Transdutores electroquímicos

Devido à sua simplicidade, a transdução electroquímica constitui uma boa alternativa para criar bio-sensores de baixo custo quando acoplados a enzimas. Contudo, a detecção electroquímica de uma imuno-reacção é difícil, e por isso torna-se necessário o uso de enzimas que levem à formação de substâncias electroactivas. Este tipo de bio-sensores está vastamente descrito na literatura, e muitos deles foram comercializados com bastante sucesso. Descrevem-se aqui as três principais classes de bio-sensores electroquímicos: potenciométricos, amperométricos e medições de condutância/capacitância.

1.4.1.1. Potenciométricos

Usualmente, a potenciometria era usada na medição de pH, mas a partir de 1965, quando apareceram eléctrodos capazes de seleccionar iões, esta técnica teve um grande crescimento [Sharma et al. 1994] e a sua aplicação aos bio-sensores começou a ser explorada.

Neste tipo de medição detecta-se a variação no potencial eléctrico que ocorre após a ligação de um dado analíto (por exemplo, anticorpos ou antigénios) ao elemento imobilizado. A diferença de potencial é medida entre um eléctrodo, onde ocorre a imobilização, e um eléctrodo de referência. O potencial desenvolvido está relacionado com a actividade do analíto na amostra através da

relação de Nernst [Sharma et al. 1994]. O uso de membranas selectoras de iões pode tornar estes transdutores sensíveis a vários iões (e. g. H+_{, F}-_{, I}-_{) e gases como o CO}

2 e NH3 [Sharma et al.

1994]. Este tipo de transdução tem sido usada para medir a actividade de enzimas como a penicilinase, urease, oxidase de glucose, acetilcolinesterase [Sharma et al. 1994], dinitrofenol, e fenilacetato [Marco et al. 1996]. A utilização deste tipo de transdução em imuno-sensoreses tem como principal desvantagem o facto de que a variação no potencial devida à interacção entre o anticorpo e o antigénio é demasiado pequena (1-5 mV) [Marco et al. 1996], e por isso a fiabilidade e sensibilidade das análises estão limitadas por efeitos de ruído de fundo.

Um outro tipo de transdutores potenciométricos bastante usados em bio-sensores são os Transistores de efeito de campo sensores

de iões (ISFET – ion-sensitive field effect transistors) [Sethi 1994;

Sharma et al. 1994; Marco et al. 1996], que se baseiam em semicondutores. Nestes transdutores a condutância entre a source e a drain é modulada pela tensão da gate através do efeito de campo num semicondutor. A membrana da gate é usualmente construída de nitreto de silício (Si3N4) que é sensível a protões, mas

pode ser construída de outros materiais para ser sensível a Na+_,

K+_{, Ca}2+_{, NH}4+_{, Ag}+_{, Cl}- _{e Br}- _{[Sharma et al. 1994]. Estes}

dispositivos podem ser construídos quer como condensadores quer como transistores de efeito de campo. A miniaturização destes sensores num integrado e a sua integração num sistema completamente automatizado é facilmente realizada. Uma variante deste tipo de transdutores são os ENFET (Enzyme-sensitive field –

effect transistors), que se obtêm dos INFET aplicando uma camada

fina de uma enzima sobre a membrana selectora de iões. Estes dispositivos já foram usados para detectar glucose, ureia, potássio [Sethi 1994], paratião, DFP, cianeto [Paddle 1996].

Fig. 1.3. Dispositivo potenciométrico [Sharma et al. 1994].

Os light-adressable potenciometric sensors (LAPS) [Marco et al. 1996] são um outro tipo de bio-sensor potenciométrico, também baseados em transistores de efeito de campo. A diferença entre eles está no mecanismo usado para detectar variações no potencial eléctrico no interface silício-isolador. Os LAPS medem uma foto- corrente gerada devido à incidência de luz na amostra. Existe no mercado um dispositivo baseado neste princípio que se chama ThresholdTM _{da Molecular Devices. Estes dispositivos já foram}

usados para detectar DFP, Soman, Paraoxon, toxina naja-naja, toxina mojave, ricína, as bactérias Neisseria Meningitidis, Brucella

Militensis e Francisella Tularensis [Paddle 1996].

Embora existam na literatura muitos exemplos de bio-sensores potenciométricos [Sharma et al. 1994], as dificuldades numa imobilização consistente e o número limitado de enzimas que podem ser colocadas nestes transdutores continuam a ser um desafio.

