O desenvolvimento e o uso de biomarcadores para o estudo do processo carcinogênico representam um campo importante na elucidação do papel da nutrição na carcinogênese e na determinação dos mecanismos envolvidos nesse processo (149).
A toxicidade genética, apesar de não ser uma medida de carcinogenicidade, é freqüentemente usada como um indicador para o câncer, uma vez que os testes de mutagenicidade medem eventos iniciais ou intermediários da tumorigênese (150). O estudo das alterações cromossômicas é essencial para a toxicologia genética, pois constituem um evento importante na carcinogênese (151). O uso de marcadores associados a esses eventos podem constituir importantes ferramentas na detecção precoce do câncer (152).
Entre os vários biomarcadores de danos ao DNA existentes, o teste do micronúcleo e o teste cometa são os mais citados na literatura, avaliando-se o potencial mutagênico e quimiopreventivo de diversas substâncias em estudos in vitro e in vivo. Segundo Fenech (151), o teste do micronúcleo tem se destacado como um dos métodos efetivos para a análise de danos cromossômicos devido à sua capacidade de detectar perda e quebra cromossômica (Figura 12). Além disso, permite determinar o mecanismo de ação das substâncias que estão sendo testadas. Substâncias que promovem a perda de cromossomo detectável pelo teste do micronúcleo são definidas como agentes aneugênicos que induzem aneuploidia ou segregação cromossômica anormal. Enquanto que as substâncias que promovem a quebra cromossômica são definidas como agentes clastogênicos (153, 154).
Figura 12 – Formação de micronúcleos. Os micronúcleos podem constituir um cromossomo inteiro ou fragmentos de cromossomos acêntricos. Fonte: Modificado de Fenech (151).
O micronúcleo é definido como uma pequena massa nuclear delimitada por membrana e separada do núcleo principal (Figura 13). Os micronúcleos são formados durante a telófase da mitose ou meiose. São resultantes de fragmentos cromossômicos acêntricos ou de cromossomos inteiros que não foram incluídos no núcleo principal. Os mecanismos que levam à formação de micronúcleos são a perda de cromatina em conseqüência ao dano cromossômico estrutural ou dano no aparelho mitótico. Os danos ao DNA são expressos em micronúcleo após um ciclo de divisão celular, sendo, portanto, dependentes da cinética celular (155).
O teste do micronúcleo foi inicialmente desenvolvido em eritrócitos da medula óssea de camundongos por Schmid (156). Atualmente, os eritrócitos medulares e linfócitos periféricos de roedores, células esfoliadas da mucosa jugal de pacientes e cultura de linfócitos também são analisados no teste do micronúcleo (151, 157, 158).
O teste do micronúcleo em medula óssea é um dos testes mais aplicados para avaliação da genotoxicidade de substâncias. Durante o processo de eritropoiese, quando um eritroblasto se transforma em eritrócito policromático (EPC) ou eritrócito jovem, o núcleo principal é excluído. Qualquer dano estrutural ou numérico pode resultar na formação de micronúcleos, o qual permanece no citoplasma. O aumento da freqüência de EPCs micronucleados (EPCMNs) em animais tratados com agentes genotóxicos indica indução de danos cromossômicos (157).
Durante a maturação, os EPCs perdem RNA a adquirem uma alta concentração de hemoglobina, tornando-se, então, eritrócitos normocromáticos (ENCs) ou eritrócitos maduros/hemáceas. Estes últimos são transferidos para os
compartimentos da circulação periférica (157). Tanto os EPCs, como os ENCs podem ser visualizados na medula óssea de roedores com coloração diferenciada (157). Os EPCs, como contêm muito RNA, coloram-se de azul, enquanto que os ENCs, como são mais ácidos, coloram-se de rosa (Figura 13).
Figura 13 – Esfregaço de medula óssea corado com Leishman. Eritrócitos policromáticos em azul e eritrócitos normocromáticos em rosa de medula óssea de ratos. As setas indicam eritrócitos policromáticos micronucleados. Fonte: Krishna e Hayashi (157).
Em algumas situações experimentais, o sangue periférico pode ser utilizado como amostra para análise de micronúcleos. Nesse caso, analisam-se os ENCs ao invés dos EPCs. Além disso, a proporção de EPCs/ENCs analisados em amostras de medula óssea de animais fornece um índice de citotoxicidade (157).
O teste do micronúcleo em cultura de linfócitos é o teste empregado para análise de MNs in vitro. Como o micronúcleo pode ser expresso apenas em células que completaram a divisão celular, um método especial foi desenvolvido para identificar células com aparência binucleada a partir do bloqueio da citocinese, utilizando-se a citocalasina-B (Cyt-B), um inibidor da organização de microfilamentos (151). O teste do micronúcleo em células binucleadas (CBMN) permite uma melhor precisão dos dados devido às condições controladas de cultura. Usando critérios morfológicos, esse teste permite a detecção de quebra e perda cromossômica, rearranjos cromossômicos (pontes nucleoplásmicas), inibição da divisão celular, necrose e apoptose (151).
Atualmente, a freqüência de micronúcleos in vivo é o primeiro dos vários parâmetros de genotoxicidade existentes. Além disso, o teste do micronúcleo é recomendado por agências regulatórias existentes no mundo inteiro para ser conduzido como parte de avaliação de segurança de diversas substâncias (157).
A existência do programa colaborativo internacional, The human micronucleus project (HUMN), estabelecido em 1997 por vários laboratórios, foi inicialmente organizado para o estudo da freqüência de micronúcleos na população humana. Hoje, tem como objetivo a padronização de metodologias, a definição de taxas basais da freqüência de micronúcleos, a caracterização dos efeitos dos fatores demográficos, genéticos e metodológicos sobre estas freqüências. O projeto ainda estabelece o objetivo de determinar se as freqüências de micronúcleos podem ser preditivas para o risco de câncer em diferentes tecidos (158). Todos esses esforços corroboram para a efetividade e confiabilidade do teste do micronúcleo.
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