada em um almofariz para secar. Após 3 dias, o sólido obtido foi desaglomerado e peneirado. O material obtido foi denominado de sabão de epóxido de ácido ricinoléico (SEAR).
Figura 9 - Processo de epoxidação do ácido ricinoléico
Fonte: Autor (2019)
4.2.3 Síntese das nanopartículas de prata
O sistema reacional é apresentado na Figura 10. No béquer A foi adicionado a solução do tensoativo e a de hidróxido de sódio. No béquer B foi adicionado a
29 solução de nitrato de prata. Completou-se cada béquer com água deionizada até o volume de 25 mL. A reação iniciou-se quando o conteúdo do béquer B foi despejado sobre A, sendo que o segundo estava sob agitação manual. O processo foi acompanhado por espectrofotometria na região do UV-Visível até que a absorbância na região de 400-430 nanômetros tornou-se máxima. Após isso, o sistema foi neutralizado com ácido clorídrico até o pH entre 7,0-8,0. Repetiu-se o mesmo processo para cada um dos tensoativos (SAR e SEAR). As nanopartículas obtidas foram codificadas como AgSAR e AgSEAR, respectivamente.
Figura 10 - Metodologia de síntese das nanopartículas de prata
Fonte: Autor (2019)
4.2.4 Planejamento experimental
Planejamento experimental é um conjunto de técnicas estatísticas que permite encontrar de forma mais precisa a melhor condição do experimento. Nesse tipo de estudo se elencam as variáveis que podem influenciar no resultado que são chamados de fatores. O resultado obtido, o qual será melhorado no processo, é chamado de resposta. É feito um planejamento em que se varie os fatores entre um ponto máximo e mínimo e veja como a resposta se altera nesses pontos. O recurso estatístico permite que vários fatores sejam modificados ao mesmo tempo sendo que se torna quantificável determinar quanto cada fator influencia no valor numérico da resposta.
Foi realizado um planejamento fatorial de 22 com ponto central com intuito de identificar quais os parâmetros de síntese geravam nanopartículas com menor
30 distribuição de tamanho. Como fatores foram utilizados a concentração de prata ([Ag+], variando de 0,1 a 0,5 mmol∙L-1) e a concentração do tensoativo ([SAR] ou [SEAR], acima e abaixo da concentração micelar crítica). Tomou-se como resposta a largura da banda à meia altura (LBMA, Figura 11) das bandas de nanopartículas obtidas na Espectroscopia Eletrônica na Região do UV-Vis. Existe uma correlação que quanto menor for a LBMA maior será a homogeneidade do tamanho das nanopartículas (SKRDLA; YANG, 2019). O planejamento foi gerado e processado no programa estatístico R (CRAN Project, versão 3.5.0) com o pacote rsm, sendo os experimentos realizados em triplicata e em ordem aleatória.
Figura 11 - Dem onstração da LBMA em um espectro de UV -Vis. As linhas tracejadas verm elhas referem -se aos valores m áxim o e m ínim o, enquanto a LBMA é a diferença
entre eles.
Fonte: Autor(2019)
4.3 Caracterizações dos materiais precursores e das nanopartículas
4.3.1 Medida de tensão superficial para determinar a concentração micelar crítica (CMC)
Foi preparada uma solução 0,1 mol∙L-1
de cada um dos tensoativos com hidróxido de sódio (NaOH) 0,1 mol∙L-1
. A tensão superficial do sistema foi acompanhada pelo Medidor de Tensão Superficial SensaDyne® 6000, presente no Laboratório de Tecnologia de Tensoativos, utilizando o método da máxima pressão
31 de bolha. O sistema foi diluído de 5 em 5 mL com solução NaOH 0,1 mol∙L-1
até que a tensão superficial se aproximou do valor da solução de NaOH.
