UNIVERSIDADE NOVA DE LISBOA
Departamento de Ciência dos Materiais
Desenvolvimento de um Bio-sensor
Baseado num Polímero Piezoeléctrico
Por
Paulo Alexandre dos Reis Fernandes Inácio
Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do grau de
Mestre em Instrumentação, Manutenção Industrial e Qualidade
Orientador científico: Prof. Carlos Jorge Mariano Miranda Dias
deste trabalho. Várias foram as dificuldades e momentos de desânimo por que passei ao longo deste trabalho. Graças à sua orientação, apoio e amizade tudo isso foi ultrapassado. Muito obrigado.
Um especial obrigado ao Prof. Marat-Mendes, responsável da Secção de Materiais Electroactivos. O seu apoio, confiança e amizade foram fundamentais para a conclusão deste trabalho.
Ao Mestre Rui Igreja, pelos conselhos e ajudas que me deu, pela sua disponibilidade e amizade ao longo de todo este tempo.
À Dra. Carmo Lança, eterna companheira de laboratório, pela sua amizade e boa disposição, por todo apoio que me deu.
Ao Prof. Eugen Neagu, companheiro de gabinete, pelas inúmeras úteis e interessantes conversas.
Ao Prof. Abel Oliva, do IBET, pela sua disponibilidade e paciência, nunca deixou de me aconselhar sempre que solicitei a sua ajuda. Ao Prof. Cruz Serra, do Departamento de Engenharia Electrotécnica do I.S.T., pela disponibilização do equipamento para as medidas de impedância.
Uma palavra de reconhecimento à Prof.ª Maria Amália Bento pela sua amizade e boa diposição.
Agradeço aos técnicos de laboratório Rui Costa e Miguel Moreira pela ajuda na realização de algumas experiências.
A todos os que de algum modo me ajudaram.
Aos meus Pais, que em todos os momentos e situações me apoiaram.
filme baseado no polímero piezoeléctrico difluoreto de polivinilideno (PVDF). Usaram-se dois tipos de PVDF para a construção dos filmes: o PVDF Solef, que tem boas propriedades piezoeléctricas, e a membrana Immobilon-P, que é um tipo especial de PVDF poroso e que tem boas capacidades de adsorção de proteínas. Inicialmente pretendia-se desenvolver filmes baseados apenas na membrana Immobilon-P. Face às dificuldades sentidas com esta membrana, resolveu-se depois utilizar apenas o PVDF Solef. Finalmente, construíram-se filmes que combinavam o Immobilon-P e o PVDF Solef.
Faz-se uma revisão das propriedades gerais e electroactivas do PVDF e de conceitos como a ferroelectricidade, piezoelectricidade e piroelectricidade.
Descrevem-se experiências que demonstram que a membrana Immobilon-P tem propriedades electroactivas, e os processos pelos quais esta membrana tem que passar para adquirir propriedades piezoeléctricas.
Descrevem-se as configurações por que passou o bio-sensor ao longo deste trabalho, os processos de construção de todos os filmes utilizados, a instrumentação e diversos circuitos eléctricos e os porta-amostras para acondicionar os filmes.
Descrevem-se as diversas experiências realizadas com cada uma das configurações do bio-sensor. Discutem-se os resultados obtidos em cada uma das experiências, e apontam-se as razões que levaram à necessidade de se passar de uma dada configuração para outra, até se chegar à configuração actual.
of the piezoelectric polymer polyvinylidene difuoride (PVDF). Two types of PVDF were used to build the films: the PVDF Solef, which has good piezoelectric properties, and the Immobilon-P membrane, which is a special type of porous PVDF with good protein binding capacities. Initially it was intended to build films based only on the Immobilon-P membrane. But due to experimental difficulties with this membrane, it was decided to use only the PVDF Solef. Finally, films combining both the PVDF Solef and the Immobilon-P were built.
A review of the general and electroactive properties of the PVDF, as well as concepts like ferroelectricity, piezoelectricity and pyroelectricity, are presented.
Experiments showing that the Immobilon-P membrane has electroactive properties, and the processes through which the membrane aquires piezoelectric properties, are described.
All the configurations of the biosensor used in this work, all the processes to build the films, the instrumentation and electronic circuits, and the film container, are described.
The several experiments made with each of the biosensor’s configuration are presented. Results obtained in each of the experiments are discussed, and reasons that lead to the necessity to adopt a different configuration for the biosensor until the actual configuration was reached, are presented.