1.4.1.2. Amperométricos

Este tipo de dispositivos medem a corrente gerada pela oxidação ou redução de espécimes redox na superfície de um eléctrodo, que é mantido a um determinado potencial eléctrico. A corrente observada tem uma relação linear com a concentração de espécies electroactivas.

O facto de que uma determinada tensão nos eléctrodos é essencial para que ocorra uma reacção específica requer a inclusão de um eléctrodo de referência, com potencial conhecido, fixo e estável. Por exemplo, um eléctrodo de referência de prata/cloreto de prata tanto no estado sólido como no estado líquido é muito usado [Sharma et al. 1994]. Outros materiais como a platina, ouro ou carbono são também muito usados. Adjacente ao eléctrodo, encurralado por uma membrana ou directamente imobilizado, encontra-se um dos imuno-reagentes envolvidos num arranjo imunológico competitivo. Em certas circunstâncias, tais como valores de pH elevados, uma célula de três eléctrodos com um eléctrodo de referência adicional é usada com um circuito modificado, empregando potenciostática em vez de uma simples fonte de corrente contínua.

Fig. 1.4. Circuito para medição amperométrica usando dois

Normalmente, este tipo de bio-sensores usam enzimas como as oxireductases ou enzimas hidrolíticas que convertem analítos não activos electroquimicamente, em produtos que podem ser oxidados ou reduzidos num eléctrodo, mantido a um potencial específico em relação ao eléctrodo de referência.

Por vezes o substrato ou o produto da reacção enzimática podem ser medidos amperometricamente sem se recorrer a um mediador. Estes sensores são chamados de eléctrodos de enzimas amperométricos não mediados.

Embora este tipo de bio-sensores seja dos que mais aparece na literatura, eles têm uma série de limitações relacionadas com a cinética de saturação das enzimas e o grande potencial necessário para a oxidação do analíto que pode provocar a oxidação de outros compostos (por exemplo, o ácido ascórbico e ácido úrico, que estão presentes em muitas amostras biológicas). Além disso, a corrente medida pode ser afectada por uma série de parâmetros, tais como o potencial de funcionamento e a natureza dos eléctrodos, a adsorção, difusão e cinética química não relacionadas com o analíto de interesse. No entanto, uma série de inovações têm surgido na literatura que ajudam a ultrapassar estas limitações [Sharma et al. 1994]. Por exemplo: o uso de membranas que limitam a difusão mantém a concentração do substrato abaixo dos níveis de saturação das enzimas, e também reduz as variações na sensibilidade devidas às variações da actividade enzimática; o uso de mediadores para a oxidação-redução, que facilita a transferência de electrões da enzima para o eléctrodo polarizado, pode reduzir o potencial necessário para a detecção do analíto. Este tipo de transdutores é usado para detectar uma enorme quantidade de analítos, como por exemplo, lactose [Sharma et al.

1994], glucose, galactose [Sethi 1994], alguns herbicídas [Marco et al. 1996], paraoxon, cianeto, ocratoxina [Paddle 1996].

1.4.1.3. Medições de condutância-capacitância

As medições de conductividade tiveram início nos finais do século XIX (Friedrich Kohlrausch 1840-1910). Usando uma definição simples, a condutividade K de um electrólito é a condutância G de uma célula com dois eléctrodos afastados de uma distância d de 1 cm, em que a área A dos eléctrodos é 1 cm2_{, ou seja K=Gk, em que} k=d/A é a constante da célula [Sharma et al. 1994]. Portanto, é

possível monitorizar reacções químicas que alteram a condutividade global da solução, quer produzindo quer consumindo espécimes iónicos. A resistência da solução é determinada pela medição da mobilidade iónica que envolve a migração de todos os iões presentes. Estas medições podem ser aplicadas quer em líquidos condutores quer em materiais sólidos. Em materiais não condutores podem medir-se variações na polarização de cargas fixas. Este tipo de bio-sensores são considerados relativamente não específicos.

Várias configurações de eléctrodos interdigitais planares têm sido referidas na literatura como transdutores condutimétricos para bio- sensores [Sharma et al. 1994; Sethi 1994]. Enzimas como a urease foram imobilizadas em eléctrodos interdigitais planares para medir a decomposição de ureia em amónio, bicarbonato e iões hidroxílicos [Sharma et al. 1994]. Um dispositivo baseado no uso de um polímero condutor dopado com iodo, no qual se imobilizaram anticorpos específicos, foi usado para detectar atrazina [Marco et al. 1996]. Com este tipo de transdutores também se detectou a asparagina, a creatinina [Sethi 1994], a atrazina [Haupt 1999], entre outros.