4.3.2 Ressonância Magnética Nuclear (RMN)
Os dados desta caracterização foram obtidos no espectrômetro da marca BRUKER modelo AVANCE DRX 500, 300 MHz, do Departamento de Química Orgânica e Inorgânica da Universidade Federal do Ceará. As análises foram feitas pela diluição de 10 mg da amostra em água deuterada, na temperatura de 30 ºC.
4.3.3 Espectroscopia Eletrônica na Região do Ultravioleta e Visível (UV-Vis)
As soluções coloidais de nanopartículas foram analisadas no espectrofotômetro USB-650 Tide da Ocean Optics disponível no Laboratório de Eletroquímica e Nanopartículas Aplicadas. As medidas foram feitas na região de 200 a 850 nm utilizando uma cubeta de quartzo com caminho óptico de 1,0 cm com água destilada como parâmetro de referência. As amostras para obtenção do ponto ótimo de síntese eram diluídas até que a absorbância medida fosse próxima de 1,0.
4.3.4 Espectroscopia Vibracional na Região do Infravermelho por Transformada de Fourier (IVTF)
As análises foram conduzidas no espectrofotômetro Shimadzu FTIR-8400S, série IRAFFINITY-1 na Central Analítica do Instituto de Química. Os espectros foram registrados no modo de Refletância Total Atenuada (RTA) utilizando a faixa espectral de 4000 a 400 cm-1, com 32 varreduras e com resolução de 4 cm-1.
32 4.3.5 Espectroscopia Vibracional Raman
Os dados da Espectroscopia Vibracional Raman foram obtidos no equipamento LabRam HR Evolution da marca Horiba da Central Analítica do Instituto de Química. As amostras foram iluminadas com um laser de Hélio-Neônio com comprimento de onda 633 nm com o tempo de aquisição de 10 s. As amostras de nanopartículas foram depositadas por evaporação sobre uma lâmina de alumínio para melhoria do sinal.
4.3.6 Medida de Potencial Zeta
Nessa caracterização foi utilizado o analisador de potencial ZetaPALS da marca Brookhaven, presente no Laboratório de Recursos Hídricos e Saneamento Ambiental. As soluções foram diluídas até que a contagem de sinais ficasse entre 100 a 500 mil contagem por segundo com as análises sendo realizadas três vezes, em um tempo de 300 s, à temperatura de 25 ºC.
4.3.7 Espalhamento Dinâmico de Luz (EDL)
O raio hidrodinâmico foi medido pelo analisador de tamanho de partículas em submicron ZetaPALS da marca Brookhaven, disponível no Laboratório de Recursos Hídricos e Saneamento Ambiental. As amostras foram diluídas até que a contagem de sinais ficasse entre 100 a 500 mil contagem por segundo com as análises sendo realizadas em triplicata, no total de 100 ciclos, à temperatura de 25 ºC, utilizando um feixe frontal (15º).
33 4.3.8 Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)
As imagens das nanopartículas foram obtidas no microscópico eletrônico FEI Tecnai G2 Spirit BioTWIN do Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia. As amostras foram depositadas em grades de cobre e recobertas com um filme de carbono. Depois da evaporação do solvente, as análise foram conduzidas no potencial de 120 kV.
4.4 Aplicação como sensor de cisteína
Uma solução de cisteína foi preparada na concentração de 10 mmol·L-1 e diluída em potências de dez até a concentração de 1 nmol·L-1. Conforme mostrado na Figura 12, adicionou-se 1 mL de cada solução de cisteína a 1 mL da solução de nanopartículas e foram medidas por espectroscopia na região de UV-Vis após 1 h. As medidas de cada concentração foi feita em triplicata.
Figura 12 – Procedimento de aplicação de AgNPs como sensor de cisteína.
34 4.5 Aplicação microbiológica
4.5.1. Amostras
As aplicações microbiológicas foram feitas com cepas padrões de uma bactéria gram positiva (Staphylococcus aureus, ATCC® 25923™) e de uma gram-negativa (Escherichia coli, ATCC® 25922™). Antes do uso, as bactérias eram mantidas em leite desnatado previamente esterilizado e mantidas a -10 ºC. Todas aplicações foram conduzidas no Laboratório de Bacteriologia Médica do Centro de Biociências.
