A fim de avaliar primariamente a atividade de biodegradação de hidrocarbonetos durante a curva de crescimento dos consórcios R1 e R2, foi utilizado um indicador redox para sugerir a ocorrência de degradação do petróleo. Observa-se nas figuras 13 A e B que os consórcios se mostram positivos para a degradação de hidrocarbonetos, quando comparados aos controles negativos sem carbono. Os controles sem fonte de carbono (Figura 13 A) também mostram certa atividade (mudança de cor), o que possivelmente é um indicativo de organismos quimioautotrófico presentes nas amostras, no entanto, testes cromatográficos estão em execução para confirmar essa hipótese.
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Figura 13 Teste de degradação de hidrocarbonetos com indicador DCPIP. Em A) Controle positivo com glicose (C+gli); Consórcios R1 com petróleo (Pet+R1); Controle negativo sem fonte de carbono com o consórcio de rocha R1(C-pet); Controle negativo com petróleo (C+pet) e controle negativo do meio BH e o reagente DCPIP(C+BH). Em B) Controle positivo com glicose (C+gli); Consórcios R2 com petróleo (Pet+R2); Controle negativo sem fonte de carbono com o consórcio de rocha R2(C- pet); Controle negativo com petróleo (C+pet) e controle negativo do meio BH e o indicador DCPIP (C+BH).
4.7 Cromatografias
Com o intuito de quantificar os hidrocarbonetos residuais decorrentes da degradação realizada pelos consórcios de água de produção A1 e A2, foram feitas cromatografias a gás, tendo como controle o meio mineral BH sem petróleo durante a fase estacionária da curva de crescimento dos consórcios. Os primeiros resultados das cromatografias para hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) são mostradas na figura 14 a seguir para os consórcios de água de produção.
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Figura 14 Cromatografias à gás dos consórcios de água de produção A1 e A2 para HPAs totais. São mostrados diferentes tipos de HPAs quantificados nos dois consórcios e controle negativo contendo apenas óleo e meio.
A cromatografia gasosa indicou que houve redução de HPAs totais decorrente da degradação para ambos os consórcios (Figura 14). Na amostra do consórcio A1 houve uma redução de mais de 50% comparada ao controle negativo. De forma semelhante também houve diminuição da quantidade de HPAs no consórcio A2 de 17,3 % em relação ao controle negativo. Os testes cromatográficos dos consórcios R1 e R2 são mostrados na figura 15 abaixo.
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Figura 15 Cromatografias à gás dos consórcios de rocha R1 e R2 para HPAs totais. São mostrados os diferentes HPAs que puderam ser quantificados em cada consórcio, comparativamente ao controle negativo sem cultura bacteriana, contendo apenas óleo e meio.
Os resultados cromatográficos dos diferentes HPAs que puderam ser quantificados para os consórcios de R1 e R2, mostram que houve uma redução 68 % do HPA totais no consórcio R1. Enquanto que houve uma redução de 46 % do HPAs no consórcio R2, comparativamente ao controle negativo contendo apenas petróleo e meio mineral. No entanto tais resultados não são estatísticos, pois essas cromatografias são os primeiros e não foram feitas duplicatas experimentais.
47 4.8 Metagenomas
4.8.1 Extração de DNA
Foram realizados diferentes métodos de extração de DNA, conforme foram descritos na tabela 3. Os resultados da quantificação de DNA extraído para cada amostra são apresentados na tabela 5 abaixo.
Tabela 5: Quantificação de DNA extraído de todas as amostras pelo método descrito por (KNAEBEL; CRAWFORD, 1995). Amostra Concentração (ng/µl) Água de produção 15,2 Rocha P2 (966-972m) 4,58 Rocha P2 (1053- 1056m) 32,2 Rocha P1 ( 975 - 985 m) 12,5 Consórcio da Rocha R1(1053 - 1056m) 9,7 Consórcio da Rocha R2 (966-972m) 998
Consórcio de água de produção A1 51
Consórcio de água de produção A2 214
De todos os métodos utilizados, o melhor rendimento observado foi com o método 1 que utilizou o kit comercial PowerMax® Soil DNA Isolation (MO BIO Laboratories, Inc) para água de produção. Já método 2 que utilizou os reagentes fenol, clorofórmio e CTAB (KNAEBEL; CRAWFORD, 1995) foi que apresentou melhor rendimento de DNA das amostras de rocha P1 e P2 bem como para os consórcios bacterianos. No entanto a quantificação e a qualidade do DNA genômico extraído para a rocha G53 não foram suficientes para realizar o
48 sequenciamento do tipo shotgun de genoma complete para essa amostra. Desse modo, tanto a rocha P1 quanto os seu respectivos consórcio (R3) serão submetidos a outra metodologia de seqüenciamento que exija um menor input de DNA.
