Caracterização da comunidade microbiana de reservatório de petróleo

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

WYDEMBERG JOSÉ DE ARAÚJO

CARACTERIZAÇÃO DA COMUNIDADE MICROBIANA DE

RESERVATÓRIO DE PETRÓLEO

NATAL

2017

WYDEMBERG JOSÉ DE ARAÚJO

CARACTERIZAÇÃO DA COMUNIDADE MICROBIANA DE

RESERVATÓRIO DE PETRÓLEO

Dissertação apresentada ao

Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica.

Orientador: Lucymara Fassarella Agnez-Lima.

NATAL

2017

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson -Centro de Biociências - CB

Araújo, Wydemberg José.

Caracterização da comunidade microbiana de reservatório de petróleo / Wydemberg José de Araújo. - Natal, 2017.

119 f.: il.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-graduação em Bioquímica.

Orientadora: Profa. Dra. Lucymara Fassarella Agnez-Lima.

1. Biotecnologia - Dissertação. 2. Metagenoma - Dissertação. 3. Microbiologia - Dissertação. 4. Petróleo - Dissertação. 5. Degradação - Dissertação. I. Agnez-Lima, Lucymara Fassarella. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.

Dedico esta obra

AGRADECIMENTOS

Às agências de fomento CNPq, CAPES e PetroleoBras pelo suporte financeiro a este trabalho.

Agradeço a minha orientadora Lucymara Fassarella Agnez Lima pela paciência e acima de tudo pelos bons puxões de orelha que me orientam.

Ao Departamento de Biologia Celular e Genética da UFRN pela infraestrutura disponibilizada para o desenvolvimento deste trabalho

Agradeço e dedico esse trabalho aos meus pais que sempre se esforçaram para que eu estudasse.

A Paulo Honório pelo companheirismo desde o início deste trabalho e por me ajudar sempre de todas as formas.

As minhas Pós-doc Rita Portela, Carol Minicelli e Marbela Fonseca pela ajuda e esforço durante esse trabalho acima de tudo pela amizade.

A Sinara Carla e Alaine Guerra por me ensinarem desde a iniciação científica.

Agradeço a Jorge Oliveira por me ensinar e contribuir neste trabalho sobretudo pela amizade.

À Fabrícia Fontes, Marcos Felipe, Ana Rafaela e Daniel Chaves pelas dicas e conselhos científicos.

Aos professores do DBQ por todos os conhecimentos transmitidos durante o curso.

Aos colegas de classe pela amizade e carinho.

“Somos todos loucos, caso contrário não teríamos chegado até aqui.”

RESUMO

Os processos bioquímicos de origem microbiana atuantes nos reservatórios de petróleo exercem grande impacto na extração, estocagem e refino do petróleo. No entanto o conhecimento a respeito desse metabolismo e diversidade microbiana é escasso devido as limitações das técnicas de cultivo e identificação microbiológicas baseadas apenas nas características morfológicas e culturais. Desse modo, a metagenômica é uma inovadora ferramenta para estudar, independentemente de cultivo, as comunidades microbianas existentes em reservatório de petróleo. Essa metodologia ainda permite identificar genes e organismos com aplicações biotecnológicas nos processos e impactos decorrentes das comunidades microbianas exercem sobre a qualidade do petróleo. O presente estudo teve como objetivo identificar, tanto taxonomicamente quanto funcionalmente, as comunidades bacterianas de poços de petróleo e as populações envolvidas na degradação de petróleo e produção de moléculas surfactantes. Para tanto, amostras de água de produção e rochas de reservatório foram submetidas a extração de DNA bem como preparação de consórcios bacterianos submetidos a uma seleção de organismos degradadores de petróleo e produtores de surfactantes. Posteriormente todas as amostras foram sequenciadas por meio de plataforma de sequenciamento de segunda geração. Os resultados de bioinformática mostraram que comunidades residentes nas rochas e água de produção eram predominantemente pertencentes aos gêneros

Halomonas e Marinobacter, respectivamente. Os resultados da seleção dos

consórcios mostraram a predominância de gêneros degradadores e produtores de biosurfactantes Microbacterium, Ochrobactrum, Devosia e Paenibacillus no consórcio microbiano R2, enquanto os gêneros Sphingobacterium, Bacillus e

Lysinibacillus predominaram no consórcio R1. Os gêneros predominantes no

consórcio bacteriano de água de produção A1 foram Brevibacillus, Aeribacillus e Paenibacillus. Os testes funcionais mostraram que tais consórcios são produtores de biossurfactantes capazes de estabilizar uma emulsão bem como reduzir a tensão interfacial entre petróleo e água. Utilizando comparações por homologia com banco de dados de proteínas customizado foi possível identificar que as moléculas surfactantes eram sintetizadas pelos operons Lichenysin, Plipastatin, Iturina A e Pultisolvin. Esses dados corroboraram os testes de degradação por meio do indicador redox, mostrando que houve predominância das vias de degradação de alcanos lineares, bem como de policicloaromáticos. Portanto, os resultados indicam que consórcios isolados de reservatório são capazes de aumentar a fluidez do óleo ao degradá-lo bem como ao produzir moléculas surfactantes, desse modo possuem um importante potencial de aplicação biotecnológica.

ABSTRACT

The bacterial is metabolically diverse and represents a huge source of molecules with new biotechnological applications. Although this kingdom it is very rich, microbiological techniques of cultivation and identification are limited to access and identify this favorable source. Soon metagenomics stands out as an innovative tool to study bacterial communities independently of cultivation, and in addition, to extract new proteins and organisms with biotechnological application. The present study aimed to identify, both taxonomically and functionally, microorganisms residing in the bacterial community of petroleum wells involved in the degradation of oil and the production of surfactant molecules. To do so, samples of production water and well rocks are subjected to DNA extraction, as well as the preparation of cultures subjected to selection of petroleum degrading organisms and surfactant producers. Subsequently, all samples were sequenced through new generation sequencing platforms. The bioinformatics results show that the communities living in the rocks and in the production water were predominantly belonging to the Halomonas and Marinobacter genera, respectively. While the results of the consortia classification show a predominance of degrading and biosurfactant producers of genera Microbacterium, Ochrobactrum, Devosia and Paenibacillus in the R2 consortium, and Sphingobacterium, Bacillus and Lysinibacillus in the R1 consortium. Functional tests show that such bacteria are producers of biosurfactants to stabilize an emulsion as well as reduce interfacial tension between oil and water. Using homology comparisons with a protein custom database, it was possible to identify that such surfactant molecules were synthesized in Lichenysin, Plipastatin and Pultisolvin operons. This data refers to the degradation tests by means of the oxy-redox indicator, showing that there was predominance of degradation routes of linear as well as polycycloaromatic alkanes. These results indicate that isolated reservoir consortia have potential to increase the fluidity of the oil by degrading it, as well as the production of surfactants that significantly reduce the interfacial tension between water and oil, therefore showing potential for biotechnological application.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Esquema ilustrativo da via de degradação de alcanos lineares por meio das enzimas Alcano Monooxigenase (AH); Álcool Desidrogenase (AD); Aldeído Desidrogenase (ALDc) e Acetil Sintetase (ACD)... 6 Figura 2 Diagrama de Venn interdisciplinar, ilustrando a intersecção das áreas de conhecimento envolvidas na metagômica. ... 9 Figura 3 Esquema ilustrativo das duas abordagens metagenômicas, figura adaptada de HANDELSMAN (2004). ... 10 Figura 4 . Fluxograma da metodologia utilizada neste trabalho. Amostras brutas de rocha e água de produção foram submetidos a duas pipelines de trabalho. Uma de sequenciamento direto do DNA ambiental e outra de preparo de consórcio bacterianos que foram posteriormente sequenciados. ... 17 Figura 5 Procedimento de preparo de consórcios bacterianos: em amarelo representa as três primeiras semanas de enriquecimento em meio rico, seguido das três últimas semanas de seleção, representado pela cor cinza para o meio pobre (BH) contendo apenas 1% de petróleo. ... 19 Figura 6 Foto ilustrativa do teste de tensão interfacial utilizando o tensiômetro da DVT50, indicando a fase hidrofílica (amostra) e fase hidrofóbica analisadas (petróleo). ... 27 Figura 7 Fluxograma da pipeline de bioinformática usada com diferentes programas para a análise de dados dos sequenciamentos. Apresentando as diferentes abordagens utilizadas após fase de análise de qualidade de dados. A abordagem not-assembly utilizando reads bem como a abordagem assembly utilizando contigs. ... 32 Figura 8 Curvas de crescimento dos consórcios de água de produção A1 e A2 à 30 °C. Em A, o consórcio A1, e o seu controle C1 negativo contendo meio e petróleo sem adição de cultura e o controle C-A1 com consórcio A1 e meio BH sem adição de petróleo. Em (B) o consórcio A2, controle C1 contendo meio e petróleo sem adição de cultura e controle C-A2 com consórcio A2 e meio BH sem adição de petróleo. ... 37