4.5.2 Curva de crescimento bacteriano
Foram adicionados 50 μL das amostras de cepas congeladas a 2 mL de caldo de infusão de cérebro e coração (Brain Heart Infusion Broth, HiMedia®) e foram mantidas incubadas, a 37 ºC, por um período de 12 h. Neste período foram feitas medidas de espectroscopia na região do UV-Vis a cada hora, no comprimento de onda de 625 nm.
4.5.3 Determinação da concentração mínima inibitória por microdiluição
As amostras de cepas congeladas foram passadas para uma placa com meio de cultura Mueller-Hinton (HiMedia®) usando uma alça bacteriológica e foram incubadas, a 37 ºC, por um período de 24 h. Colônias isoladas foram retiradas da placa e adicionadas em uma solução salina estéril de NaCl 0,9% (m/V) até que a concentração equivalesse a turbidez visual 0,5 da escala de McFarland (1,5x108 UFC/mL). Essa metodologia de preparação das bactérias também foi utilizada para seções 4.5.4 e 4.5.5. As soluções de teste do agente antibacteriano foram
35 preparadas a partir de uma solução de 10 g/L e diluída sempre pela metade por 10 vezes.
Adicionaram-se 80 μL de caldo Mueller-Hinton (HiMedia®) a cada poço de uma microplaca de 96 poços. Posteriormente foram adicionados 10 μL do inoculo em meio salino e 10 μL da solução do agente antibacteriano em diferentes concentrações. Para efeito de controle, em um poço foi adicionado o inoculo sem o agente antibacteriano, noutro foi adicionado apenas o agente antibacteriano e em um terceiro foi adicionado apenas o meio de cultura e água. A microplaca foi tampada e ficou incubada à 37 ºC pelo tempo de 16 h. Ao final foi feita a medida na espectroscopia na região de UV-Vis em 625 nm para comparar a turbidez das amostras com os controles (HASSELMANN, 2003).
4.5.4 Estudo das alterações estruturais de bactérias expostas a antibióticos por espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier
Bactérias em suspensão salina foram passadas para placas com meio de cultura ágar Mueller-Hinton (HiMedia®) utilizando haste flexível com algodão. A passagem era feita de forma a gerar um crescimento uniforme das bactérias sobre o meio de cultura e foram incubadas, a 37 ºC por 24 h. Foi aplicado 5 mL de soluções de 4 antibióticos e de 2 nanopartículas em cada placa para que a concentração final fosse de 100 μg/mL (maior do que Concentração Mínima Inibitória relatada) e incubou-se pelo tempo de 12 h. As amostras de bactérias foram retiradas com auxílio de uma alça bacteriológica e passadas para lâminas de vidro para secar. As medidas foram feitas em IVTF pelo modo RTA sendo que cada lâmina foi analisada em três posições. As análises foram feitas em 3 amostras e foram obtidos 3 espectros de cada amostra.
Os espectros obtidos foram importados e tratados utilizando o software MATLAB R2014a (Mathworks, EUA) com a PSL-toolbox versão 7.5.2 (Eigenvector Research, Ic, Wenatchee, WA). Espectros brutos foram pré-processados selecionando a região de 900 cm-1 a 1800 cm-1 e centrando-os na média.
36 4.5.5 Estudo do efeito de sinergia entre nanopartículas e antibióticos
Bactérias em suspensão salina foram passadas para placas com meio de cultura ágar Mueller-Hinton (HiMedia®) utilizando haste flexível com algodão. A passagem era feita de forma a gerar um crescimento uniforme das bactérias sobre o meio de cultura. Foram feitos 5 poços de 6 mm de diâmetro para inserir a solução de nanopartículas e dos antibióticos. Um volume de 40 µL desses materiais, em diferentes proporções (Figura 13) era inserido em cada um dos poços num total de 10 µg de agente antibacteriano. Ao final de 18 h eram medidos os raios dos halos de inibição para indicar o poder antibacteriano das substâncias testadas (SILVA et al., 2015).