C Capacidade eléctrica (F) cE 11 Constante elástica (N/m2) cE 33 Constante elástica (N/m2) sE 11 Constante elástica (m2/N) C Calor específico (J/kgK) D Deslocamento eléctrico (C/m2) d Constante piezoeléctrica (C/N) E Campo eléctrico (V/m) e Constante piezoeléctrica (C/m2) Ec Campo coercivo (V/m)
Epol Campo eléctrico de polarização (V/m)
F Força (N)
f Frequência (Hz)
f0 Frequência de ressonância (Hz)
g Constante piezoeléctrica (V.m/N)
h Constante piezoeléctrica (V/m) I Corrente eléctrica (A)
k Coeficiente de acoplamento electromecânico
kt Coeficiente de acoplamento electromecânico, modo
espessura
L Comprimento (cm)
m Massa (kg)
PR Polarização remanescente (C/m2)
p3 Coeficiente piroeléctrico (C/Km2)
PBS Solução tampão (phosphate buffered saline) PVDF Difluoreto de polivinilideno
Q Carga eléctrica (C)
QCM Microbalanças de cristais de quartzo R Resistência eléctrica ()
v1 Velocidade do som (m/s), ondas transversais
v3 Velocidade do som (m/s), ondas longitudinais
W Energia térmica (J)
X Tensão mecânica (N)
x Deformação mecânica
Z Impedância eléctrica ()
za Impedância acústica específica (kg/m2s)
Taxa de aquecimento (K-1)
Ângulo de perdas dieléctricas Permitividade relativa
0 Permitividade eléctrica do vácuo (8,854x10-12 C2/Nm2)
Densidade (kg/m3)
Frequência angular (rad/s) Ângulo de perdas mecânicas
1.1. INTRODUÇÃO...20
1.1.1. História e definições...20
1.1.2. Necessidades do mercado...21
1.2. CARACTERÍSTICASDOSBIO-SENSORES...22
1.2.1. Componentes essenciais de um bio-sensor...22
1.2.2. Imobilização do elemento bio-sensível no transdutor...23
1.2.3. Princípios de detecção...24
1.3. IMUNO-SENSORESES...25
1.4. TIPOSDETRANSDUÇÃOPARABIO-SENSORES...26
1.4.1. Transdutores electroquímicos...26 1.4.2. Transdutores calorimétricos...30 1.4.3. Transdutores ópticos...31 1.4.4. Transdutores piezoeléctricos...35 2. PROPRIEDADES DO PVDF...38 2.1. INTRODUÇÃO...38
2.2. MORFOLOGIAEESTRUTURACRISTALINADO PVDF...39
2.3. PROPRIEDADESELECTROACTIVASDOPVDF...43
2.3.1. Ferroelectricidade...43
2.3.2. Piezoelectricidade...46
2.3.3. Piroelectricidade...49
2.3.4. Coeficiente de acoplamento electromecânico...51
2.3.5. Constante dieléctrica e perdas dieléctricas...52
2.3.6. Resumo das propriedades electroactivas do PVDF...53
3. PROPRIEDADES DA MEMBRANA IMMOBILON-P...54
3.1. INTRODUÇÃO...54
3.2. PROPRIEDADES BIOLÓGICAS...54
3.3. PROPRIEDADESELECTROACTIVAS...56
3.3.1. Introdução...56
3.3.2. Preparação das amostras...56
3.3.3. Curva de histerese ferroeléctrica e polarização...58
3.3.4. Constante dieléctrica...62
3.3.5. Coeficiente piroeléctrico...63
3.3.6. Constante piezoeléctrica d33...65
3.3.7. Coeficiente de acoplamento electromecânico: k33...68
4.1. INTRODUÇÃO...76
4.2. PRINCÍPIO GERALDEFUNCIONAMENTO DOBIO-SENSOR...76
4.3. CONSTRUÇÃODOSFILMES...79
4.3.1. Filmes de membrana Immobilon-P...79
4.3.2. Filmes de PVDF...80
4.3.3. Filmes feitos de PVDF Solef e Immobilon-P...81
4.4. INSTRUMENTAÇÃO, CIRCUITOSELECTRÓNICOSEPORTA-AMOSTRAS...84
4.4.1. Introdução...84
4.4.2. Amplificador lock-in com filmes de Immobilon-P...84
4.4.3. Amplificador lock-in com filmes de PVDF...87
4.4.4. Circuito oscilante (1ª versão)...89
4.4.5. Versão final do porta-amostras...92
4.4.6. Circuito oscilante (2 ªversão)...94
5. EXPERIÊNCIAS REALIZADAS COM OS FILMES...96
5.1. INTRODUÇÃO...96
5.1.1. O bio-sensor com filmes de Immobilon-P...96
5.1.2. O bio-sensor com filmes de PVDF...100
5.1.3. O bio-sensor com filmes de PVDF/Immobilon-P/PVDF...111
6. CONCLUSÕES...116
6.1. CONCLUSÕES...116
6.2. TRABALHOFUTURO...117
está em contacto íntimo com uma bio-molécula que interage especificamente com o analíto presente na amostra. Variações fisico-químicas devidas a esta interacção são amplificadas e convertidas em sinais eléctricos quantificáveis e processáveis. De acordo com a natureza do elemento para o reconhecimento biológico podem distinguir-se dois grandes grupos de bio-sensores: os catalíticos e os baseados na afinidade……… 23
Fig. 1.2. Para melhorar a sensibilidade, os imuno-sensoreses