Figura 9 Curva de crescimento bacteriano dos consórcios de rocha R1 e R2 crescidos em meio BH, contendo apenas 1 % de petróleo com única fonte de carbono à 37 ºC. Em (A) curva do consórcio R1, tendo como controle negativo C1 contendo somente meio mineral e óleo bem como o controle C-R1 contendo cultura bacteriana R1 sem fonte de carbono. Em (B) curva do consórcio R2, controle negativo C1 contendo apenas petróleo e meio mineral e controle C-R2 contendo cultura bacteriana R2 sem fonte de carbono. ... 38 Figura 10 . Ensaio de dispersão do óleo. (A) Sobrenadante do consórcio R2 comparado ao controle positivo SDS 1 % e controle negativo meio mineral BH. Em (B), sobrenadante do consórcio R1 comparado ao controle positivo SDS 1 % e controle negativo meio mineral BH. ... 40 Figura 11 Ensaio de emulsificação dos consórcios R1 em (A) e R2 em (B). Os ensaios foram realizados tendo o SDS 1 % como controle positivo. Em (C) são apresentados os índices de emulsificação dos consórcios de rocha R1 e R2 ao longo de 13 dias de cultivo, comparativamente a emulsão formada pelo controle positivo SDS 1 %. ... 41 Figura 12 Em A, avaliação da tensão interfacial ao longo do tempo dos consórcios de água de produção A1 e A2, comparadas ao controle positivo, o surfactante sintético SDS 1 % bem como ao controle negativo contendo meio BH e óleo. Diferenças estatísticas, comparadas ao controle negativo, considerando P value < 0,05. Em (B) avaliação da tensão interfacial ao longo do tempo dos consórcios de rocha R1 e R2, comparadas ao controle positivo o surfactante sintético SDS 1 % bem como ao controle negativo contendo meio BH e óleo. Diferenças estatísticas, comparadas ao controle negativo, considerando P value < 0,05. ... 42 Figura 13 Teste de degradação de hidrocarbonetos com indicador DCPIP. Em A) Controle positivo com glicose (C+gli); Consórcios R1 com petróleo (Pet+R1); Controle negativo sem fonte de carbono com o consórcio de rocha R1(C-pet); Controle negativo com petróleo (C+pet) e controle negativo do meio BH e o reagente DCPIP(C+BH). Em B) Controle positivo com glicose (C+gli); Consórcios R2 com petróleo (Pet+R2); Controle negativo sem fonte de carbono com o consórcio de rocha R2(C-pet); Controle negativo com petróleo (C+pet) e controle negativo do meio BH e o indicador DCPIP (C+BH). ... 44

Figura 14 Cromatografias à gás dos consórcios de água de produção A1 e A2 para HPAs totais. São mostrados diferentes tipos de HPAs quantificados nos dois consórcios e controle negativo contendo apenas óleo e meio. ... 45 Figura 15 Cromatografias à gás dos consórcios de rocha R1 e R2 para HPAs totais. São mostrados os diferentes HPAs que puderam ser quantificados em cada consórcio, comparativamente ao controle negativo sem cultura bacteriana, contendo apenas óleo e meio. ... 46 Figura 16 Curva de rarefação de todas as amostras sequenciadas. Curva simulada no programa MEGAN, realizada com base no número diferentes níveis taxonômicos anotados, versos quantidade de sequencias anotadas. ... 49 Figura 17 A figura mostra as quantidades de sequências identificadas, isto é, que possuem hits (alinharam) contra alguma proteína em banco de dados não redundante do NCBI. Os gráficos mostram as quantidades de sequências identificadas que foram classificadas como pertencentes a algum microrganismo bem como as quantidades de sequências embora identificadas, não foram classificadas como pertencentes algum microrganismo ( com base nos parâmetros estatísticos utilizados). Os gráficos mostram ainda as quantidades de sequências que não foram identificadas nos metagenomas, isto é, as sequências que não tiveram hits com nenhuma proteína ou gene no banco de dados não redundante utilizado. ... 49 Figura 18 Em A, diagramas de Venn entre os gêneros comuns do consórcio R1 ( preparado a partir da rocha filito), comparativamente aos gêneros do metagenoma da rocha filito. Em B diagramas de Venn entre os gêneros comuns do consórcio R2 ( preparado a partir da rocha carbonática), comparativamente aos gêneros do metagenoma da rocha carbonática. Na figura C, diagramas de Venn entre os gêneros comuns do consórcio A1 (preparado a partir da água de produção), comparativamente aos gêneros do metagenoma de água de produção. ... 53 Figura 19 Em A, são apresentados os diagramas dos gêneros comuns entre os metagenomas dos consórcios R1, R2 e A1. Em B, os diagramas entre os gêneros comuns dos metagenomas de rochas e água de produção. ... 54 Figura 20 Comparação taxonômica ao nível de gênero para os metagenomas da rocha filito e do consórcio R1. São apresentado apenas as comparações significativas. ... 55

Figura 21 Comparação taxonômica ao nível de gênero para os metagenomas da rocha carbonática e do consórcio R2. São apresentadas apenas as comparações significativas. ... 55 Figura 22 Comparação taxonômica ao nível de gênero para os metagenomas do consórcio A1 e da água de produção. São apresentadas apenas as comparações e diferenças significativas. ... 56 Figura 23 Comparação entre os dois consórcios R1 e R2 ao nível de gênero. São apresentadas apenas as comparações e diferenças significativas... 57 Figura 24 Comparação entre espécies presentes nas amostras de consórcio R2 de rocha do poço P2 (966 972 m) e sua respectiva rocha proveniente, rocha P2 (966 -972 m), utilizando contigs. São apresentadas apenas as comparações e diferenças significativas. ... 58 Figura 25 Comparação entre espécies presentes nas amostras de consórcio R1 de rocha do poço P2 (1053 – 1056 m) e sua respectiva rocha de onde foi isolado, rocha P2 (1053 - 1056 m). São apresentadas apenas as comparações e diferenças significativas. ... 59 Figura 26 Comparação taxonômica ao nível de espécies para os metagenomas de água de produção e rocha carbonática. Neste gráfico são apresentadas apenas as comparações e diferenças significativas. ... 60 Figura 27 Comparação taxonômica ao nível de espécies para os metagenomas de água de produção e rocha filito. Neste gráfico são apresentadas apenas as comparações e diferenças significativas. ... 61 Figura 28 Comparação funcional a nível de vias metabólicas do consórcio A1 com o metagenoma de água de produção. Apenas resultados significativos são mostrados. ... 62 Figura 29 Comparação funcional a nível de vias metabólicas do consórcio R1 com a rocha filito de 1053 à 1056 m. Apenas resultados significativos são mostrados. ... 62 Figura 30 Comparação funcional a nível de vias metabólicas do consórcio R2 com a rocha carbonato de 966 à 972 m. Apenas diferenças significativas são mostradas nesse gráfico. ... 63 Figura 31 Comparação funcional a nível vias metabólicas entre água de produção e a rocha carbonática. Apenas diferenças significativas são mostradas nesse gráfico. ... 64

Figura 32 Comparação funcional a nível vias metabólicas entre água de produção e a rocha filito. Apenas as diferenças significativas são apresentadas. ... 65 Figura 33 Comparação funcional entre os consórcios R1 e R2, a penas as diferenças significativas são apresentadas. ... 65 Figura 34 Resultados da anotação contra o BIOSSURFDB dos operons nos genomas de referência de Ochrobactrum depositados no NCBI. ... 66 Figura 35 Vias de biossurfactantes de Ochrobactrum anotadas nos consórcios. ... 67