Figura 13 - Aplicação dos agentes antibacterianos no teste de sine rgia
37 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Nesta seção serão apresentados os dados obtidos das caracterizações dos materiais sintetizados e suas aplicações como sensor de cisteína e como agente antibacteriano.
5.1 Caracterização dos precursores
5.1.1 Caracterização do ácido ricinoléico e do ácido ricinoléico epoxidado
No processo de extração do ácido ricinoléico, foi obtido um sólido branco de pequena granulometria. O sólido epoxidado também apresentou coloração branca, porém uma maior granulometria. Na Figura 14 estão os espectros referentes à Ressonância Magnética Nuclear do SAR e do SEAR. Pode-se constatar que os principais sinais da molécula de SAR e SEAR estão presentes, indicando que o processo de extração e epoxidação foram satisfatórios na obtenção dos produtos pretendidos.
38
Figura 14 – Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio do SAR (a) e do SEAR(b).
(a)
(b)
39 Nestes espectros verifica-se a ausência de sinal entre os deslocamentos 4,23-4,37 ppm que seriam característicos do glicerol, ou seja, seria esperado na sua forma de triglicerídeo, mostrando que a hidrólise foi efetiva para isolar os ácidos graxos. O processo de epoxidação do ácido ricinoléico foi efetivo, pois há o desaparecimento dos deslocamentos referentes aos hidrogênios da insaturação (5,56 - 5,30 ppm). Surge na estrutura epoxidada os sinais de 3,90 - 3,30 ppm que seriam referentes aos hidrogênios ligados aos carbonos do anel oxirânico (LAURENTINO et al., 2018).
5.1.2 Determinação da Concentração Micelar Crítica (CMC)
A Concentração Micelar Crítica (CMC) é a concentração em que o tensoativo passa a se agregar na forma de micelas, em que há diferenças químicas de sua apresentação como monômero e como micela (NIC et al., 2005). Costa et. al. (2017) já haviam observado que as nanopartículas de SEAR apresentavam diferenças de características quando sintetizadas abaixo e acima da CMC.
A determinação foi conduzida pelo método de pressão de bolha em que o equipamento mede a mudança da tensão superficial pela diluição de uma solução do tensoativo. Quando a concentração de tensoativo é baixa, os monômeros vão para a superfície da solução diminuindo a tensão superficial. Quando se aumenta a concentração do tensoativo, chega-se a um ponto de saturação da superfície em que os monômeros adicionados vão para o corpo da solução e passam a se aglomerar em micelas. Como essas micelas se aglomeram no corpo da solução, não ocorre alteração da tensão superficial.
A Figura 15 mostra os gráficos das medidas de Tensão Superficial. Podem-se observar três estágios: monômeros (preto), micelas (azul) e intermediário (vermelho). A mudança do estágio de monômero para o estágio de micela seria o ponto da CMC. Foi realizada uma regressão linear para cada região, sendo o coeficiente de correlação (r2) maior do que 95%, que está mostrada nas equações dos gráficos. Para determinar a CMC, foi calculado x para os valores de y(micela) = y(monômero) sendo 1,74 mmol∙L-1 para o SAR e de 7,18 mmol∙L-1
40 determinação foi feita em pH básico com a diluição do tensoativo feita com uma solução de hidróxido de sódio para replicar as condições de síntese.
Figura 15 – Gráficos das medidas de Tensão Superficial para SAR ( a) e SEAR (b)
(a)
(b)
41 O SAR apresentou um valor de CMC abaixo do valor apresentado pelo SEAR, o que indica que o SAR tem uma maior facilidade de formar micelas. Em pH alto, o grupo carboxílico fica na sua forma desprotonada apresentando alta polaridade. Entretanto o SAR possui uma cadeia com 18 carbonos com uma insaturação no meio que realça o seu caráter apolar. Para poder estabilizar a cadeia apolar, o aumento da concentração de tensoativo no meio faz com que os monômeros se reúnam formando uma micela, sendo o carboxilato exposto para o meio polar aquoso e as cadeias apolares unidas no interior da micela.