1.4.2. Transdutores calorimétricos

Um dispositivo calorimétrico mede a presença ou concentração de espécimes químicas registando variações na temperatura devidas à presença desses mesmos espécimes químicos. A variação de temperatura pode ser devida a uma reacção exotérmica ou endotérmica, ou devida a uma variação da condutividade térmica do meio originada por um gradiente de temperatura entre o transdutor e o meio envolvente. Existem disponíveis três tipos de sensores calorimétricos: catalíticos, piroeléctricos e os que se baseiam no efeito de Seebeck [Sharma et al. 1994]. Dada a natureza exotérmica da maioria das reacções catalisadas por enzimas, os termistores de enzimas são transdutores potencialmente versáteis.

Uma vasta gama de analítos, como a ureia, glucose, etanol, lactato, penicilina, oxalato, sacarose e urato [A. Sharma et al. 1994] têm sido medidos com estes transdutores.

1.4.3. Transdutores ópticos

As medições ópticas podem basear-se em várias técnicas de transdução: absorção ou emissão de luz pelos reagentes, fluorescência, fosforescência, polarização, rotação, interferência, etc. A escolha da técnica depende da aplicação e sensibilidade pretendidas. Os primeiros desenvolvimentos deste tipo de sensores deveram-se à flexibilidade e baixo custo das fibras ópticas. As fibras ópticas podem ser acopladas a praticamente todas as técnicas ópticas. O formato do bio-sensor pode envolver detecção directa do analíto ou detecção indirecta através de amostras rotuladas opticamente.

1.4.3.1. Sensores de onda evanescente

A reflexão interna total tem sido usada em guias de onda planares ou de fibra óptica como transdutor do sinal em inúmeros bio- sensores referidos na literatura [Sharma et al. 1994]. Nestes transdutores, a luz propaga-se num guia de onda gerando uma onda electromagnética (onda evanescente) no interface entre o guia de onda, opticamente mais denso, e o meio adjacente, opticamente menos denso. A amplitude desta onda decresce exponencialmente com a profundidade no meio opticamente menos denso. A profundidade de penetração do campo evanescente é defenida como sendo a distância em que a sua intensidade foi reduzida para 1/e do seu valor no interface e, geralmente, tem um valor de algumas dezenas de nanómetros. A profundidade de penetração depende do ângulo de incidência no interface e é proporcional ao comprimento de onda da luz excitadora. Quando moléculas com um espectro de absorção que inclui o comprimento de onda da luz excitadora estão dentro do campo evanescente, absorvem energia levando a uma atenuação da luz reflectida no guia de onda. Porém, a sensibilidade conseguida não é suficiente. É necessário usar moléculas rotuladas capazes de reemitir os fotões absorvidos a um comprimento de onda maior, como a fluorescência. Esta fluorescência pode ser recolhida quer fora do guia de onda quer acoplando as frequências de emissão de volta ao guia de onda. Este tipo de bio-sensores podem detectar uma grande quantidade de analítos, como por exemplo, atrazina, terbutrina, bifenílicos, paratião [Marcos et al. 1996], paraoxon, bungarotoxina, toxina botulínica, ricina, yersinia pestis, vírus da doença de

Newcastle, bacillus anthracis [Paddle 1996], etc. Recentemente,

outros tipos de sensores de onda evanescente, como os grating

sem recorrer a rótulos fluorescentes [Marco et al. 1996].

No grating coupler mede-se a variação do ângulo crítico provocada pela imuno-reacção. O ângulo crítico é o ângulo que produz a reflexão interna total e é muito sensível ao índice de refracção e à espessura da camada de moléculas dentro do campo evanescente. Desta variação pode calcular-se o índice de refracção total devido ao efeito do campo evanescente. Considerando que o índice de refracção, n1, do guia de onda é constante, pode obter-se uma espessura. Este princípio tem sido usado para desenvolver imuno- sensoreses que medem terbutrina e atrazina sem recorrer a rótulos, embora a sua sensibilidade ainda seja baixa [Marco et al. 1996].

Num interferómetro de Mach-Zehnder a luz é dividida em dois braços: um tem a camada sensora e o outro serve de referência. O campo evanescente no braço medidor recolhe informação acerca da imuno-reacção, devido à variação provocada no índice de refracção. Consequentemente, a velocidade da onda neste braço varia. No fim, a recombinação das ondas dos dois braços permite a observação de interferência construtiva ou destrutiva, que se relaciona com a imuno-reacção que ocorreu no braço sensor.