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 Localização geográfica dos poços P1 e P2 e as respectivas datas de coleta e recebimento no laboratório...16 TABELA 2 Tabela apresenta todos os consórcios preparados durante esse trabalho bem como de qual poço as amostras eram provenientes para isolar os microrganismos e os modos de preparo...20 TABELA 3 Métodos de extração e DNA testados neste trabalho para extrair DNA de

microrganismos presentes em rochas de

reservatório... ...23

TABELA 4 consórcios obtidos em diferentes meios de cultivo durante as fases de enriquecimento e seleção bem com a descrição da observação de crescimento (+) ou não ( - ) nas respectivas fases. Consórcios selecionados para testes funcionais e sequenciamento (*)...35 TABELA 5 Quantificação de DNA extraído de todas as amostras pelo método descrito por (KNAEBEL; CRAWFORD, 1995)...47 TABELA 6 Dados gerais dos sequenciamento e análises de alinhamentos,

montagens e predições de

TABELA7 Gêneros mais abundantes em todas as amostras e suas respectivas frequências...50 TABELA 8 Genomas de referência baixados do NCBI e suas respectivas referências do NCBI... ...101

LISTA DE ABREVIATURAS / SIGLAS

(E24%) Índice de emulsificação após 24 horas ACD Acetil Sintetase

AD Álcool Desidrogenase AH Alcano Monooxigenase ALDc Aldeído Desidrogenase

AM Água do mar artificial BH Bushnell Haas CG Circlegrow

CTAB Cetyltrimethyl Ammonium Bromide DCPIP 2,6-diclorofenol indofenol

DGGE Eletroforese em Gel de Gradiente Desnaturante

DO Densidade Óptica

FISH Hibridização por Fluorescente in Situ

LB Lysogeny Broth

NGS New Generation Sequencing

PAHs Polycyclic Aromatic Hydrocarbon PCR Reação em Cadeia da Polimerase

PEG Polietilenoglicol

PERL Practical Extraction and Report Language

SDS Dodecil sulfato de sódio SRB Sulfate-reducing bacteria

STAMP Statistical Analyse of Metagenomic Profiles YPD Yeast Extract Peptone Dextrose

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 1 1.1 Microbiologia de reservatório de petróleo 1

1.2 Exploração do petróleo 2 1.3 Redução de enxofre 3 1.4 Metanogênese 4 1.5 Degradação de Hidrocarbonetos 5 1.6 Biossurfactantes 7 1.7 Metagenômica 8

1.8 Bioinformática aplicada em análises metagenômicas 11

1.9 Metagenomica de reservatório de petróleo 13

2 OBJETIVOS GERAIS 15

2.1 Objetivos específicos 15

3 MATERIAL E MÉTODOS 15

3.2 Lavagem do rocha 18

3.3 Preparo de consórcios de água de produção e rocha 18

3.4 Estoque e congelamento 22

3.5 Curvas de crescimento dos consórcios de bactérias

3.6 Extração de DNA de microrganismos da água de produção 22

3.7 Extração de DNA de rochas dos poços P1 e P2 23

3.8 Extração de DNA consórcios bacterianos 24 3.9 Avaliação quantitativa e qualitativa do DNA 24

3.10 Ensaio de dispersão do óleo 25

3.11 Ensaio de emulsificação 25

3.12 Avaliação da tensão interfacial 26

3.13 Ensaio de degradação de hidrocarbonetos 27

3.14 Cromatografias 28 3.15 Sequenciamento de DNA 29 3.16 Análises de Bioinformática 31 3.17 Análises Estatísticas 34 4 RESULTADOS 35 4.1 Obtenção de consórcios 35

4.2 Curvas de crescimento dos consórcios de bactérias 35

4.3 Ensaio de dispersão de óleo 40

4.4 Ensaio de emulsificação dos consórcios de rocha 40

4.5 Análise de tensão interfacial de consórcios 42

4.6 Teste de degradação com indicador redox 43

4.8 Metagenomas 47

4.8.1 Extração de DNA 47

4.8.2 Dados de Sequenciamento 47

4.8.3 Abundância taxonômica ao nível de gênero 50 4.8.4 Análise comparativa taxonômica ao nível de espécies 47 4.8.5 Análise funcional 61 5 DISCUSSÃO 67 6 CONCLUSÂO 84 7 PERSPECTIVAS 86 8 REFERÊNCIAS 86 9 ANEXOS 97

1 1.1 Microbiologia de reservatório de petróleo

O petróleo é a principal fonte energética mundial, como recurso não renovável, exige continuo investimento cientifico e tecnológico para sua exploração (ADMINISTRATION; U.S. ENERGY INFORMATION ADMINISTRATION, 2017). Os processos bioquímicos de origem microbiana presentes nos reservatórios de petróleo exercem grande impacto na produção, estocagem e refino do petróleo (BROWN, 2010). No entanto o conhecimento a respeito desses processos metabólicos e a diversidade microbiana presente nos reservatórios ainda é escasso devido as limitações das técnicas microbianas de cultivo e identificação tradicionais.

Em uma comunidade bacteriana, os microrganismos interagem de diferentes formas, estabelecem tanto relações de competição, quanto de cooperação. As diferentes interações metabólicas da comunidade de reservatório de petróleo envolvem principalmente vias inter-relacionadas de grande interesse para indústria petroquímica com metabolismo de hidrocarbonetos, síntese de biossurfactantes, metanogênese, metabolismo de enxofre e nitrogênio (GIEG et al., 2010; TAN et al., 2015). Diversos fatores físico-químicos como temperatura, pH, pressão, salinidade, características geológicas bem como processos de exploração e recuperação do óleo influenciam como também são influenciados pela riqueza da comunidade microbiológica do reservatório de petróleo.

Espécies dos gêneros Mycobacterium, Paenibacillus. Klebsiella que tanto são capazes de desulforizar o petróleo quanto são capazes de degradar hidrocarbonetos e produzir moléculas surfactantes são geralmente encontradas na comunidade de reservatórios de petróleo (VAN HAMME; SINGH; WARD, 2003). Metanogênese, oxidação de metano, redução de sulfato e nitrato de ferro também são processos comuns nos reservatórios. Esses diferentes processos são relacionados, pois compartilham organismos, vias, enzimas e substratos comuns a degradação de hidrocarbonetos (ORPHAN et al., 2000). Ademais, existem uma

2 larga distribuição de microrganismos termofílicos produtores de metano que utilizam enxofre, em reservatórios de óleo, com potencial participação ativa em outros metabolismos biogeoquímicos do carbono, hidrogênio e enxofre in situ (ORPHAN et al., 2000).

No entanto nosso conhecimento acerca dessas complexas relações das comunidades dos reservatórios ainda é limitada devido a dificuldades de recuperação dessa microbiota de um ambiente tão extremo (HANDELSMAN, 2004; SIERRA-GARCIA et al., 2014). As técnicas convencionais de cultivo são limitadas para acessar essa diversidade, fazendo necessário, portanto, o uso de ferramentas independentes de cultivo, como a metagenômica para estudar, identificar, comparar e correlacionar potencial metabólico e biotecnológico dos microrganismos das comunidades de reservatórios de petróleo.