O SEAR apresenta uma maior resistência para formação da micela, pois sua cadeia de 18 carbonos possui um anel oxirânico no meio dela. Esse anel, em meio básico, abre-se gerando duas hidroxilas. Essa estrutura confere uma grande polaridade a cadeia carbônica, sendo que ela é mais facilmente estabilizada pela água. Essa maior estabilização pela água, faz com que a concentração micelar crítica do SEAR seja cerca de quatro vezes maior do que a do SAR.
5.2 Otimização de síntese
5.2.1 Planejamento de experimentos
O objetivo do Planejamento Experimental é encontrar a melhor condição de resposta pela variação dos fatores. Teve-se como fatores a concentração da prata ([Ag+]) e a concentração do tensoativo ([SAR] ou [SEAR]) sendo a resposta a largura da banda a meia altura (LBMA) obtida dos espectros na região do UV-Vis. A forma da apresentação do tensoativo, monômero ou micela, poderia interferir no perfil de nanopartículas obtidas, portanto foi considerado um planejamento em torno dos valores de CMC e outra com valores bem acima da CMC.
Foram realizados 4 planejamentos: planejamento A - síntese com SAR em valores acima da CMC; planejamento B - síntese com SAR em valores em torno da CMC; planejamento C - síntese com SEAR em valores acima da CMC; planejamento D – síntese com SEAR em valores em torno da CMC. A Tabela 2 mostra as concentrações em cada uma das 5 condições dos 4 planejamentos, sendo a
42 condição 3 o ponto central. Os valores da concentração da CMC do tensoativo foram apresentados na seção anterior. O valor da concentração da prata decorre de valores experimentais encontrados por nosso grupo de pesquisa (COSTA et al., 2017).
Tabela 2 – Concentrações dos fatores em cada uma das condições dos 4 planejam entos.
Planejamento Condição 1 (++) Condição 2 (+-) Condição 3 (##) Condição 4 (-+) Condição 5 (--)
A [Ag + ] = 0,5 mM [SAR] = 80 mM [Ag+] = 0,5 mM [SAR] = 20 mM [Ag+] = 0,3 mM [SAR] = 50 mM [Ag+] = 0,1 mM [SAR] = 80 mM [Ag+] = 0,1 mM [SAR] = 20 mM B [Ag + ] = 0,5 mM [SAR] = 3,4 mM [Ag+] = 0,5 mM [SAR] = 0,1 mM [Ag+] = 0,3 mM [SAR] = 1,8 mM [Ag+] = 0,1 mM [SAR] = 3,4 mM [Ag+] = 0,1 mM [SAR] = 0,1 mM C [Ag + ] = 0,5 mM [SEAR] = 80 mM [Ag+] = 0,5 mM [SEAR] = 20 mM [Ag+] = 0,3 mM [SEAR] = 50 mM [Ag+] = 0,1 mM [SEAR] = 80 mM [Ag+] = 0,1 mM [SEAR] = 20 mM D [Ag + ] = 0,5 mM [SEAR] = 13 mM [Ag+] = 0,5 mM [SEAR] = 1 mM [Ag+] = 0,3 mM [SEAR] = 7 mM [Ag+] = 0,1 mM [SEAR] = 13 mM [Ag+] = 0,1 mM [SEAR] = 1 mM Fonte: Autor (2019)
5.2.2 Largura da Banda a Meia Altura das condições de síntese
Cada planejamento teve 5 condições de síntese feitas em triplicata totalizando 15 amostras. Essas amostras foram acompanhadas por Espectroscopia na Região de UV-Vis por 14 dias nas sínteses com SAR e por 3 dias nas sínteses com SEAR. Na Figura 16 temos os espectros obtidos até cada o tempo final, sendo diluídos até que a absorbância ficasse próxima de 1. O fator de diluição de cada condição encontra-se ao final da legenda. Cada um dos 4 quadros representa um dos planejamentos e em cada um deles há 5 espectros para cada uma das condições de síntese. Os espectros representados são a média das 3 amostras nas mesmas condições.