Fig. 1.5. Princípio de funcionamento de alguns bio-sensores

ópticos. a) Bio-sensor de guia de onda de campo evanescente (CE). O campo evanescente excita as moléculas rotuladas num arranjo competitivo. A fluorescência é acoplada de volta ao guia de onda

b) Grating coupler. O ângulo a que acontece a reflexão total é afectado pelas moléculas que estão dentro do campo evanescente.

b) Interferómetro de Mach-Zehnder. A luz deivide-se em dois braços, um que tem a bio-molécula apropriada, e o outro que actua

como referência. Como consequência da interacção biológica, a recombinação das ondas permite a observação de interferências

1.4.3.2. Surface plasmon resonance (SPR)

Um surface plasmon resonance é um campo electromagnético evanescente gerado à superfície de um condutor metálico (usualmente Ag ou Au) quando excitado pelo impacto de luz com um comprimento de onda apropriado a um determinado ângulo (p). Surface plasmons são gerados por electrões à superfície do metal e

comportam-se de modo diferente dos do interior do metal. Estes electrões são excitados pela luz incidente, produzindo uma oscilação (ressonância) a uma frequência diferente da do interior do filme metálico. A absorção de energia pelos surface plasmons durante a ressonância é observada como um mínimo na reflectância da luz quando o ângulo de incidência variável atinge um valor crítico. Este ângulo crítico depende do comprimento de onda e estado de polarização da luz incidente, e também das propriedades dieléctricas do meio adjacente à superfície metálica. Portanto, é afectado pelos analítos que se ligam a essa superfície. Este princípio permite assim a monitorização de interacções biológicas. Como um exemplo, o dispositivo comercial BIAcore™ da Pharmacia foi usado para detectar atrazina [Marco et al. 1996]. Um sistema chamado IAsys™ desenvolvido pela Fisons pode monitorizar eventos de ligação em tempo real [Marco et al. 1996]. Este sistema explora uma nova forma de bio-sensores ópticos que combinam a tecnologia dos guias de onda com o fenómeno da

Fig. 1.6. Diagrama esquemático do surface plasmon resonance

(SPR) [Sharma et al.1994].

1.4.3.3. Reflectometric interference spectroscopy (RIFS)

O princípio básico destes sensores baseia-se na luz reflectida que se produz quando um feixe de luz passa através de um filme fino. Um feixe de luz que passa num interface entre dois meios com índices de refracção diferentes será parcialmente reflectido. Portanto, um filme fino transparente produzirá um conjunto de feixes reflectidos em cada um dos interfaces, que podem ser considerados como sendo apenas dois feixes reflectidos quando a reflectância dos interfaces é pequena (< 0,05). Estes feixes terão uma diferença de fase () que se relaciona directamente com a espessura do filme. Se o produto entre a diferença de fase e o comprimento de onda for inferior ao comprimento de coerência da fonte de luz, então os dois feixes interferem, originando uma modulação da intensidade da luz como consequência da interferência construtiva e destrutiva. Assim, através das variações do espectro de interferência podem determinar-se variações na espessura do filme. Este princípio foi aplicado num imuno-sensores para a detecção de atrazina [Marcos et al. 1996].

Os bio-sensores piezoeléctricos baseiam-se principalmente na medição de uma variação na frequência de ressonância de um cristal piezoeléctrico como resultado de variações de massa na sua superfície. Estas são causadas pela interacção de analítos com um agente bio-específico imobilizado na superfície do cristal. Normalmente, a frequência de vibração do cristal diminui à medida que o analíto se liga ao receptor imobilizado na superfície. Em geral, os imunosensores piezoeléctricos podem adoptar dois modos principais (Fig. 1.7): dispositivos de ondas acústicas superficiais e dispositivos de ondas acústicas longitudinais.

Existem descritas na literatura inúmeras aplicações deste tipo de bio-sensores. Por exemplo, detecção de substâncias como imunoglobulinas G e M, cocaína, polisacaridas, hormônas, ácidos nucleicos, enzimas [Ngeh-Ngwainbi et al. 1990], albmina humana [Muratsugu et al. 1993], clorofórmio, cloro-benzeno [Liron 1997], vírus da herpes [Konig et al. 1994], pesticidas [Marco et al. 1996], ricina, yersinia pestis, salmonella typhomurium [Paddle 1996].