1.2 Exploração do petróleo

Cada reservatório é resultado de um conjunto de características petrofísicas formadas ao longo de sua evolução geológica, em particular das condições de sedimentação e dos fenômenos de diagênese. Os reservatórios são constituídos por rochas que possuem porosidade e permeabilidade que permitem a circulação dos hidrocarbonetos e água (PLANCKAERT, 2005). A essa rocha está associada a comunidade microbiana. Quando um poço é perfurado a água (água de produção) e óleo são expelidos devido a energia natural do poço, sendo essa produção conhecida como primária. No entanto ao decorrer da exploração, a pressão do reservatório diminui, fazendo necessário a injeção de água expelida do poço (água de produção) ou de água do mar para repressurizar o reservatório, metodologia essa conhecida como produção secundária (PLANCKAERT, 2005). Por último, metodologias, ditas como recuperação avançada ou produção terciária de poço já maduros, tentam extrair o óleo residual por meio da injeção de polímeros, CO2, surfactantes e até mesmo microrganismos (SHIBULAL et al., 2014). No entanto tais metodologias de recuperação residual exercem grande impacto na comunidade

3 microbiana autóctone por introduzir contaminação externa ao reservatório (MAGOT; OLLIVIER; PATEL, 2000). Dessa forma é necessário o conhecimento acerca dos processos metabólicos da comunidade microbiológica dos reservatórios de modo que seja possível prevenir, controlar ou até mesmo inibir os possíveis impactos decorrentes da extração bem como recuperação do óleo residual

1.3 Redução de enxofre

Bactérias redutoras de sulfato (SRB) são responsáveis pela produção de sulfito de hidrogênio (H2S) a partir do íon sulfeto e hidrogênio molecular de modo anaeróbico nos reservatórios (BARTON; FAUQUE, 2009). Essa produção de H2S reduz a qualidade do óleo além de promover corrosão de ductos de extração de óleo e instalações além de ser uma substância potencialmente tóxica (BARTON; FAUQUE, 2009; MAGOT; OLLIVIER; PATEL, 2000).

A capacidade de redução de sulfato é identificada em quatro diferentes filos de bactérias (Proteobacteria, Firmicutes, Nitrospira, e Thermodesulfobacterium) bem como nos filos Euryarchaeota e Crenarchaeota do domínio Archaea (YOUSSEF; ELSHAHED; MCINERNEY, 2009).

As Proteobactérias redutoras de sulfato isoladas de reservatórios de óleo, principalmente em amostras de água de produção, são geralmente membros das ordens Desulfovibrionales, Desulfobacterales e Syntrophobacterales (BARTON; FAUQUE, 2009).

Espécies do gênero Desulfotomaculum (Filo Firmicutes) apresentam os SRB mais distribuídos em campos petrolíferos. Microrganismos tanto mesófilos quanto termófilos desse gênero foram isolados de reservatórios de óleo (AÜLLO et al., 2013).

Thermodesulfobacteria assim como arqueobactérias redutoras de sulfato isoladas de poços de petróleo são organismos termofílicos. Apenas Euryarchaeota possui representantes redutores de sulfato, enquanto Crenarchaeota inclui

4 redutores de sulfato (membros do gênero Caldivirga) foram isolados de campos petrolíferos até então (BARTON; FAUQUE, 2009; YOUSSEF; ELSHAHED; MCINERNEY, 2009).

Embora microrganismos anaeróbicos sejam prioritariamente produtores de H2S nos reservatórios, microrganismos aeróbicas presentes no reservatório ou em água de produção, tais como Bacillus, Pseudomonas, Proteus, Clostridium,

Thermoproteus e até leveduras como Saccharomyces podem produzir H2S

(ALMEIDA et al., 2006; MENDES-FERREIRA; MENDES-FAIA; LEÃO, 2002). Tais organismo mesófilos degradam hidrocarbonetos, como composto aromáticos, ácidos orgânicos de baixo peso molecular tais como acetato, propionato e butirato que podem ser fontes de carbono para organismo SRB. Embora esses metabolismos sejam interligados, poucos trabalhos demonstraram substratos ou vias comuns entre organismos degradadores de hidrocarbonetos e redutores de sulfato (ALMEIDA et al., 2006). Portanto são necessários mais trabalhos que ajudem caracterizar melhor a o papel de vias de degradação de hidrocarbonetos com o metabolismo de enxofre, como por exemplo a redução de sulfato

1.4 Metanogênese

Outro grupo de microrganismos residentes na comunidade de reservatório é o dos metanogênicos. A síntese de metano ocorre a partir de substratos simples como hidrogénio e CO2, acetato, metilamina e sulfetos de dimetilo. Atualmente,

organismo metanogênicos são distribuídos em cinco ordens: Methanomicrobiales, Methanobacteriales, Methanosarcinales, Methanococcales, e Methanopyrales, assim como em Euryarchaeota no domínio Archaea (MESLE; DROMART; OGER, 2013).

Organismos metanogênicos hidrogenotróficos e metilotróficos são tanto mesófilos quanto termófilos e são isolados de reservatório de óleo de baixa e alta salinidades. Por outro lado, metanogênicos que utilizam acetato, como o gênero

5 organismos exercem grande impacto na produção e recuperação do óleo nos reservatórios, visto que compartilham substratos, como o acetato proveniente de vias de degradação de hidrocarbonetos do petróleo bem como elétrons proveniente da redução de sulfato e nitrito (GIEG et al., 2010; MESL??; DROMART; OGER, 2013). Desse modo, trabalhos que integrem tanto o metabolismo de metano, quanto de degradação de hidrocarbonetos são necessários para compreender o impacto que organismo produtores de metano exercem na comunidade microbianas e consequentemente nos reservatórios e nos processos de extração e recuperação do petróleo.

1.5 Degradação de Hidrocarbonetos

A degradação de hidrocarbonetos por bactérias ocorre por meio de vias tanto aeróbicas quanto anaeróbicas. A degradação dessas moléculas é bem descrito na literatura em diversos organismos, como fungos e bactérias (VAN BEILEN et al., 2003). Alcanos são moléculas apolares quimicamente inertes e de baixa solubilidade em água o que torna seu metabolismo por microrganismos um desafio. Desse modo, é necessário ativar por meio de hidroxilação as moléculas de hidrocarbonetos antes de degradá-las (LABINGER; BERCAW, 2002). A via de degradação de alcanos lineares, conforme se observa na figura 1, é composta por diversas enzimas que ativam e subsequentemente preparam a moléculas para serem degradada via B-oxidação.

6

Figura 1 Esquema ilustrativo da via de degradação de alcanos lineares por meio das enzimas Alcano Monooxigenase (AH); Álcool Desidrogenase (AD); Aldeído Desidrogenase (ALDc) e Acetil Sintetase (ACD).

A ativação inicial da via de degradação de hidrocarbonetos lineares como também de aromáticos envolve a hidroxilação realizada por enzimas conhecidas como Monooxigenases e Citocromo P450, codificadas pelos genes alkB e cyP153 respectivamente. Tais genes foram anotados pela primeira vez no plasmídeo OCT em P. putida GPo1 e agrupados em dois operons que podem ser transferidos horizontalmente entre muitas bactérias (MAIER et al., 2001; VAN BEILEN et al., 1992). Os passos seguintes da via de degradação envolvem uma sequência de reações oxidativas que transforma a molécula de alcano em um álcool que é subsequentemente oxidado a um aldeído, e então é convertido a um ácido graxo. Por último, ao ácido graxo é adicionado uma acetil-CoA e o composto resultante é então degradado via B-oxidação (ROJO, 2009).

Semelhantemente, a degradação de hidrocarbonetos policíclico aromáticos (PAHs) também é mediante a hidroxilação por oxigenases que desestabilizam a ressonância dos anéis aromáticos, ativando-os para clivagem dos anéis (MISHRA; LAL; SRINIVASAN, 2001). A posição de hidroxilação determina o tipo de clivagem designada como Orto ou Meta. As reações subsequentes dessa clivagem levam a

7 formação de intermediários comuns das diferentes vias de degradação de PAHs como o Catecol, que são encaminhados para utilização como fonte de energia, via clico de Krebs (MISHRA; LAL; SRINIVASAN, 2001; VAN HAMME; SINGH; WARD, 2003). A biodegradação de hidrocarbonetos é um componente importante dos processos biogeoquímicos e atuam diretamente na renovação da matéria orgânica no ciclo do carbono. Estudos têm mostrado estratégias de bioestimulção dessas vias em comunidades bacterianas naturais como modo de biorremediação de ambientes contaminados por óleo (HASSANSHAHIAN et al., 2014). Outros estudos mostram a aplicação de consórcios bacterianos alóctones como capazes tanto de degradar o óleo quanto de produzir moléculas surfactantes durante a limpeza de ambientes contaminados por resíduos da indústria do petróleo (CAMEOTRA; SINGH, 2008).