43
Figura 16 – Absorbância na Região do UV-Vis para os quatro planejamentos realizados. (a) AgSAR com [SAR] = 20~80 m M; (b) AgSAR com [SAR] = 0,1~3,4 m M;
(c) AgSEAR com [SEAR] = 20~80 m M; (d) AgSEAR com [SEAR] = 1~13 m M.
(a) (b)
(c) (d)
Fonte: Autor (2019)
Na Figura 16 pode ser visto que o rendimento das sínteses com SEAR são bem superiores do que a sínteses com SAR, pois os fatores de diluições são maiores. Por exemplo, na comparação dos estudos C e A, em que a concentração dos tensoativos e do metal é a mesma, o fator de diluição de C é de 1:6,05 enquanto que para A é de 1:2,20. Pela mesma imagem, pode-se observar que os valores que não conseguiram atingir a absorbância de 1,0 são aqueles em que a concentração da prata é mínima.
A prata influencia na absorbância/fator de diluição das amostras. Como esperado, quão maior a concentração da prata, maior será sua absorbância/fator de diluição. A concentração do tensoativo influencia na forma da banda de absorbância. Pode ser visto no planejamento D um pequeno alargamento da banda quando a
44 concentração do tensoativo é menor do que a CMC. Uma baixa concentração do tensoativo diminui sua interação com a prata dificultando a estabilização das nanopartículas. Essa dificuldade faz com que ocorra um alargamento da banda que indica uma maior distribuição dos tamanhos de nanopartículas. No planejamento A, em que todas as condições estão acima da CMC, pode-se perceber o contrário, quanto maior a concentração do tensoativo, maior a largura da banda logo uma maior distribuição do tamanho de nanopartículas.
Para cada espectro foi calculada a LBMA considerando o comprimento de onda de absorbância máxima (420 nm para o planejamento A, 410 nm para o planejamento B e 405 nm para as sínteses com SEAR). Quanto menor o valor da LBMA, mais homogênea será a distribuição de tamanhos das nanopartículas. Na Tabela 3 apresenta-se a média dos 3 valores obtidos de cada condição acompanhadas de seu desvio-padrão. Os valores de LBMA obtidos de cada espectro serviram como resposta para determinação do ponto ótimo de síntese.
Tabela 3 – Largura da Banda à Meia Altura em cada nível dos 4 planejamentos.
LBMA Média(Desvio-padrão) [Ag+] = 0,5 mM [Tensoativo] = Max [Ag+] = 0,5 mM [Tensoativo] = Min [Ag+] = 0,3 mM [Tensoativo] = Med [Ag+] = 0,1 mM [Tensoativo] = Max [Ag+] = 0,1 mM [Tensoativo] = Min Planejamento A [SAR] = 80~20 mM 80,67±3,79 69,00±1,73 84,00±5,29 86,67±2,08 76,67±0,58 Planejamento B [SAR] = 3,4~0,1 mM 75,00±1,73 79,67±1,53 79,33±5,03 75,67±0,58 87,67±7,23 Planejamento C [SEAR] = 80~20 mM 71,67±1,53 70,00±1,00 65,00±0,00 85,33±1,15 67,00±1,00 Planejamento D [SEAR] = 13~1 mM 78,33±0,58 76,33±0,58 80,33±0,58 70,00±1,00 88,00±1,00 Fonte: Autor (2019)
Tanto no SAR como no SEAR, pode-se observar que o tensoativo é o fator predominante na determinação da LBMA. Nos planejamento A e C, os melhores valores são quando a concentração do tensoativo é mínima enquanto que no planejamento B e D são quando a concentração do tensoativo é máxima. Essas melhores condições correspondem ao mesmo ponto em que a concentração do
45 tensoativo está um pouco acima da CMC. Isso indica que a presença do tensoativo na forma de micelas no corpo da solução ajuda no processo de redução e estabilização, ao contrário da sua apresentação como monômero na superfície da solução.