1.4.4.1. Dispositivos de ondas acústicas longitudinais

Nesta configuração (Fig. 1.7.a) tem-se um disco de um material piezoeléctrico com eléctrodos em ambas as faces ligados a um circuito oscilador. A ressonância ocorre em toda a massa do cristal. Se um cristal com um anticorpo imobilizado numa das suas faces é colocado num ambiente que contenha o antigénio específico ocorre uma imuno-reacção entre os anticorpos e os antigénios, que produz um aumento na massa do cristal. Então, a frequência de ressonância decresce de acordo com a equação de Sauerbrey: f=- 2.3x106_f 2_{(m/A), em que f é a frequência de oscilação em Hz, m é}

Fig. 1.7. Desenho esquemático de imuno-sensoreses

piezoeléctricos. A frequência de oscilação do cristal piezoeléctrico depende da sua massa. (a) Num dispositivo de ondas longitudinais toda a massa do cristal oscila a uma frequência diferente depois da

interacção biológica. (b) A onda acústica gerada entre os dois conjuntos de eléctrodos ao longo da superfície do cristal altera a

sua frequência como consequência da imunoreacção.

Os cristais são geralmente de quartzo e operam a frequências que podem ir até a algumas dezenas de MHz. Estes sensores são normalmente designados de micro-balanças de cristais de quartzo (em inglês QCM, quartz crystal microbalance). Estes dispositivos podem operar em líquidos e têm limites de detecção de massa da ordem de 10-10 _{a 10}-11 _{g [Sharma et al. 1994]. Por exemplo, Suri}

conseguiu detectar imunoglobulinas M em concentrações que variavam entre 10-6 _{e 10}–2 _{mg/ml [Suri et al. 1994].}

Existe também descrito na literatura um outro bio-sensor piezoeléctrico que utiliza um filme fino do polímero difluoreto de polivinilideno (PVDF) [Walton et al.1993]. Neste dispositivo o filme de PVDF está inserido num circuito oscilador, que faz com que o filme oscile longitudinalmente. A frequência de oscilação depende das dimensões do contentor onde está inserido o filme e da velocidade da onda acústica. O filme de PVDF tem eléctrodos em

de PVDF, os autores afirmam que podem chegar a sensibilidades muito superiores às das micro-balanças de cristais de quartzo. Este bio-sensor foi testado com albumina bovina e imunoglobulinas G. Porém, os autores não fornecem valores para os limites de detecção pois o trabalho estava numa fase preliminar.

1.4.4.2. Dispositivos de ondas acústicas superficiais

Este tipo de dispositivo (Fig. 1.7.b) é basicamente constituído por dois conjuntos de eléctrodos interdigitais simétricos evaporados na superfície de um cristal piezoeléctrico. Aplicando um sinal eléctrico alternado a um dos conjuntos de eléctrodos, gera-se uma onda acústica. Esta onda é recebida pelo outro conjunto de eléctrodos, situado a alguns milímetros na extremidade oposta do cristal, e é convertida de novo num sinal eléctrico. A frequência, tempo de propagação e modo da onda acústica que se propaga através do cristal variam com o espaçamento entre os “dedos” dos eléctrodos interdigitais, o espaçamento entre os conjuntos de eléctrodos, o corte e espessura do cristal.

Na área entre os dois conjuntos de eléctrodos (isto é, no caminho de propagação da onda acústica) imobiliza-se um elemento de reconhecimento biológico – anticorpos, por exemplo. Quando uma solução que contenha o antigénio específico é colocada sobre esta área, o antigénio liga-se ao material imobilizado. Isto resulta num aumento da massa do cristal, afectando assim a frequência da onda propagada. A variação na frequência está directamente relacionada com a interacção anticorpo-antigénio. As frequências de operação podem ir até algumas centenas de MHz, o que lhes confere uma maior sensibilidade relativamente às QCM. Porém, têm dificuldades de operação com líquidos devido ao excessivo amortecimento do sinal. Este tipo de sensores são também muito usados na detecção

de gases. Por exemplo, Hok conseguiu detectar CO2 com uma

2. PROPRIEDADES DO PVDF

2.1. INTRODUÇÃO

O monómero fluoreto de vinilideno, CH2=CF2, foi sintetizado pela

primeira vez em 1901 por F. Swarts. Este monómero é um gás a temperaturas e pressões normais. O polímero difluoreto de polivinilideno (PVDF) é obtido deste monómero através de uma reacção de polimerização. O PVDF é conhecido desde os anos 40 e era usado como revestimento, isolador eléctrico e em equipamentos de processamento químico. Até aos anos 60 os dispositivos piezo e piroeléctricos usavam cristais como o quartzo e o tantalato de lítio, ou cerâmicas policristalinas como as