5 Testes em Tumores de Animais

No caso das metástases hepáticas de câncer colorretal o único tratamento curativo eficiente tem sido a ressecção cirúrgica, essa entretanto apresenta taxas de sobrevivência de 25% a 50% em 5 anos. [23] Dependendo da condição geral do paciente, do número de metástases, da localização, do volume do tumor e da invasão de tecidos vizinhos a ressecção completa desses tumores só é possível em 25% de todos os casos e isso está associado com a mortalidade perioperatória de 3% a 5% e uma morbidade de 20% a 40%. [24] Se essa ressecção não for completa muitas vezes é necessário lançar mão de alternativas com finalidade paliativa, dentre as quais se destacam quimioterapia sistêmica, quimioembolização intra- arterial, crioterapia dentre outros. Além desses, tratamentos utilizando corrente elétrica contínua de baixa intensidade e termoterapia induzida por laser também podem ser usados como alternativa para o tratamento paliativo com a finalidade de estimular a regressão do tumor. [25]

Em estudo comparativo das duas últimas técnicas mencionadas foi feito em ratos a fim de se constatar a eficácia e a segurança da utilização da eletroterapia foi constatada uma semelhança entre os resultados das duas técnicas. [25] Para tal os animais tiveram células de câncer colorretal implantadas na sua capsula hepática e era esperado até que esses desenvolvessem a doença. Logo após era avaliada a condição geral do animal, assim como a concomitância de outras metástases (como a pulmonar) que seriam motivo de exclusão dos mesmos do estudo. Obtendo-se uma amostra o mais homogênea possível estes foram divididos em 2 grupos os quais receberam tratamentos distintos para sua neoplasia. Um grupo foi tratado com termoterapia a laser, e o outro com eletroterapia com corrente contínua de baixa intensidade.[25]

A terapia com corrente elétrica direta foi efetuada através da inserção de cinco elétrodos de platina com um ângulo de 90 ° para a superfície do fígado com uma profundidade de penetração de 3 a 5 mm. Um ânodo foi colocado no centro do tumor, e quatro cátodos, a distâncias iguais sobre a borda visível entre o tecido do fígado saudável e o tumor. Os elétrodos foram mantidas firmemente em posição por meio de um cavalete de apoio. Em seguida, os elétrodos foram ligados a uma fonte

de corrente contínua de baixa intensidade que foi aplicada a um nível constante a 10 mA com 80C/cm3 tumor. [25]

Figura 2. Técnica de aplicação da eletroterapia em fígado de rato.

Schaefer N, Schafer H, Maintz D, Wagner M, Overhaus M, Hoelscher AH, et al. 2008

A termoterapia induzida por laser foi realizada usando um laser de Neodímio- YAG com um comprimento de onda de 1064 nm e uma fibra óptica nua, com um diâmetro de 600 m . Antes do início do tratamento, a energia do laser na extremidade da fibra foi calibrado a uma energia de 2 W e a fibra foi inserido no centro do tumor até a metade do comprimento do tumor (3-5 mm) com um ângulo de 90° para a superfície do fígado. A aplicação do laser de 2 W foi interrompida quando o centro do tumor começou a vaporizar-se com carbonização visível na fronteira entre a fibra e o tecido tumoral ou quando alterações térmicas visíveis típicas do tecidos tais como dessecação, encolhimento, ou rachaduras excediam o limite do tumor e começavam a afetar o tecido normal do fígado. O tempo de tratamento variou entre 5 a 10 min. [25]

Measurement of Tumor Volumes and Tumor Sizes Three weeks after tumor induction, all rats were anesthetized again and magnetic resonance imaging (MRI) of the livers was car- ried out on a 1.5 T Phillips ACS-NT human body scan (Phillips, Amsterdam, The Netherlands) with a 9.5-cm circular surface coil. The liver was scanned from the top of the diaphragm to its lowest edge, and continuous image slices with 3 mm thickness were ac- quired throughout the liver without intersectional space. The scan time was 3 min and 40 s, with a repetition time of 1800 ms and an echo time of 80 ms (T2-weighted turbo spin-echo sequences). The liver tumor volumes were calculated in cubic centimeters by sum- ming up of the individual tumor volumes in the sequential MRI liver sections and the largest tumor diameter measured as described before[43], (Fig. 1). After MRI evaluation of the evolved tumors and estimation of the tumor volumes, rats were divided into four groups. Seventeen animals were assigned to the electrical current treatment group (ECTG), seven to the electrical current control group (ECCG), nineteen to the laser treatment group (LTG), and six to the laser control group (LCG). Thus, the comparison groups included equal tumor numbers with almost identical tumor sizes, enabling statisti- cal comparison of the different groups.