5.2.3 Determinação do ponto ótimo de síntese
Os valores de LBMA de cada amostra foram considerados como as respostas do planejamento. Os dados foram processados no programa estatístico R (CRAN project) gerando as superfícies de resposta de 1ª ordem (Figura 17) e de 2ª ordem (Figura 18). Vale destacar que quanto menor o valor de LBMA mais homogênea é a distribuição dos tamanhos das nanopartículas.
As superfícies geradas diferem quanto ao modelo matemático utilizado para explicar a variância dos dados. No caso da superfície de 1ª ordem, o modelo utilizado é uma equação linear como se a variância de cada fatores pudesse ser explicada do tipo quando fator A diminui, fator B cresce em determinada proporção. Na superfície de 2ª ordem, o modelo utilizado é de equações de segunda ordem, em que o ponto ótimo se encontra mais próximo do ponto central do que os extremos utilizados.
46
Figura 17 – Superfície de resposta de 1ª ordem da LBMA contra os fatores concentração de prata e concentração do tensoativo. Nos fatores +1, 0 e -1 correspondem aos níveis m áxim o, m édio e m ínim o respectivam ente. (a) AgSAR com [SAR] = 20~80 m M; (b) AgSAR com [SAR] = 0,1~3,4 m M; (c) AgSEAR com [SEAR] =
20~80 m M; (d) AgSE AR com [SEAR] = 1~13 mM.
(a) (b)
(c) (d)
47
Figura 18 - Superfície de resposta de 2ª ordem da LBMA contra os fatores concentração de prata e concentração do tensoativo. Nos fatores +1, 0 e -1 correspondem aos níveis m áxim o, m édio e m ínim o respectivam ente. (a) AgSAR com [SAR] = 20~80 m M; (b) AgSAR com [SAR] = 0,1~3,4 m M; (c) AgSEAR com [SEAR] =
20~80 m M; (d) AgSEAR com [SEAR] = 1~13 mM.
(a) (b)
(c) (d)
Fonte: Autor (2019)
Para verificar qual modelo matemático explica melhor a correlação com os dados foram comparados os valores do coeficiente de correlação (Tabela 4). Pode ser visto que em todos os planejamentos o modelo de 2ª ordem se correlaciona melhor com os dados e estes foram considerados para determinar os pontos ótimos de cada uma das sínteses.
48
Tabela 4 – Coeficiente de correlação dos modelos matemáticos com os dados de cada
um dos planejam entos.
Planejamento Correlação com modelo 1ª ordem Correlação com modelo 2ª ordem
A - [SAR] = 80~20 mM 0,717 0,802
B - [SAR] = 3,4~0,1 mM 0,488 0,505
C - [SEAR] = 80~20 mM 0,411 0,980
D - [SEAR] = 13~1 mM 0,285 0,984
Fonte: Autor (2019)
O SEAR gerou valores de correlação melhores do que os modelos do SAR. No caso os dados do SEAR parecem se adequar melhor ao modelo matemático feito, ou seja, seus dados possuem uma consistência interna maior. Os menores valores de correlação do SAR podem ser por causa do meio reacional mais variável já que a síntese ocorre em um período de 14 dias com eventuais reações paralelas e alterações de temperatura. O SAR também apresenta menor poder de redução que faz com que a redução e estabilização operem de forma mais lentas.
A partir dos modelos de segunda ordem, pode-se determinar a contribuição de cada fator para variabilidade. A Figura 19 mostra o quanto cada fator contribui para variabilidade das nanopartículas obtidas. Na maioria dos casos, a concentração do tensoativo é o fator preponderante na determinação da LBMA.