1.6 Biossurfactantes

Os microrganismos usam uma grande variedade de compostos orgânicos como fonte de carbono e energia. Quando uma fonte de carbono é um substrato insolúvel em água, tal como os hidrocarbonetos, os microrganismos facilitam a sua difusão para a célula produzindo uma variedade de substâncias, dentre elas os biossurfactantes que são moléculas anfifílicas com um domínio hidrofóbico e outro hidrofílico. Por causa dessa estrutura, os biossurfactantes se acumulam na interface entre duas substâncias imiscíveis, formando micelas e dessa forma aumentam a solubilidade de substâncias hidrofóbicas (AL-ARAJI et al., 2007). Os surfactantes microbianos têm uma ampla gama de estruturas químicas cada um exercendo diferentes papéis biológicos no ciclo de vida dos microrganismos produtores (RON; ROSENBERG, 2001).

De acordo com suas estruturas químicas, os biossurfactantes podem ser classificados como peptídeos, ácidos graxos, lipídeos neutros, fosfolipídeos, glicolipídeos, glicopeptídeos, lipopeptídeos, lipopolissacarídeos, surfactantes complexos e particulados (SATPUTE et al., 2010a). Surfactantes são classificados

8 também de acordo com seu peso molecular. Enquanto biossurfactantes de alto peso molecular são geralmente hetero-polissacarídeos polianiônicos e bons estabilizantes de emulsão, os biossurfactantes de baixo peso molecular são frequentemente glicolípideos que reduzem a tensão superficial mais significativamente, mas não são bons estabilizantes de emulsão (AL-ARAJI et al., 2007). Podem, ainda, ser classificados de acordo a carga de seu grupamento hidrofílico, como não aniônicos, aniônicos, e catiônicos (SATPUTE et al., 2010b). Dessa forma, surfactantes são geralmente moléculas de baixo peso molecular que tanto reduzem a tensão superficial, quanto estabilizam uma emulsão. Por outro lado, bioemulsificadores são na sua maioria moléculas de alto peso que são capazes de estabilizar uma emulsão, mas não necessariamente são capazes de reduzir a tensão superficial (SATPUTE et al., 2010b).

Biossurfactantes são menos tóxicos, mais biodegradáveis e biocompatíveis do que surfactantes sintéticos (VELIOGLU; OZTURK UREK, 2015). Os biossurfactantes são utilizados como biotecnologias de diversas formas. Há grande aplicação de biossurfactantes na indústria petroquímica durante processos de recuperação avançada de óleo residual em reservatórios de petróleo, bem como durante estratégias de biorremediação de ambientes contaminados por óleo (BROWN, 2010; CAMEOTRA; SINGH, 2008). Há ainda registros de aplicações de biossurfactantes na indústria farmacêutica como antibióticos, antifúngicos e antivirais (SINGH; CAMEOTRA, 2004). A diversidade de estruturas faz com que os biossurfactantes apresentem várias propriedades e utilidades tanto ambientais quanto industriais. No entanto, neste trabalho foram apenas avaliadas as propriedades de formação de emulsão e redução da tensão interfacial e suas possíveis aplicações.

1.7 Metagenômica

Os microrganismos utilizam diversas fontes energéticas, em decorrência disso são adaptados a diferentes nichos ecológico (OBERHARDT et al., 2015;

9 PACE, 1997). No entanto, apenas 1% de toda essa diversidade microbiana é conhecida, principalmente devido às limitações técnicas de cultivo que não são suficientes para fornecer as inúmeras necessidades metabólicas e simbiônticas exigidas pelos microrganismos para serem cultivados de modo isolado (HANDELSMAN, 2004; OBERHARDT et al., 2015). Essas limitações vêm sendo superadas após aliarmos ferramentas da biologia molecular com as técnicas de microbiologia e informática as quais permitiram acessar esse pool genético independentemente da obtenção de culturas puras. Dessa intersecção de conhecimentos (Figura 2), surge a metagenômica que permite identificar taxonomicamente quais microrganismos, cultiváveis ou não, estão presentes nas amostras ambientais, além de permitir analisar metabolicamente o que esses organismos são capazes de realizar (HANDELSMAN, 2004).

Figura 2 Diagrama de Venn interdisciplinar, ilustrando a intersecção das áreas de conhecimento envolvidas na metagômica.

As abordagens metagenômicas dividem-se em duas formas, conforme se observa na figura 3 adaptada de HANDELSMAN, (2004). A abordagem por função consiste na clonagem do material genético das amostras ambientais em vetores genéticos transferidos a uma linhagem hospedeira. A biblioteca metagenômica é posteriormente submetida a análise para uma determinada função ou gene de interesse que é então sequenciado. Como a abordagem por função consiste na expressão de genes em um hospedeiro heterólogo, ela apresenta a vantagem de

10 estudar genes e proteínas de organismo até mesmo ainda não descobertos ou não cultiváveis (TOUSSAINT; GHIGO; SALMOND, 2003). Em contrapartida, a abordagem baseada em sequência, apresenta a vantagem de sequenciar o DNA das amostras ambientais diretamente e em seguida analisar usando protocolos de bioinformática (pipeline) arquitetados para um determinado objetivo, como por exemplo, descoberta de novos genes (HANDELSMAN, 2004).

Figura 3 Esquema ilustrativo das duas abordagens metagenômicas, figura adaptada de HANDELSMAN (2004).

Essa metodologia não permite apenas pesquisar microrganismos e/ou a descoberta novos genes de interesse biotecnológico, mas também analisa relações microbianas nas comunidades e as suas interações com plantas e animais bem como a dinâmica e influência nos ciclos biogeoquímicos como do carbono, enxofre e nitrogênio (JU; ZHANG, 2015). Dessa forma, a metagenômica permite estudar os organismos diretamente de amostras ambientais por meio da análise de seu material genético.

Embora as técnicas moleculares tradicionais, como a Reação em Cadeia de Polimerase (PCR), Hibridização por Fluorescência in situ (FISH) e Eletroforese em Gel de Gradiente Desnaturante (DGGE) tenham ampliado nossos conhecimentos

11 de taxonomia e diversidade microbianos, essas técnicas moleculares são úteis para elucidar parcialmente sistemas microbianos relativamente simples e de maneira isolada dos quais se exigem algum conhecimento prévio. Diferentemente, as análises de New generation sequence (NGS) são mais sensíveis e eficazes por necessitarem de pouco conhecimento prévio dos organismos e ainda são capazes de analisar praticamente todos os organismos de uma comunidade bacteriana tanto os organismos abundantes quanto os raros e desconhecidos (JU; ZHANG, 2015; VAN DIJK et al., 2014). Devido às novas tecnologias de NGS, vivenciamos uma enorme expansão da quantidade de dados gerados, que exigem uma crescente capacidade de processamento de dados que auxiliem na melhor compressão dos dados biológicos (JU; ZHANG, 2015). Para tanto, são necessárias ferramentas de bioinformática que permitem a interpretação dessa grande quantidade de dados gerados (PAULSEN; EDITORS; WALKER, 2014).

1.8 Bioinformática aplicada em análises metagenômicas

Devido ao crescimento de informação biológica proveniente tanto da NGS como outras tecnologias, foi necessário aliar ferramentas de computação científica e estatística para conseguir processar e interpretar a gigantesca quantidade de dados gerados.

Essa nova ciência divide-se conforme o tipo de dado biológico estudado e seu objetivo do estudo, como Biologia de Sistemas, Filogenia Molecular, Genômica, Transcriptoma, Proteômica, Metagenoma e Dinâmica Molecular (JU; ZHANG, 2015). Cada área apresenta um conjunto de metodologias, softwares, parâmetros estatísticos e tecnologias que exigem uma linguagem específica, bem como um workflow a ser seguido para o tratamento desse dado, análise de qualidade e posterior interpretação. A partir dessas análises é possível inferir resultados e conclusões biológicas categóricas.