After evaluation of tumor volumes, all animals underwent re- laparotomy and initial identification and manual measurement of the largest tumor diameters with a sliding caliper. With help of the evaluated tumor diameter, the tumor volume was estimated again by the formula for calculating the volume of a sphere V ! (4/3)*r3_to

correlate them to the tumor volumes calculated by MRI.

Direct Current and Laser Application

Direct electrical current therapy was carried out by inserting five platinum electrodes at an angle of 90° to the surface of the liver with a penetration depth of 3 to 5 mm. One anode was placed into the tumor center, and four cathodes at equal distances on the visible border between tumor and healthy liver tissue. The electrodes were held firmly in position by a supporting trestle. Next, the electrodes were connected with a current source and low-level direct current was applied at a constant level at 10 mA with 80C/cm3_{tumor as}

described before[39, 42](Fig. 2A and B).

Laser-induced thermotherapy was performed by using a Neodymium-YAG-Laser with a wavelength of 1064 nm and a bare optical fiber with a diameter of 600 !m. Before therapy onset, the laser energy at the fiber tip was calibrated to an energy of 2 W and the fiber was inserted into the tumor center halfway up the tumor length (3 to 5 mm) at an angle of 90° to the liver surface. The 2 W laser applica- tion was stopped when the center of the tumor started to vaporize with visible carbonization at the border between the fiber and the tumor tissue or when typical visible thermal tissue alterations, such as desic- cating, shrinking, and cracking of the surrounding tissue, exceeded the border of the tumor and began to affect the normal liver tissue (Fig. 3A and B). Treatment time varied between 5 to 10 min.

In the control groups, a sham operation was performed and after laparotomy and manual measurement of the tumor diameter, the laser fiber and the electrodes were placed in the above described manner without applying electrical current or laser energy. Finally, the abdominal wall was closed with two layers of running suture.

In an additional pilot study, we evaluated whether the different treatment modalities show a therapy related effect on liver function. Therefore, we performed blood tests of liver enzymes or products of

FIG. 2. (A) Intraoperative site during low-level direct current

therapy. The five platinum electrodes are placed inside and around

4™™™™™™™™™™™™™™™™™™™™™™™™™™™™™™™™™™™™™ the tumor (central—one anode; peripheral at tumor border—four cathodes). White foam and gas bubbles are formed at the entry side of electrodes into the tissue. (B) Intraoperative site after low-level direct current therapy. The sites of entry of the five electrodes are visible. (Color version of figure is available online.)

Figura 3. Técnica de aplicação da termoterapia a laser em fígado de rato.

Schaefer N, Schafer H, Maintz D, Wagner M, Overhaus M, Hoelscher AH, et al. 2008

O estudo confirmou que ambas as terapias são eficientes para o tratamento do Câncer. Os mecanismos biológicos e físicos que levaram ao efeito antitumoral da eletroterapia incluíram eletrolise com mudança no pH do tecido, mudança no potencial transmembrana da célula, microtrombose de vasos tumorais assim como apoptose. Entretanto, na própria discussão do estudo é levantada a possibilidade de um efeito térmico também contribuir para o resultado antitumoral apesar de estudos prévios descartarem a possibilidade do efeito térmico da eletroterapia com corrente contínua de baixa voltagem ter qualquer propriedade antitumoral. [25]

No grupo que foi tratado com laser houve uma resposta parcial de 78% dos casos e no grupo tratado com eletroterapia de 77%; já a resposta total foi de 21% no grupo tratado com eletroterapia e de 22% no grupo tratado com laser. Apenas um caso tratado com eletroterapia não demonstrou resposta ao tratamento. No grupo controle 100% dos tumores não obtiveram resposta. Resposta completa foi considerada a completa destruição do tumor à microscopia, resposta parcial foi considerada a ocorrência de massas tumorais em meio a necrose e fibrose extensas. Foi caracterizado como sem resposta o achado de mais de 50% de massa tumoral intacta. [25]

Apesar da similaridade entre os resultados o grupo tratado com laser obteve menor recorrência em 5 semanas que o grupo tratado com a eletroterapia, além disso os tumores em ratos são menores que em humanos o que facilitou a distribuição da corrente pelo tecido, os tumores em humanos são maiores e mais difíceis de serem tratados de forma semelhantemente eficiente com eletroterapia. Restam investigações acerca de eletrodos diferentes além de técnicas de

liver synthesis (GOT, GPT, bilirubin, GGT, albumin, LDH, ALP, coagulation parameters). As a result (not presented in the paper), we could observe a temporary postoperative increase in liver enzymes without any significant differences between the two treatment mo- dalities, and the two therapies were equally well tolerated by the treated rats.