operam frequentemente em configurações competitivas. a) O analíto compete com um analíto rotulado pelos sítios de ligação aos anticorpos imobilizados na superfície do transdutor. A natureza do rótulo depende do sistema transdutor. b) O analíto compete com o analíto imobilizado pelos sítios de ligação aos anticorpos (rotulados ou não) em solução. A ligação dos anticorpos à superfície sensora produz maiores variações fisico-químicas melhorando a
sensibilidade do
imuno-sensores………...25
Fig. 1.3. Dispositivo potenciométrico [Sharma et al. 1994]
………...27
Fig. 1.4. Circuito para medição amperométrica usando dois
eléctrodos [Sharma et al. 1994]……...29
Fig. 1.5. Princípio de funcionamento de alguns bio-sensores
ópticos. a) Bio-sensor de guia de onda de campo evanescente (CE). O campo evanescente excita as moléculas rotuladas num arranjo competitivo. A fluorescência é acoplada de volta ao guia de onda b) Grating coupler. O ângulo a que acontece a reflexão total é afectado pelas moléculas que estão dentro do campo evanescente.
como referência. Como consequência da interacção biológica, a recombinação das ondas permite a observação de interferências construtivas e destrutivas [Marco et al. 1996]………..33
Fig. 1.6. Diagrama esquemático do surface plasmon resonance
(SPR) [Sharma et al.1994]………34
Fig. 1.7. Desenho esquemático de imuno-sensoreses piezoeléctricos. A frequência de oscilação do cristal piezoeléctrico depende da sua massa. (a) Num dispositivo de ondas longitudinais toda a massa do cristal oscila a uma frequência diferente depois da interacção biológica. (b) A onda acústica gerada entre os dois conjuntos de eléctrodos ao longo da superfície do cristal altera a
sua frequência como consequência da
imunoreacção………...………... ………36
Fig. 2.1. a) Fotografia de um polímero semi-cristalino com
configuração em esférulas. [Davis 1988]. b) Diagrama esquemático da morfologia de uma esférula num polímero
semi-cristalino [Kepler et al. 1992]
………..39
Fig. 2.2. Projecções dos átomos de carbono (círculos pequenos) e
de flúor (círculos grandes) do PVDF no plano ab para quatro das cinco formas cristalinas conhecidas (os átomos de hidrogénio foram omitidos por simplicidade). a) fase (II), ortorômbica, a=4,96 Å, b=9,64 Å, c=4,62 Å; b) fase (I), ortorômbica, a=8,47 Å, b=4,90 Å, c=2,56 Å; c) fase (IV), ortorômbica, a=4,96 Å, b=9,64 Å, c=4,62 Å; d) fase (III), monoclínica, a=4,96 Å, b=9,67 Å,
principais do PVDF [Igreja 1997]…...41
Fig. 2.4. Carga nos eléctrodos por unidade de área (Q/A) em
função do campo eléctrico (E) aplicado para dieléctricos lineares e não-lineares………44
Fig. 2.5. Ciclo de histerese entre o deslocamento eléctrico (Q/A) e
o campo eléctrico (E) típico de um polímero ferroeléctrico………... 44
Fig. 2.6. Diagrama esquemático indicando a convenção usual para
denotar as direcções dos vectores mecânicos e eléctricos. ………...………...………46
Fig. 3.1. Diagram esquemático da prensagem das amostras.
……….……57
Fig. 3.2. Espessura das amostras de Immobilon-P em função da
temperatura de prensagem, para uma pressão de 550 bar. ………...……….…………57
Fig. 3.3. Esquema do processo de deposição dos eléctrodos de
alumínio. ………...58
Fig. 3.4. Esquema completo da montagem experimental para a
obtenção da curva de histerese ferroeléctrica ………...………...………59
Fig. 3.5. Diagrama esquemático da montagem experimental.
Fig. 3.7. Curva de histerese (com e sem compensação) de uma
amostra de Immobilon-P com espessura igual a 40 m, obtida a 48C, aplicando um campo eléctrico de cerca de 100 MV/m (amplitude da tensão aplicada V=4000V) de frequência 0,052 Hz. ………...………...61
Fig. 3.8. Esquema da montagem usada para a medição do
coeficiente piroeléctrico. ………...64
Fig. 3.9. Gráfico do coeficiente piroeléctrico para amostras
polarizadas a várias temperaturas com um campo eléctrico de 90 MV/m. ………...………..64
Fig. 3.10. Coeficiente piroeléctrico de uma amostra que passou
três vezes pelo processo de medição…..65
Fig. 3.11. Montagem experimental para a medição da constante
piezoeléctrica g33. ………66
Fig. 3.12. Esquema do cicuito eléctrico do integrado INA116.