A bioinformática é extremamente importante para a metagenômica, não somente por permite processar a grande quantidade de dados gerados, mas

12 também por permitir identificar os microrganismos não cultiváveis. Além disso, permite quantificar e integrar o que esses organismos estão fazendo metabolicamente na comunidade bacteriana. O sequenciamento direto do material genético de comunidades bacterianas ambientais gera uma grande quantidade de pequenos fragmentos de DNA sequenciados, conhecidos como reads, que precisam ser qualificados, identificados, quantificados e anotados. Esses reads são primeiro submetidos a análise de qualidade, necessária para excluir reads de baixa qualidade geradas durante o sequenciamento. Após essa etapa, existem duas formas de análise de bioinformática conhecidas como not-assembled ou assembled (JU; ZHANG, 2015).

A abordagem not-assembled (não montados), utiliza as reads não montadas. Esse tipo de análise é utilizado para obter um perfil de abundância de genes, taxa e vias metabólicas em análises quantitativas e comparativas (JU; ZHANG, 2015). Para tanto, os reads são comparados contra bancos de dados funcionais e taxonômicos como KEGG e o SEDD, respectivamente (OGATA et al., 1999; OVERBEEK et al., 2005). Por meio de homologia com sequências já conhecidas é possível inferir ou identificar a quais táxons pertencem as sequências. No entanto, a utilização de reads comparativamente a grandes bancos de dados torna a análise mais lenta e computacionalmente custosa, além disso, pode não ter boa resolução para alguns níveis taxonômicos, como espécies. Dessa forma são requeridos filtros e parâmetros estatísticos como e-value que assegura que as identificações não seja ao acaso bem identidade mínima entre sequências que diminui a ocorrência de falsos positivos (YANG; JIANG; ZHANG, 2014). Além disso, a atualização de banco de dados customizados e menores como BIOSURFDB (OLIVEIRA et al., 2015) podem minimizar a ocorrência de tais problemas e aumentar o poder de resolução das análises (JU; ZHANG, 2015; YU; ZHANG, 2013).

Em contraste, abordagem utilizando contigs, que são sequencias maiores geradas pela montagem de pequenas sequencias (reads) concatenados, permitem análises mais rápidas e fidedignas de espécies específicas e seus genes. Contudo, a anotação baseada em contigs perde a análise quantitativa, além de apresentar

13 dificuldades para análises de espécies de baixa abundância (JU; ZHANG, 2015). Essa perda de abundância é decorrente da montagem dos contigs, a qual utiliza vários reads concatenados para formar um único contig. Essa montagem pode ser baseada no mapeamento em um genoma de referência, no caso espécies conhecidas, ou pode ser uma montagem sem referência conhecida, como no caso de novas espécies (OULAS et al., 2015). A utilização de contigs é mais indicada para a predição de ORFs (Open Reading Frames) e operons dos quais se tem interesse em identificar, seja por homologia ou por meio de buscar de padrões de sequencias de genes específicos, como degradação de hidrocarbonetos ou síntese de moléculas biossurfactantes as quais são de interesse do presente trabalho (HESS et al., 2011).

1.9 Metagenômica de reservatório de petróleo

Como as metodologias convencionais de cultivo são limitadas para acessar a riqueza microbiológica em ambientes extremos como reservatório de petróleo, o uso da metagenômica permite estudar de modo integrado os diversos organismos e processos bioquímicos existentes no reservatório de petróleo. Abordagens metagenômicas por função de interesse buscam nesses ambientes extremos produtos biotecnológicos, como novas enzimas termoestáveis e tolerantes a sais. Trabalhos como o de LEWIN et al., (2016) identificaram novas esterases termoestáveis e tolerantes a altas concentrações de sais e metais em bibliotecas de fosmídeos clonados de metagenomas derivados de reservatório de petróleo. Assim como outros estudos tem identificado novas enolases termoestáveis derivadas de bibliotecas de DNA de poço de petróleo (KOTLAR et al., 2011). Outros trabalhos utilizando bibliotecas de fosmídeos oriundos de um reservatório de petróleo brasileiro identificou uma nova via de degradação de hidrocarbonetos policicloaromáticos (HPAs) (SIERRA-GARCIA et al., 2014).

14 No entanto, poucos estudos tem buscado avaliar o DNA total das comunidades microbianas de reservatório de petróleo (KOTLAR et al., 2011). Com isso, a maioria das abordagens por metagenômica sequencial identificam a taxonomia dessas comunidades por meio da avaliação do DNA ribossomal 16S (BAKER, 2016; KOTLAR et al., 2011; SILVA et al., 2013). Análises metagenômicas comparativas tem revelado diferenças nas proporções entres os domínios ARCHAEA e BACTERIA nos reservatórios devido a disponibilidade de nutrientes, temperatura bem como processos decorrentes da exploração do óleo (LEWIN et al., 2014). Além do mais, por meio da avaliação do DNA 16S, trabalhos como KOTLAR et al., (2011) tem mostrado a contribuição metabólica dessas comunidades como predominantemente compostas por microrganismos redutores de sulfato e metanogênicos, como Methanococcus, Desulfurovibrionales, Desulfuromonadales, Campylobacterales e Thermotogales.

Assim como por arqueais anaeróbicas, como Thermococcus e Pyrococcustem identificadas em amostras de água de produção de reservatório (LEWIN et al., 2014). Outros trabalhos tem anotado vias de degradação de compostos aromáticos através de homologia a bancos de dados não redundantes públicos em metagenomas cujo petróleo possui constituição mais leve e refinado (BAKER, 2016). Diferentemente desses estudos, o presente trabalho buscou caracterizar taxonômica e funcionalmente a comunidade de rocha, água de produção e consórcios isolados dessas amostras, por meio de uma abordagem metagenômica de shotgun de genoma total, comparativamente a um banco de dados específico com genes envolvidos na degradação de hidrocarbonetos, produção de biossurfactantes, metanogênese e redução de sulfato.

Diante desse exposto, este trabalho teve como objetivos estudar a comunidade de reservatório de petróleo por meio do sequenciamento do DNA ambiental oriundo de reservatório de petróleo bem como de consórcios bacterianos. Para dessa forma responder questões acerca da contribuição metabólica que diferentes organismos realizam em processos bioquímicos de interesse biotecnológico bem como da indústria petroquímica.

15 2 OBJETIVOS GERAIS

O presente trabalho tem como objetivo principal caracterizar taxonômica e metabolicamente os metagenomas de rocha, água de produção e seus respectivos consórcios proveniente de reservatório de petróleo.

2.1 Objetivos específicos

 Obter o metagenoma de amostras de rocha e água de produção de reservatório de petróleo.

 Caracterizar taxonômico e funcionalmente os metagenomas de reservatório de óleo e consórcios a fim estudar as diferentes relações e perfis metabólicos para a comunidade microbiana residente nos poços de petróleo.  Obter consórcios microbianos potencialmente degradadores de

hidrocarbonetos e/ou produtores de biossurfactantes.

 Identificar microrganismos e genes com possíveis aplicações biotecnológicas, como biorremediação e recuperação avançada de petróleo.

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Preparo e caracterização de amostras

Foram recebidas amostras de dois poços de óleo: P1 e P2 cedidas pela empresa PetroleoBras. As amostras do poço P1 de profundidade 975 à 985 m, constituídas por água de produção e rocha (tipo de rocha não informado). Bem como três tipos de amostras do poço P2 com profundidade de 1035 m a 1041 m e constituída de rocha Carbonática; 1053 m a 1056 m rocha Filito e 966 m a 972 m rocha carbonática, ver discrição da localização na tabela 01 a seguir.

16

Tabela 1. Localização geográfica dos poços P1 e P2 e as respectivas datas de coleta e recebimento no laboratório.

Tipo de amostra

Poço Localização Profundidade Data de coleta Data de recebimento no laboratório Água de produção P1 Bacia SE/ AL --- --- 11/2015

Petróleo --- Bacia SE/ AL 977 - 1010 m --- 11/2015 Rocha P1 Bacia SE/ AL 975 - 985 m 08/2010 11/2015 Rocha P2 Bacia SE/ AL 966 – 972 m;

1035 -1041 m; 1053 - 1056 m 12/2015 01/2016 Petróleo Pré-sal 01 Bacia de Santos 6029 - 6172 m 11/2015 6/2016

A tabela 01 informa a localização de cada poço de petróleo, bem como profundidade, datas de coleta no campo de petróleo e recebimento no laboratório. Após serem identificadas as amostras de rocha e água de produção foram submetidas ao preparo para extração de DNA bem com preparo de consórcios bacterianos, conforme a fluxograma da metodologia apresentado na figura 4 a seguir.