4.8.2 Dados gerais de bioinformática dos sequenciamentos
Para identificar as comunidades bacterianas da água de produção e das rochas do poço de petróleo bem como dos consórcios R1 e R2 e A1 foi realizado o sequenciamento de genoma completo do tipo shotgun com a plataforma Ion Torrent PGM. As quantidades de dados brutos gerados (reads) para cada amostra sequenciada estão na tabela 6 do anexo III. Tais dados foram submetidos a análise de qualidade em seguida à pipeline de bioinformática com diferentes objetivos. Os resultados após análise e filtragem de dados também se encontram na tabela 6 do anexo III. A seguir na figura 16 é possível observar a quantidade de dados gerados para cada metagenoma e a curva de rarefação de cada comunidade bacteriana sequenciada.
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Figura 16 Curva de rarefação de todas as amostras sequenciadas. Curva simulada no programa MEGAN, realizada com base no número diferentes níveis taxonômicos anotados, versos quantidade de sequencias anotadas.
A análise da curva de rarefação indicou que todos os sequenciamentos realizados apresentaram quantidades de sequências suficientes, mesmo após filtragem de dados, para amostrar a riqueza de espécies existente em cada comunidade. Destaca-se que a quantidade de sequencias necessárias para alcançar a riqueza de espécies da comunidade da água de produção foi maior do que as demais amostras. Além disso, é possível notar também que o metagenoam do consórcio A1 é o menos rico. Após análise de qualidade, filtragem e montagens de contigs, tais sequências foram alinhadas contra bancos de dados não redundantes do NCBI, na figura 17 são apresentados os resultados desses alinhamentos globais para todas as amostras.
Figura 17 A figura mostra as quantidades de sequências identificadas, isto é, que possuem hits (alinharam) contra alguma proteína em banco de dados não redundante do NCBI. Os gráficos mostram as quantidades de sequências identificadas que foram classificadas como pertencentes a algum microrganismo bem como as quantidades de sequências embora identificadas, não foram classificadas como pertencentes algum microrganismo ( com base nos parâmetros estatísticos utilizados). Os gráficos mostram ainda as quantidades de sequências que não foram identificadas
50
nos metagenomas, isto é, as sequências que não tiveram hits com nenhuma proteína ou gene no banco de dados não redundante utilizado.
Como é possível observar na figura 17, a maioria das sequências, por volta de 50 % das sequências das amostras foram identificadas, isto é, apresentaram algum match contra o banco de dados no NCBI. No entanto, em média 30 % dessas sequências identificadas não puderam ser classificadas como pertencentes a nenhum microrganismo depositado no NCBI com base nos parâmetros de identidade, cobertura e e-value estabelecidos. Exceto o consorcio A1 no qual 72% das sequências identificadas foram classificadas como pertencentes há algum microrganismo. Além disso, poucas sequências, média de 26 %, não obtiveram hit algum, ou seja, não foram identificadas nos metagenomas.
4.8.3 Abundância taxonômica ao nível de gênero
Para realizar uma análise quantitativa dos gêneros mais abundantes nos metagenomas, os reads foram comparados contra o banco de dados não redundante do NCBI, conforme anteriormente descrito. Os resultados das sequências identificadas estão na tabela 7 a seguir que mostra a frequência relativa dos gêneros mais abundantes identificados em todas as amostras.
Tabela 7. Gêneros mais abundantes em todas as amostras e suas respectivas frequências.