Temperature Measurement

Intratumoral temperature was estimated at the beginning and at the end of the direct current and laser application with a digital thermometer (Greisinger Electronics GTH-1150, Regenstauf, Ger- many) and temperature measurement needles consisting of a NiCr-Ni alloy, which can measure temperatures between !50° and 1150°C. In the laser group, the measurements where carried out with inserted needles at four different locations: (1) center of the tumor next to the fiber, (2) the tumor border, (3) 2.5 mm, and (4) 5 mm away from the tumor in the normal tissue. In the electric

current group, we measured the temperature between the central anode and the cathodes in the tumor tissue.

Histopathogical Examination

All animals were sacrificed 5 wk after treatment. Livers were removed for histological examination and fixed in 4% formalin (buff- ered at pH 7.0) for 1 wk (Fig. 4A and B). After identification of the tumor-bearing or post-therapeutic necrotic areas, these were cut into 5 to 10 representative thicker slices to identify the largest tumor diameter, which was measured again with a sliding caliper. Next, the tissue specimens were embedded in paraffin and sectioned at 5 to 7!m. The sections where prepared with different standard staining methods (hematoxylin and eosin, periodic acid-shift reaction, Masson- Goldner, Elastica van Gieson, Berlin-blue reaction). Light microscopy

FIG. 4. (A) Formalin fixed liver 5 weeks after sham operation

and sham laser therapy (laser control group) showing two large vital liver metastases with a diameter of about 2.0 to 2.5 cm in two different liver lobes. (B) Formalin fixed liver 5 wk after LITT (laser treatment group) showing three treatment areas in three different liver lobes. Clearly visible is the central carbonization channel where the fiber was placed surrounded by heat altered necrotic tumor and liver tissue. (Color version of figure is available online.)

FIG. 3. (A) Intraoperative site during interstitial laser therapy.

The laser fiber is placed central into the tumor tissue. Two vital untreated liver tumors are visible in the bordering liver lobes. (B) Intraoperative site after interstitial laser therapy. The site of entry of the laser fiber with its central carbonization channel and adjacent coagulated tissue is visible. (Color version of figure is available online.)

estimulação menos invasivas e por consequência menos desconfortáveis para o paciente. [25]

Em estudo visando avaliar a eficácia da eletroterapia para a regressão de carcinomas mamários em ratos foi demonstrado que que havia maior destruição dos tecidos na região do ânodo e que a destruição tecidual era sempre maior quando o ânodo era colocado no centro do tumor em comparação com quando o cátodo era colocado no centro do tumor. [17] GRIFFIN et al. também demonstrou que quando comparados os resultados dos tratamentos de vários tumores de ratos com volumes iniciais semelhantes é possível observar uma clara redução desses tumores mais evidente na reação catódica quando considerados correntes com características semelhantes na reação anódica. Em contrapartida foi demonstrado também que os efeitos colaterais também são maiores na região anódica apesar de terem mostrado depender principalmente da área destruída do tumor (a ser discutido em parte específica da discussão). No caso desse tipo de terapia foi evidente a eficácia da eletroterapia na redução do tamanho do tumor como impedindo a progressão da doença. [17]

Em outra observação dos efeitos da corrente contínua em metástase hepáticas de câncer colorretal foi encontrada uma resposta total de 20.9% (sumiço do tumor) ao tratamento e de 77.1% de resposta parcial (encontro de mais áreas de destruição que de tumor saudável à microscopia) à eletroterapia, levando a crer que o aperfeiçoamento da técnica pode representar um grande avanço para o tratamento do câncer uma vez que foi encontrada uma relação forte entre a posição de eletrodos e outros fatores e o desaparecimento dos tumores abrindo espaço para mais estudos acerca do assunto. [19]