17

Figura 4 . Fluxograma da metodologia utilizada neste trabalho. Amostras brutas de rocha e água de produção foram submetidos a duas pipelines de trabalho. Uma de sequenciamento direto do DNA ambiental e outra de preparo de consórcio bacterianos que foram posteriormente sequenciados.

Para realizar os metagenomas de rocha e água de produção de reservatório, alíquotas das amostras brutas foram submetidas a extração de DNA e posterior sequenciamento de DNA ambiental (eDNA). Como também para realizar o preparo de consórcio, outras alíquotas das mesmas amostras foram submetidas a preparação dos consórcios bacterianos que posteriormente foram sequenciados e realizados testes funcionais, conforme é descrito a seguir.

18 3.2 Lavagem da rocha

A etapa de lavagem da rocha descrita consistiu em lavagens com tampões diferindo nas suas concentrações de EDTA (ANEXO II) para solubilização de metais pesados e contaminantes de PCR que poderia interferir nas etapas de extração de DNA e demais experimentos.

3.3 Preparo de consórcios de água de produção e rocha

Os consórcios bacterianos foram preparados durante seis semanas de cultivo. Durante a fase de enriquecimento, três primeiras semanas, foram usados os seguintes meios.

1. Meio Bushnell Haas (BH) 2. Meio Lysogeny Broth (LB)

3. MeioYeast Extract Peptone Dextrose (YPD) 4. Meio Circlegrow (CG)

5. Água do mar artificial (AM)

As composições dos meios definidos utilizados neste experimento encontram-se no anexo I deste trabalho. Durante a fase seguinte de seleção, correspondente as três últimas semanas de cultivo, foi utilizado apenas o meio mineral BH em todos os consórcios. Como é possível observar no esquema abaixo da figura 05. O Petróleo, utilizado como única fonte de carbono no cultivo dos consórcios, foi esterilizado em autoclave por 30 minutos.

19

Figura 5 Procedimento de preparo de consórcios bacterianos: em amarelo representa as três primeiras semanas de enriquecimento em meio rico, seguido das três últimas semanas de seleção, representado pela cor cinza para o meio pobre (BH) contendo apenas 1% de petróleo.

Na primeira semana, um erlenmeyer de 250 ml foi preparado contendo meio de cultura e água de produção em uma proporção de 1:1 (25 ml de cada) para os consórcios de água de produção. Enquanto para os consórcios de rocha foram preparados com 50 ml de meio e adicionados 8 g de rocha (cascalho). Nesta primeira semana, não foi adicionado petróleo aos consórcios, visto que tanto a rocha quanto a água de produção possuem hidrocarbonetos residuais do reservatório. Após sete dias de incubação tanto à 30 °C quanto à 37°C e submetidos a agitação de 150 rpm, uma alíquota de 5% (v/v) de cada consórcio foi transferida para seu respectivo meio, contendo desta vez 1 % de petróleo. De modo semelhante, na terceira semana, foi realizado uma nova transferência de cultivo sobre as mesmas condições de temperatura e agitação. Ao final da terceira semana de enriquecimento, uma alíquota de 5 % (v/v) de cada consórcio foi transferida para o meio mineral BH contendo como única fonte de carbono 1 % de petróleo para realizar a etapa de seleção de microrganismos biodegradadores de petróleo e produtores de surfactantes. Após uma semana, 5% dessa cultura foram

20 transferidos para um novo meio BH contendo 1% de petróleo, mantendo as mesmas condições de temperatura e agitação, sendo tal procedimento repetido três vezes a cada 7 dias de cultivo, como é demonstrado no esquema da figura 5 acima. Todos os consórcios preparados durante esse trabalho bem como os diferentes meios testados, amostras e condições de temperatura testadas se encontram na tabela 2 abaixo.

Tabela 2. Tabela apresenta todos os consórcios preparados durante esse trabalho bem como de qual poço as amostras eram provenientes para isolar os microrganismos e os modos de preparo

Preparação de consórcios Consórcio Amostra isolada Poço Meio de enriquecimento Meio de seleção Temperatura A1 Água de produção P1 BH BH 30° A2 Água de produção P1 YPD BH 30° A3 Água de produção P1 CG BH 30° A4 Água de produção P1 LB BH 30° A5 Água de produção P1 AM BH 30° A6 Água de produção P1 BH BH 37°

21 A7 Água de produção P1 YPD BH 37° A8 Água de produção P1 CG BH 37° A9 Água de produção P1 LB BH 37° A10 Água de produção P1 AM BH 37° R1 Rocha-Filito P2 LB BH 37° R2 Rocha-Carbonato P2 LB BH 37° R3 Rocha P1 LB BH 37°

Como a amostra de água de produção recebida era proveniente apenas de um poço, foram testados diferentes meios e temperaturas de cultivo. Diferentemente das amostras de rocha recebidas que eram todas de tipos diferentes de rocha, sendo desse modo usado a mesmas condições de cultivo.

22 3.4 Estoque e congelamento

Ao final do procedimento de preparo de todos os consórcios microbianos, os mesmos foram mantidos em glicerol 100 % em uma proporção de 1:1 de cultura e estocados à - 20 °C e - 80 °C.

3.5 Curvas de crescimento dos consórcios de bactérias

Com o intuito de avaliar o crescimento dos consórcios obtidos a partir da água de produção bem como das rochas dos reservatórios em meio mínimo BH à 30 e 37 ºC, foram realizadas curvas de crescimento bacteriano aferido por medidas da Densidade Óptica (DO) verificada no comprimento de onda de 600 nm (DO600). Para realizar a curva de crescimento dos consórcios crescidos nas duas diferentes temperaturas, foram feitos pré-inóculos em meio BH contendo 1 % petróleo como fonte única de carbono e crescido até atingir uma DO600 de 1,0. Posteriormente a DO600 foi reajustada para a inicial de 0,1 e aferida ao longo do cultivo.

3.6 Extração de DNA de microrganismos da água de produção

A extração do DNA genômico dos microrganismos presentes na água de produção foi realizada após o procedimento de filtração a vácuo. Após filtragem a vácuo de 4 litros de água de produção em um filtro de 0,22 µm da MF-Millipore™, dois tipos de preparações foram utilizadas para a extração, denominadas AP1 (membrana do filtro à vácuo cortada em pedaços) e AP2 (raspagem da membrana). Tanto AP1 quanto AP2 foram subsequentemente submetidas ao protocolo de extração do kit UltraClean® Microbial DNA Isolation (MO BIO Laboratories, Inc), conforme recomendações do fabricante.

23 3.7 Extração de DNA de rochas dos poços P1 e P2

A extração de DNA genômico a partir das rochas de reservatório foi conduzida por diferentes métodos a fim de obter o melhor rendimento e qualidade de DNA extraído, como relacionado na tabela 3 a seguir.

Tabela 3: Métodos de extração e DNA testados neste trabalho para extrair DNA de microrganismos presentes em rochas de reservatório.

Método Princípio de extração Quantidade de

rocha inicial

Método 1 kit comercial PowerMax® Soil DNA Isolation (MO BIO Laboratories, Inc)

10g

Método 2* Fenol, clorofórmio e cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB, Sigma) e 13% de PEG 6000 em 1,6M NaCl, validado para extração de DNA de

rocha contaminado (KNAEBEL; CRAWFORD, 1995)

10g

Método 3* Lavagem de ácidos húmicos com concentrações decrescentes de

EDTA + Método 2

10g

Método 4* Tampão de extração: EDTA, SDS, NaCl e PEG 6000 a 50% para remoção de ácidos húmicos (Sagar

et al, 2014).