Água de Produção Rocha P2 (966-972 m) carbonato
Gêneros bacterianos predominantes Frequência relativa (%) Gêneros bacterianos predominantes Frequência relativa (%) Marinobacter 19,81 Halomonas 15,73 Halanaerobium 2,91 Vibrio 11,66 Desulfohalobium 1,73 Halolactibacillus 1,24 Desulfovibrio 0,65 Gracilibacillus 0,52 Halothiobacillus 0,13 Idiomarina 0,5 Halomonas 0,12 Shewanella 0,38
Rocha P2 (1053-1056 m) filito Consórcio R1
Gêneros predominantes Frequência relativa (%) Gêneros predominantes Frequência relativa (%) Halomonas 10,37 Ochrobactrum 12,41
51 Halolactibacillus 7,32 Sphingobacterium 4,39 Vibrio 2,6 Bacillus 1,36 Shewanella 2,37 Brucella 0,86 Bacillus 0,46 Lysinibacillus 0,51 Zunongwangia 0,43 Mesorhizobium 0,14 Amphibacillus 0,34 Rhizobium 0,12 Consórcio R2 Consórcio A1 Gêneros predominantes Frequência
relativa (%) predominantes Gêneros
Frequência relativa (%) Ochrobactrum 25,43 Brevibacillus 50,48 Microbacterium 1,74 Paenibacillus 0,25 Brucella 1,33 Aeribacillus 0,25 Paenibacillus 1,16 Bacillus 0,11 Devosia 0,92 Aneurinibacillus 0,032 Sphingobacterium 0,52 Clostridium 0,024 Mesorhizobium 0,34 Mucor 0,019
Observa-se que não há gêneros predominantes com frequência acima 50 % nas amostras de rocha e água de produção, visto que a maioria dos gêneros identificados apresentam frequência relativamente baixa. No entanto no consórcio R2, 25 % dos reads são classificados como pertencentes ao gênero Ochrobactrum, o que pode ser decorrente do enriquecimento de organismo degradadores neste consórcio. Por outro lado, no consórcio A1 de água de produção houve dominância do gênero Brevibacillus. Além disso, embora esse consórcio apresente predominantemente bactérias, foi identificado o gênero Mucor pertencente ao reino fungi o que possivelmente pode indicar uma associação entre bactérias e fungos biodegradadores. Destaca-se também no consórcio A1 o gênero de bactérias anaeróbicas, embora aerotolerantes, do gênero Clostridium foram cultivadas nesse consórcio.
A figura 18 compara, por meio de diagramas de Venn, todos os gêneros comuns entre os consórcios e suas respectivas amostras das quais foram isolados. É possível observar que houve uma seleção de gêneros específicos entre as rochas e seus respectivos consórcios. Foram identificados 79 gêneros na amostra
52 de rocha fileto, enquanto 50 gêneros na rocha carbonato. Nos consórcios R1 e R2, por outro lado, foram identificados 66 e 72 gêneros, respectivamente. Houveram 7 gêneros comuns tanto entre o consórcio R1 e a rocha filito, figura 18 (A), como também no consórcio R2 e a rocha carbonato, figura 18 (B). Indicando possivelmente que a mesma condição de cultivo utilizada em ambos os consórcios favoreceu populações de microrganismos semellhetes. A figura 18 (C) mostra que os gêneros comons entre o metagenoma de água de produção e o consórcio A1, o qual não houve fase de enriquecimento em meio rico, neste consórcio apenas 11 gêneros favorecidos durante o processo de seleção.
Também foram encontrados gêneros exclusivos aos consórcios, isso possivelmente se deva ao fato que esses microrganismos aeróbicos exclusivos dos consórcios eram pouco abundantes nas amostra de rocha e água de produção ao ponto de não terem sido detectados pelo sequenciamento, dessa forma, o processo de enriquecimento usando a pressão seletiva (petróleo como única fonte de carbono) e de modo aeróbico fez com que tais gêneros se tornassem abundantes nos consórcios.
