Desde 1885, Howell descreveu a coagulação do sangue do Limulus polyphemus, o caranguejo em forma de ferradura de cavalo. Na década de 1950, Bang descobriu que as bactérias Gram negativas causavam a coagulação do sangue do Limulus. Em 1964, Levin e Bang determinaram que a reação é enzimática, mostrando que a coagulação é iniciada por um componente estrutural único da parede celular bacteriana denominado endotoxinas (apud PINTO; KANEKO; OHARA, 2003).
Este método determina a presença de endotoxinas bacterianas (bioprodutos causadores da febre provenientes de bactérias Gram negativas) e é obrigatório para
produtos injetáveis. Determinam, em limites aceitáveis, os riscos de uma ação febril, em paciente receptador do produto injetado. Para execução deste tipo de teste, usa- se um derivado do lisado de amebócitos do caranguejo Limulus polyphemus (LAL). O teste pode apresentar resultados falso- negativos ou falso- positivos em produtos, antibióticos e vacinas virais (SANTOS et al, 2000).
O método se baseia na reação entre a endotoxina e um componente protéico do LAL. Esse método “in vitro”, começou com os trabalhos de Frederik Bong, na Universidade Jonh Hopkins, que observou a reação de coagulação intravascular causada por bactérias em caranguejos de espécie Limulus polyphemus. Assim, o cientista descobriu que o fenômeno de coagulação estava nos amebócitos ou células sanguíneas circulantes do caranguejo, e que a endotoxina produzia uma reação de gelificação com o lisado obtido desses amebócitos por processo enzimático (apud ADNER et al, 1991).
A endotoxina juntamente com cátions divalentes ativam zimógenas de serina- protease, encontrados em amebócitos, iniciando uma reação em cascata, alterando uma proteína chamada coagulágeno, levando à formação do gel proteináceo (LOURENÇO; KANEKO; PINTO, 2005).
Um estudo feito em 1970 mostrou que o teste de LAL é mais sensível do que os testes realizados em coelhos, pois a intensidade com que o gel é formado é semelhante à concentração das endotoxinas (LEVIN; BANG, 1964).
Quadro 1: LAL e a formação de coágulo (reação positiva) na presença de
Endotoxina, (BIERNAT, 2005).
10.1 MECANISMO DE REAÇÃO
A ativação pela endotoxina de enzimas de alto peso molecular é o resultado da reação: Esta endotoxina, no final do teste de LAL, faz com que ocorra a gelificação de proteínas coaguláveis de baixo peso molecular (PINTO; KANEKO; OHARA, 2003). A reação do LAL requer um pH neutro e é dependente do tempo, da temperatura e concentração da endotoxina (UNITED, 2004).
O mecanismo baseia-se na observação de que a endotoxina induz a gelificação do lisado obtido dos amebócitos de ferradura de cavalo, Limulus polyphemus. A possibilidade é de que o teste de “Limulus” poderia ser positivo na presença de outras substâncias em que a endotoxina não tem sido absolutamente excluída (RAIJ; SHAPIRO; MICHAEL, 1973).
Entende-se que, quando há formação de gel, ocorre uma reação típica de teste positivo (reação de cascata em enzimas). Esta reação ocorre devido à clivagem do coagulogênio (proteína de coagulação) através de uma enzima
coagulante ativada, ocorrendo clivagem de produtos insolúveis, que se ligam a proteínas coagulantes, formando o gel característico do teste de LAL positivo (SANTOS et al, 2000).
Figura 6: Reagentes utilizados para execução do LAL teste
Fonte: SANTOS et al, 2000a
10.2 PREPARAÇÃO DO LISADO DO AMEBÓCITO DE LIMULUS (LAL)
Submetem-se os caranguejos Limulus polyphemus à sangria, introduzindo uma agulha estéril e apirogênica de 18 G no músculo entre as regiões cefalo- torácica e abdominal. A mistura de N- etilmaleimida em 3% de cloreto de sódio estabiliza a membrana do amebócito. Após centrifugação por 10 minutos desta mistura, despreza-se o sobrenadante azul, que contém hemocianina. Lavam-se os amebócitos em cloreto de sódio 3%, para retirada dos componentes do soro e dos anticoagulantes (YAMAMOTO et al, 2000).
Figura 7: Limulus polyphemus
Fonte: VICTOR, 2007.
Ao adicionar água destilada apirogênica, ocorre choque osmótico e consequente rompimento da membrana, para liberação do líquido intracelular. O produto na forma aquosa é liofilizado, ficando estável à 4ºC por 3 anos, no mínimo (PINTO; KANEKO; OHARA, 2003).
Uma das críticas feitas ao uso do LAL, para detecção de endotoxinas, foi a variabilidade estação-a-estação e lote-a-lote. Pesquisas conduziram ao desenvolvimento de um tratamento com clorofórmio, visando reduzi-la e aumentando a sensibilidade. Mesmo utilizando íons bivalentes, a variabilidade não foi influenciada, porém a sensibilidade do reagente foi aumentada (LOURENÇO; KANEKO; PINTO, 2005).
10.3 PONTO FINAL DE GELIFICAÇÃO
O método Gel-Clot é muito simples, econômico e mais sensível do que o teste in vivo realizado em coelhos (BUSSEY; TSUJI, 1984). Um estudo feito em meados do século 70 demonstrou que o teste de LAL é mais sensível que o ensaio feito em coelhos e que a intensidade de formação do gel estava diretamente relacionada à concentração da endotoxina (SANTOS et al, 2000).
É um método que consiste em transferir volumes iguais de reagente de lisado e solução-teste (0,1 ml cada) para tubos de ensaio despirogenizados. Deve-se homogeneizar a mistura e, em seguida, incubar na temperatura de 37ºC por uma hora. Os tubos não podem ser manuseados, para não atrapalhar a gelificação (ADNER et al, 1991).
Para verificação dos resultados, devem-se inverter os tubos num ângulo de 180 ºC: se o gel se manter firme no fundo do tubo durante a inversão, há presença de endotoxina, portanto o teste é positivo. caso não haja formação do gel, significa que não há presença de endotoxina, portanto o resultado é negativo (PINTO; KANEKO; OHARA, 2003).
Figura 8: Leitura dos resultados a partir do coágulo branco formado no fundo do
tubo de ensaio
Fonte: SANTOS et al, 2000b.
10.4 ENSAIO LAL: APLICAÇÃO E EQUIVALÊNCIA
Desde os anos 70, o teste de LAL foi preferível para ser usado em radiofármacos, após longos estudos. Portanto a aplicação deste também foi utilizada em produtos biológicos, visando minimizar concentrações de endotoxina nos
produtos. Para o teste de equivalência, vários testes foram realizados usando ensaios de endotoxina, deduzindo a equivalência do teste in vitro (LONNEMANN et al, 1988).
Para estabelecer a equivalência ou superioridade do ensaio LAL para endotoxinas, numerosos testes paralelos foram realizados utilizando-se, em ambos os ensaios, níveis especificados de endotoxina, deduzindo a equivalência ou superioridade do teste in vitro (SANTOS et al, 2000).
A aplicação se estende também à determinação do efeito de procedimento de limpeza e outros nos níveis de endotoxinas, minimizando concentrações de endotoxina nos produtos terminados. Estes limites de endotoxina situam-se bem abaixo daqueles indutores de respostas pirogênicas no homem (RUSH et al, 1988).