750mg

Método 5* Lavagem de ácidos húmicos com concentrações decrescentes de

24 EDTA + Método 4

Método 6 QIAamp® DNA Stool (Qiagen) 220mg

O método 2 descrito por (KNAEBEL; CRAWFORD, 1995) foi utilizado neste trabalho por apresentar o melhor rendimento de DNA genômico das amostras. Essa extração consiste na lise química e mecânica por meio detergente sintético e alta vibração. Seguida por etapas sucessivas de precipitação de material não genético por meio de sais e proteinase. Os contaminantes orgânicos são lavados por meio de solventes orgânicos como Fenol, clorofórmio e cetyltrimethyl

ammonium bromide (CTAB). Por fim o material genético é precipitado por meio do

polímero polietilenoglicol (PEG) 6000 em concentração de 13 % em uma solução 1,6 M de NaCl.

3.8 Extração de DNA consórcios bacterianos

A extração de DNA genômico dos consórcios bacterianos foi feita quando a DO600 dos consórcios atingiu no mínimo 1,5. O método de melhor rendimento e qualidade de DNA utilizado para a extração de DNA dos consórcios tanto das rochas quanto da água de produção foi o descrito por (KNAEBEL; CRAWFORD, 1995). O DNA extraído foi mantido em respectivo tampão e armazenado a -20 º C para análises posteriores.

3.9 Avaliação quantitativa e qualitativa do DNA

A quantificação do DNA genômico foi procedida por fluorometria com o equipamento Qubit Fluorometer (Invitrogen), utilizando o kit Qubit® dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit.

A pureza do DNA extraído foi verificada através de espectrofotômetro NanodropTM 9000 (Thermo Fisher Scientific), por meio de leituras feitas no

[VM1] Comentário: Como aqui já fala de um resultado preliminar talvez fosse bom incluir na tabela o rendimento de DNA pra justificar a escolha pelo método 2.

25 comprimento de onda de 260 nm, considerando que uma unidade de densidade óptica (DO) corresponde a aproximadamente 50 μg/ml para DNA de dupla fita A pureza das amostras foi estimada pela relação 260/280. Amostras com valores entre 1,8 e 2,0 foram consideradas com grau de pureza satisfatório.

A integridade do DNA foi avaliada por eletroforese. Foi preparado um mix [ 5V de DNA :1V de tampão de corrida cuja composição está no ANEXO II. Em seguida, o mix foi aplicado em gel de agarose 0,8 % com o corante Sybr® Safe (Thermo Fisher Scientific) em tampão TAE (ANEXO II).

3.10 Ensaio de dispersão do óleo

O experimento avalia a presença de moléculas surfactantes nas culturas bacterianas. O ensaio foi realizado em uma placa de Petri de 150 mm de diâmetro onde foram adicionados 30 ml água destilada e em seguida 500 µL de petróleo, até formar uma membrana hidrofóbica sobre a água. Logo em seguida, foram adicionadas 500 µL de sobrenadante de cultura obtido durante a fase estacionária da curva de crescimento das culturas por meio de centrifugação a 3000 g por 8 minutos à temperatura ambiente. Foi utilizado como controle negativo somente meio mineral BH e como controle positivo o surfactante sintético Dodecil sulfato de sódio (SDS) 1 %. A área de dispersão do óleo foi comparada entre os controles e as amostras em estudo (MORIKAWA; HIRATA, 2000).

3.11 Ensaio de emulsificação

A fim de avaliar a presença de moléculas surfactantes e a formação de emulsão entre as fases hidrofóbica e hidrofílica ao longo de dias de cultivo. O ensaio baseado na capacidade de emulsificação produzida pelos biossurfactantes é utilizado para quantificar a capacidade dos biossurfactantes em estabilizar uma emulsão de hidrocarbonetos a partir do cálculo do índice de emulsificação, sendo esse calculado após 24 horas da realização do ensaio

26 (E24%) (SATPUTE et al., 2010b). O índice de emulsificação é calculado como a razão entre a altura da camada de emulsão e a altura total do sistema multiplicado por 100, como mostrado na equação abaixo.

O ensaio foi realizado em triplicatas em um tubo onde foram adicionados 2 ml de querosene, 2 ml da sobrenadante obtidos após centrifugação de 30 ml da cultura à 3.000 g por 10 minutos à temperatura ambiente, tendo como controle positivo surfactante sintético SDS 1 %.

3.12 Avaliação da tensão interfacial

O teste de avaliação da tensão interfacial entre a sobrenadante de cultura bacteriana e petróleo foi realizado usando o tensiômetro DVT50 da Kruss. O método padronizado neste trabalho foi o Rising Drop que consiste na avaliação da tensão interfacial entre duas substancias testadas (SATPUTE et al., 2010b). Durante o teste é avaliada a força existente na substância presente na Bulk Phase e entre a gotícula de óleo presente na Dispense phase, conforme figura 6 ilustrativa a seguir.

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Figura 6 Foto ilustrativa do teste de tensão interfacial utilizando o tensiômetro da DVT50, indicando a fase hidrofílica (amostra) e fase hidrofóbica analisadas (petróleo).

Como Bulk Phase foram utilizadas as amostras dos sobrenadantes dos consórcios. Como controle negativo foi utilizado somente meio de cultura, enquanto para controle positivo o surfactante sintético SDS em concentração de 1% diluído em água destilada. Como Dispense Phase foi utilizado petróleo para aferir a tensão interfacial entre a amostra e óleo. Espera-se que a presença de moléculas surfactantes na Bulk Phase seja capaz de reduzir a tensão interfacial entre as duas fases. O teste foi realizado durante fase estacionária da curva de crescimento bacteriano conforme anteriormente descrito e tendo todas as amostras em triplicatas. Para realizar esse teste, 30 ml de consórcio bacteriano foi centrifugação 3.000 g por 10 min à temperatura ambiente e o sobrenadante obtido foi utilizado para as análises.

3.13 Ensaio de degradação de hidrocarbonetos

A fim realizar uma avaliação inicial da biodegradação de hidrocarbonetos pelos consórcios bacterianos ao longo da curva de crescimento, foi realizado um teste de degradação utilizando o aceptor artificial de elétrons 2,6-diclorofenol indofenol (DCPIP) descrito por KUBOTA et al., (2008), o qual ao

28 incorporar elétrons muda de sua forma oxidada e de coloração azul para sua forma reduzida e incolor, sendo um indicativo da reações de oxidação e utilização do hidrocarboneto pelo microrganismo. O teste foi realizado conforme descrito por KUBOTA et al., (2008), no qual o DCPIP foi diluído em 100 ml de água para uma concentração de 37,5 μg/ml e filtrado com filtro 0,22 µm Millipore da MF-Millipore™. As culturas crescidas em BH com 1% de petróleo até uma DO600 de 1,0 foram centrifugadas 2500 g e ressuspendidas em meio BH. Para a realização desse ensaio foram utilizados 800 μl de meio BH, 100 μl DCPIP para concentração final de 3,7 μg/ml, 80 μl de cultura bacteriana para uma DO final de 0,5 e 10 μl de petróleo como fonte de carbono. Para controle positivo de todos os consórcios, foi utilizado 800 μl de meio BH, 100 μl DCPIP para concentração final de 3,7 μg/ml, 80 μl de cultura bacteriana para uma DO final de 0,5 e 10 μl de glicose 1M. Para controle negativo 01 de cada consórcio foi utilizado apena cultura bacteriana, DCPIP e BH sem adição de fonte de carbono. Para controle de todo o experimento foi realizado controle negativo 02 contendo DCPIP, BH, sem adição de bactérias e fonte de carbono; controle negativo 03 contendo petróleo, DCPIP e BH sem adição de cultura.

3.14 Cromatografias

Os testes cromatográficos presentes neste trabalho foram realizados em colaboração com o Centro de Tecnologia do Gás e Energias Renováveis (CTGAS-ER). A cromatografia foi realizada durante a fase estacionária da curva de crescimento bacteriana dos consórcios. Durante essa fase foram preparadas culturas bacterinas dos respectivos consórcios em erlenmeyer de 250 ml contendo 50 ml de meio mineral BH acrescido de 1 % de petróleo. O controle negativo desse experimento foi usado apenas meio mineral e petróleo sem cultura bacteriana. O óleo bruto residual foi extraído por mistura solvente Vol / vol. Os procedimentos do ensaio das amostras foram realizadas conforme a norma EPA8270 para a determinação de Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos – HPAs. Como padrão de calibração de HPA da Cromatografia Gasosa com Detecção por Espectrometria