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Figura 18 Em A, diagramas de Venn entre os gêneros comuns do consórcio R1 ( preparado a partir da rocha filito), comparativamente aos gêneros do metagenoma da rocha filito. Em B diagramas de Venn entre os gêneros comuns do consórcio R2 ( preparado a partir da rocha carbonática), comparativamente aos gêneros do metagenoma da rocha carbonática. Na figura C, diagramas de Venn entre os gêneros comuns do consórcio A1 (preparado a partir da água de produção), comparativamente aos gêneros do metagenoma de água de produção.
A figura 19 mostra os gêneros comuns entre os três consórcios bem como entre os metagenomas das amostras de rocha filito, carbonato e água de produção. Entre os consórcios de rocha, 35 gêneros são comuns entre eles, figura 19 (A).
Desse modo, existem mais gêneros comuns produtores de biossurfactantes e degradadores de petróleo entre os consórcios de rochas do que entre eles e o consórcio de água de produção (Figura 19 A).
Na figura 19 (B), o metagenoma de água de produção apresenta um número maior com 86 gêneros, comparativamente aos metagenomas de rochas, sendo que 50 gêneros são exclusivos do metagenoma de água de produção. Nota-se ainda que a comunidade bacteriana da água de produção é similar taxonomicamente a rocha filito, visto que 34 gêneros pertencentes a rocha filito são comuns aos
54 gêneros pertencentes a água de produção, isso se deva provavelmente, a profundidade similar entre essas duas amostras. Diferentemente da rocha carbonática que mostrou ser mais distinta da comunidade da água de produção, apresentando apenas 24 gêneros comuns entre essas duas amostras, sendo que 3 gêneros são exclusivos da amostra de rocha carbonática. Enquanto que entre todos os três metagenomas houve 21 gêneros comuns.
Figura 19 Em A, são apresentados os diagramas dos gêneros comuns entre os metagenomas dos consórcios R1, R2 e A1. Em B, os diagramas entre os gêneros comuns dos metagenomas de rochas e água de produção.
Comparando os consórcios sequenciados com suas respectivas faixas de rocha das quais foram isolados, podemos verificar quais gêneros foram favorecidos durante o preparo dos consórcios. A figura 20 mostra quais gêneros são mais predominantes estatisticamente no consórcio R1 em comparação a rocha filito de 1053 à 1056 m de profundidade.
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Figura 20 Comparação taxonômica ao nível de gênero para os metagenomas da rocha filito e do consórcio R1. São apresentado apenas as comparações significativas.
Os gêneros Sphingobacterium, Ochrobactrum, Bacillus, Brucella e
Lysinibacillus são significativamente mais abundantes no consórcio R1 (Figura 20).
De modo semelhante, o consórcio R2 apresenta os três gêneros Ochrobactrum,
Brucella e Sphingobacterium comuns ao consórcio R1, figura 21. Todavia o
consórcio R2 apresenta exclusivamente, em relação ao R1, os gêneros
Microbacterium, Devosia, Mesorhizobiume e Paenibacillus mais predominantes
(Figura 21). Em ambos os consórcios o gênero dominante identificado foi
Ochrobactrum (Figuras 20 e 21).
Figura 21 Comparação taxonômica ao nível de gênero para os metagenomas da rocha carbonática e do consórcio R2. São apresentadas apenas as comparações significativas.
56 Os cinco gêneros Idiomarina, Shewanella, Halomonas, Halolactibacillus e
Vibrio, foram comuns e mais abundantes em ambas amostras de rocha, figuras 20
e 21, destacando que nas duas rochas o gênero Halomonas é dominante. Por outro lado os gêneros Zunongwangia, Amphibacillus são exclusivos da rocha 1053 à 1056 m (Figura 20), enquanto os gêneros Marinobacter e Gracilibacillus foram exclusivos da rocha 966 à 972m, figura 21.
Figura 22 Comparação taxonômica ao nível de gênero para os metagenomas do consórcio A1 e da água de produção. São apresentadas apenas as comparações e diferenças significativas.
Na figura 22, é possível notar que a predominância do gêneros Marinobacter na amostra de água de produção. Além disso, bactérias resultaras de sulfato assim como anaeróbicas presentes na água de produção nos gêneros Desulfohalobium,
Halamaerobium, Desulfovribrio não foram isoladas no consórcio A1 no qual há
predominâncias dos gêneros aeróbicos Brevibacillus e Paenibacillus. A figura 23 a seguir mostra a comparação entre os dois consórcios de rocha.
