Testes de atividade anti-inflamatória e antinociceptiva com Tephrosia

A articulação temporomandibular (ATM) é a única articulação móvel do crânio, e considerada a mais complexa do corpo humano, sendo a única que permite movimentos rotacionais e translacionais, devido à articulação dupla do côndilo. Uma disfunção temporomandibular (DTM) reuni um grupo de doenças que acometem os músculos mastigatórios, a ATM e estruturas adjacentes.105

A artrite na articulação temporomandibular (ATM) se apresenta como um dos diagnósticos diferenciais nas disfunções temporomandibulares (DTM).106 Trabalhos têm relatado que a dor é a sintomatologia mais importante, seguido por limitação de movimentos mandibulares que podem causar dificuldade em comer ou falar, além de cefaléia secundária, dor cervical e distúrbios do sono.107 As formas crônicas das DTMs são extremamente incapacitantes, resultando em diminuição da qualidade de vida dos seus pacientes.106

Os modelos de artrite experimental são formas de investigar alternativas terapêuticas, uma vez que a remissão completa da doença raramente é alcançada. Um dos tratamentos consiste no uso de anti-inflamatórios não esteroidais (AINE), fármacos que tem a capacidade de promover uma rápida supressão dos sintomas inflamatórios, tais como, a dor e a rigidez matinal. A terapêutica da artrite limita-se praticamente a minimizar os sintomas flogísticos articulares.108,109 Os AINEs são largamente indicados, apesar do reconhecimento do potencial associado com toxicidade cardíaca, renal e vascular.111 Os produtos de origem natural poderiam representar uma alternativa para o tratamento dessa patologia.

O zymosan é um polissacarídeo extraído de paredes celulares de leveduras, Saccharomyces cerevisiae, e tem sido utilizado como agente flogístico em estudos farmacológicos para indução da inflamação experimental. Quando injetado na articulação, segue-se uma reação inflamatória que inclui edema, migração celular, eritema e hiperalgesia.110

Os testes de atividade anti-inflamatória e antinociceptiva foram realizados no Laboratório de Farmacologia (UFC – Campus Sobral), sob a coordenação da profa. Dra. Hellíada Vasconcelos Chaves.

As atividades anti-inflamatória e antinociceptiva do extrato das raízes de T. toxicaria - TTRE e dos flavonoides isolados obovatina (TT-1), deguelina (TT-2) e 12a-hidroxi-α-toxicarol (TT-3) foram avaliadas em modelo experimental de indução de inflamação por zymosan na articulação temporomandibular (ATM) de ratos.

Foram utilizados ratos Wistar machos (160–220 g), provenientes do Biotério Central do Campus do Pici e do Biotério Setorial do Curso de Medicina – UFC – Campus Sobral. Os animais foram anestesiados com 2,2,2-tribromoetanol por via intraperitoneal (1 mL/100 g) e receberam uma injeção intra-articular na ATM esquerda de 2 mg de Zymosan (40 µL) dissolvido em solução salina, usando uma agulha calibre 30 G e uma seringa de 0,50 mL. Os animais receberam 1 hora antes da indução de inflamação as soluções do extrato TTRE (0,20; 2,0 e 20 mg/Kg), obovatina (1,0 e 10 mg/Kg), deguelina (1,0 e 10 mg/Kg) ou 12a-hidroxi-α-toxicarol (1,0 e 10 mg/Kg), cada solução do extato ou composto foi diluída em 10 μL de Tween 80 e o volume final da solução foi ajustado usando 0,9% de solução salina. O grupo Sham recebeu o veículo (salina 0,9 %) 1 hora antes da injeção intra-articular de salina estéril 0,9%. Indometacina (5 mg/Kg), dissolvida em salina estéril, foi utilizada como controle positivo. O grupo Zymosan representa animais que receberam o veículo (salina 0,9 %), seguido 1 hora após da injeção de Zymosan (2 mg).

A hipernocicepção inflamatória na ATM foi avaliada pela medida do limiar de intensidade de força que devia ser aplicada à região da ATM até a ocorrência de reflexo do animal (por exemplo, o movimento de retirada da cabeça). As medidas foram realizadas utilizando um dispositivo digital que consistia em um filamento rígido ligado em um dispositivo eletrônico que mediu o limiar de resposta em gramas (g) quando o filamento foi aplicado à superfície da região testada. As medidas foram realizadas antes e 4 horas após a injeção de zymosan ou de veículo de teste.

Para avaliação da toxicidade sub-crônica de T. toxicaria foram realizadas repetidas injeções de 20 mg/Kg de TTRE durante 14 dias consecutivos. Os animais foram pesados diariamente e após 14 dias de tratamento, as amostras de sangue foram coletadas para

foram removidos, pesados e possíveis lesões e hemorragias foram medidas.