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Figura 23 Comparação entre os dois consórcios R1 e R2 ao nível de gênero. São apresentadas apenas as comparações e diferenças significativas.
Os gêneros Microbacterium, Ochrobactrum, Devosia e Paenibacillus são mais abundantes no consórcio R2, enquanto no consórcio R1 os gêneros
Sphingobacterium, Bacillus e Lysinibacillus são mais predominantes.
4.8.4 Análise comparativa taxonômica ao nível de espécies
Para confirmar as análises quantitativas utilizando reads, foram realizadas montagens de contigs dos metagenomas e esses também foram alinhados contra o banco de dados para refinar as anotações gênicas e predições de ORFs. Os números totais de contigs montados bem como o tamanho médio e o número de contigs com tamanho superior N50 utilizados nessas análises estão na tabela 4 do anexo III desse trabalho. Os resultados dos alinhamentos contra o banco global não redundante, usando como input as sequencias de contigs, após montagens de genomas dos consórcios bacterianos de rocha, confirmam as espécies mais abundantes nos consórcios e nas suas respectivas faixas de rocha das quais foram preparados. Conforme o gráfico da figura 24, observa-se a comparação das espécies mais abundantes no consórcio R2 comparativamente a rocha do qual foi isolado.
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Figura 24 Comparação entre espécies presentes nas amostras de consórcio R2 de rocha do poço P2 (966 -972 m) e sua respectiva rocha proveniente, rocha P2 (966 -972 m), utilizando contigs. São apresentadas apenas as comparações e diferenças significativas.
Nota-se que, dentre as espécies que puderam ser identificadas, as espécies mais abundantes na rocha P2 (966 -972 m) são Gracilibacilus lacisalsi,
Halolactibacilus sp bem como predominantemente contigs ao nível de espécies que
não poderão ser classificadas taxonomicamente (Not assignment). Assim como na rocha, no consórcio R2 houve a predominância de contigs not assignment, os quais podem pertencer espécies não identificadas nos bancos de dados utilizados nas análises desse trabalho. Além do mais, a metodologia de seleção utilizada no consórcio foi capaz de isolar nesta amostra as espécies de Ochrobactrum e
Paennibacilus, as quais têm sido descritas como degradadoras de hidrocarbonetos
do petróleo e produtoras de biossurfactantes, confirmando que a pressão seletiva criada durante as fases de obtenção dos consórcios microbianos foi eficiente.
A figura 25 a seguir, mostra a comparação das espécies mais abundantes no consórcio R1 em comparação com a faixa de rocha P2 filito (1053 – 1056 m).
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Figura 25 Comparação entre espécies presentes nas amostras de consórcio R1 de rocha do poço P2 (1053 – 1056 m) e sua respectiva rocha de onde foi isolado, rocha P2 (1053 - 1056 m). São apresentadas apenas as comparações e diferenças significativas.
Como é possível observar na figura 25, a comunidade da rocha P2 (1053 – 1056 m) apresenta as espécies mais abundantes, como Shewanella sp.,
Shingobacterium sp., Halolactibacillus sp., e Amphibacillus jilinensis.
Semelhantemente ao consórcio o R2, o consórcio R1 também isolou predominantemente as bactérias Ochrobactrum sp. No entanto, na amostra R1 houve a presença exclusiva das espécies Bacilus luchniformes, Sphingobacterium
sp, e Lysinibacillus sp.
As análises comparativas entre as rochas e água de produção, mostram a riqueza de espécies existente nas comunidades dos reservatórios (Figura 26).
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Figura 26 Comparação taxonômica ao nível de espécies para os metagenomas de água de produção e rocha carbonática. Neste gráfico são apresentadas apenas as comparações e diferenças significativas.
A comunidade residente na água produção é predominantemente não identificada, no entanto apresenta ainda as espécies Marinobacter sp e
Desulfohalobium retbaense, Pelobacter carbinolocus, Halothiobacillus sp,
Desulfovibrio gigas e Flexistipes sinusarabici como abundantes. Igualmente a água
de produção, a rocha carbonática apresenta a maioria dos contigs como não identificados (not assignment). Dentre as espécies que puderam ser identificadas, a mais abundantes na comunidade da rocha carbonato estão presentes as espécies
Halolactibacillus sp, Gracilibacillus lacisaisi, Halomonas hydrothermalis, Vibrio natriegens, Shewanella sp. e Flexistips sinusarabici. A figura 27 a seguir mostra a
61
Figura 27 Comparação taxonômica ao nível de espécies para os metagenomas de água de produção e rocha filito. Neste gráfico são apresentadas apenas as comparações e diferenças significativas.
As espécies Marinobacter sp e Desulfohalobium retbaense ainda continuam predominantes na água de produção, assim como a espécie Halolactibacillus sp é também mais predominante na rocha filito de 1053 à 1056 m. Porém, a rocha 1053 à 1056 apresentou outras espécies exclusivas, como Amphibacillus jilinesis.
4.8.5 Análise funcional
Com intuito de analisar funcionalmente os genes e via metabólicas de interesse nas amostras, os contigs foram alinhados contra o banco de proteínas customizado BIOSURFDB. Na figura 28 a seguir, é possível observar o resultado da anotação funcional entre o consórcio de água de produção A1, comparativamente ao metagenoma de água de produção.
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Figura 28 Comparação funcional a nível de vias metabólicas do consórcio A1 com o metagenoma de água de produção. Apenas resultados significativos são mostrados.
É possível verificar que houver significativo enriquecimento de vias de degradação hidrocarbonetos no consórcio A1 bem como de vias de biossurfactantes iturina A e lichenysin. Em contrapartida, houver significativa abundancia de vias relacionadas ao metabolismos de enxofre, como redução de sulfato no metagenoma de água de produção.
Os resultados da figura 29 comparam ao nível de metabolismo as amostras do consórcio R1 com sua respetiva rocha que foi isolado.
Figura 29 Comparação funcional a nível de vias metabólicas do consórcio R1 com a rocha filito de 1053 à 1056 m. Apenas resultados significativos são mostrados.
63 O perfil metabólico do consórcio mostra que houve um enriquecimento para vias de degradação de hidrocarbonetos lineares significativamente no consórcio R1, comparado a rocha 1053 à 1056 m, assim como houve o favorecimento de vias de degradação de compostos aromáticos como Naftaleno e Fluorbenzeno. Além do mais, as vias de biossíntese das moléculas biossurfactantes Lichenysin e Plipastatin mostraram significativo enriquecimento no consórcio R1. A figura 30 apresenta o perfil metabólico do consórcio R2, comparativamente a rocha 966 à 972 m.
Figura 30 Comparação funcional a nível de vias metabólicas do consórcio R2 com a rocha carbonato de 966 à 972 m. Apenas diferenças significativas são mostradas nesse gráfico.
Nota-se que as vias de degradação de compostos aromáticos como Fluorbenzoato assim como a via de possíveis genes não identificados para um substrato especifico ou via ( Generic Degradation Pathway ) mostram mais predominância. Da mesma forma a vias de biossíntese do biossurfactante Putisolvins bem como de Streptomycine são abundantes. No consórcio R2 houve também expressivo favorecimento de genes envolvidos no metabolismo de enxofre.
Os resultados comparativos entre a amostra bruta e os consórcios derivados destas amostras corroboram com os testes funcionais realizados para detectar a habilidade de degradação de petróleo e biossíntese de surfactantes e confirmam mais uma vez o sucesso da estratégia de obtenção dos consórcios microbianos.
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Figura 31 Comparação funcional a nível vias metabólicas entre água de produção e a rocha carbonática. Apenas diferenças significativas são mostradas nesse gráfico.
Na comparação metabólica entre a rocha 966 à 972 m com a água de produção (Figura 31) é possível observar que as vias de degradação de compostos aromáticos e cíclicos, como tolueno, clorociclohexano e benzeno são predominantes na comunidade proveniente da água de produção. Além de vias de síntese de antibióticos como streptomicina e vancomicina que são mais abundantes nessa comunidade. Diferentemente, a comunidade rocha 966 à 972 m