A eutanásia dos animais foi realizada sob anestesia com hidrato de cloral 10%, 6 horas após a injeção de 2 mg de zymosan. Os tecidos superficiais foram dissecados até atingir a ATM que em seguida foi lavada para coleta do líquido sinovial com 0,05 mL de uma solução de EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético) e PBS (tampão fosfato-salino), este procedimento foi realizado duas vezes. Deste lavado foi retirada uma alíquota de 10 µL para contagem do número de leucócitos totais.

6.1.2 Resultados e discussão

A injeção intra-articular de 2 mg de zymosan resultou na hipernocicepção inflamatória (Fig. 96A, p. 139), verificada por uma clara diminuição do limiar mecânico para o movimento de retirada da cabeça. Além disso, a injeção de zymosan resultou num aumento significativo no número de células polimorfonucleares como resposta à inflamação causada (Fig. 96B, p. 139). Para o tratamento, o extrato TTRE (0,20; 2,0 e 20 mg/kg) foi injetado via oral 1h antes da injeção intra-articular de zymosan e parcialmente reverteu a hipernocicepção inflamatória, comparado ao grupo controle, o qual foi tratado com indometacina e diminuiu significativamente o número de células polimorfonucleares.

Figura 96 – Efeito da administração de TTRE na hipernocicepção articular em ratos submetidos à indução de inflamação por Zymosan na ATM (A) e sobre o número total de leucócitos no lavado sinovial (B).

(B) (A)

solução salina. TTRE (0,2, 2 ou 20 mg/Kg) foi administrado 1 hora antes da indução de inflamação.

Os compostos isolados de T. toxicaria foram administrados via oral 1 h antes da injeção intra-articular de zymosan. O pré-tratamento com obovatina (1,0 e 10 mg/kg), deguelina (1,0 mg/kg) e 12a-hydroxi-α-toxicarol (1,0 e 10 mg/kg) aumentou o limiar nociceptivo, resultado semelhante aos grupos tratados com indometacina (C+) (Fig. 97, p. 140).

Figura 97 – Efeitos da administração de obovatina, deguelina e 12a-hydroxi-α-toxicarol na hipernocicepção articular em ratos submetidos à indução de inflamação por Zymosan na ATM.

Como esperado, a injeção de zymosan resultou num aumento significativo no número de leucócitos (grupo Zy), enquanto o grupo controle (Sham) não mostrou nenhuma mudança na contagem. O tratamento com os flavonoides reduziu a contagem de leucócitos para valores como do grupo tratado com Indometacina, a obovatina (10 mg/kg), deguelina (1,0 mg/kg) e 12a-hydroxi-α-toxicarol (1,0 mg/kg) apresentaram o melhor resultado na redução (Fig. 98, p. 141).

capazes de exercer efeitos antinociceptivos e anti-inflamatórios em disordem na ATM. Os três compostos testados reverteram os efeitos inflamatórios do zymosan.

Neste estudo, também foi avaliada a toxicidade sub-crônica na administração do extrato de T. toxicaria, através da análise bioquímica do sangue de animais tratados. As análises não revelaram sinais de toxicidade após o tratamento com o extrato. A massa total do corpo e os pesos do fígado, rim e coração (base húmida) foram normais. Os níveis séricos dos marcadores enzimáticos de função hepática (AST e ALT) não diferiram dos respectivos controles (Tabela 26, p. 141).

Figura 98 – Efeitos da administração de obovatina, deguelina e 12a-hydroxi-α-toxicarol sobre o número total de leucócitos no lavado sinovial.

Esta descoberta pode ser muito estimulante desde que T. toxicaria foi tão eficaz como a indometacina, usada como controle positivo. Para o melhor de nosso conhecimento, este é o pri meiro relatório a explorar o perfil de toxicidade de T. toxicaria. Os resultados deste estudo foram publicados na European Journal of Pain e outro trabalho submetido à publicação em Medicinal Chemistry Research (Apêndices A e B).

relativos de fígado, coração e rim. Grupo controle recebeu apenas veículo (solução salina) Solução salina TTRE, 20 mg / Kg Massa corporal antes (g) 25,58 ± 0,35 25,08 ± 0,43 Massa corporal depois (g) 29,42 ± 0,51 27,75 ± 0,49 Fígado / massa corporal (g) 5,03 ± 0,09 4,79 ± 0,08 Coração / massa corporal (g) 0,50 ± 0,02 0,51 ± 0,02 Rim / massa corporal (g) 1,66 ± 0,03 1,63 ± 0,05

AST 242,0 ± 54,01 247,4 ± 75,07

ATL 35,17 ± 10,71 33,12 ± 7,09

ALT, alanina amino transferase; AST, aspartato amino transferase