……….67
Fig. 3.13. Gráfico esquemático da parte real da impedância de
uma amostra piezoeléctrica a ressoar
livremente………...………... ………70
Fig. 3.14. Gráfico das partes real e imaginária da impedância
eléctrica de uma amostra de Immobilon-P com espessura de 36 m, polarizada a uma temperatura de 48C com um campo eléctrico de
Fig. 4.1. Filme de um polímero piezoeléctrico fixo entre dois pares
de contactos eléctricos…………..77
Fig. 4.2. Diagrama de blocos do circuito oscilante. ………...…………...78
Fig. 4.3. Processo de construção dos filmes de Immobilon: a) Uma
tira de Immobilon-P com dimensões típicas de 4x1 cm era, b), colocada entre dois pares de bolachas numa prensa, de maneira a que apenas as extremidades da tira fossem prensadas (T=150-220
C e P=550 bar). c) Eram assim obtidos filmes de Immobilon-P com
as extremidades prensadas. d) Nessas extremidades eram depois evaporados em vácuo eléctrodos de alumínio em ambas as faces. ………...………80
Fig. 4.4. Processo de construção dos filmes de PVDF. (a) Numa tira
de PVDF (8x1 cm) com alumínio evaporado em ambas as faces, (b) remove-se o alumínio quimicamente (com NaOH) na parte
central, em ambas as faces, numa extensão de 0,5-2,5 cm. (c) Os filmes obtidos têm dois pares de eléctrodos de alumínio nas extremidades. ………...………..81
Fig. 4.5. Primeiro processo de construção dos filmes de
PVDF/Immobilon-P/PVDF…………..82
Fig. 4.6. Dispositivo para a construção dos filmes de
PVDF/Immobilon-P/PVDF: a) vista lateral; b) vista em perspectiva. ………...………...……..83
tipos de porta-amostras que estão ilustrados nas figs. 4.8 e 4.9……….85
Fig. 4.8. Porta-amostras para os filmes de Immobilon-P, que são
acondicionados na horizontal entre dois pares de contactos eléctricos, e esticados por meio de uns veios com molas. Mostra-se também o local (parte central do filme, Immobilon-P no estado original) onde se coloca, e como fica, a solução líquida...86
Fig. 4.9. Porta-amostras para os filmes de Immobilon-P, que são
acondicionados em forma de ‘U’. Assim é possível imergir a parte central do filme numa solução líquida. ………87
Fig. 4.10. Filme de PVDF fixo entre dois pares de eléctrodos (o
comprimento livre de filme é L) ligados a um amplificador lock-in, em que se ilustra como era colocada, e como ficava, a solução líquida sobre o filme de PVDF. Na fig 4.11 está uma ilustração mais realista do porta-amostras onde se acondiciona o filme. ………...……….…………88
Fig. 4. 11. Porta-amostra para o filme. ………...
……….88
Fig. 4.12. Diagrama de blocos do circuito oscilante.
………...………….90
Fig. 4.13. Esquema mais detalhado do porta-amostras onde se
fixam os filmes……….90
Fig. 4.14. Circuito do ajustador de fase. Através das resistências
variáveis de 1 M é possível ajustar a fase entre 0 e 360 [Linear Applications Databook, National Semiconductor Co., 1986]……...91
Fig. 4.16. a) Vista expandida em perspectiva do porta-amostras; b)
vista lateral em corte do porta-amostras, onde se mostra como fica o filme imerso numa solução líquida, e onde se mostram também os suportes para os contactos eléctricos dos eléctrodos superiores do filme. ………...93
Fig. 4.17. Desenho dos circuitos do ajustador de fase: a) para um
ajuste de -180 a 0; b) para um ajuste 0 a +180. ………...……….…………94
Fig. 5.1. Amplitude do sinal de corrente, e respectiva fase,
registada nos eléctrodos receptores com o filme de Immobilon no ar e imerso em água, com 5V(rms) aplicados ao transmissor………98
Fig. 5.2. Amplitude do sinal de corrente, e respectiva fase,
registada nos eléctrodos receptores com o filme de Immobilon no ar e imerso em em álcool com 1V(rms) aplicados ao transmissor………...99
Fig. 5.3. Amplitude do sinal de corrente, e respectiva fase,
registada nos eléctrodos receptores com o filme de Immobilon no ar e imerso em em álcool com 2V(rms) aplicados ao transmissor………...99
Fig. 5.4. Amplitude e fase do sinal no receptor em função da
frequência do sinal aplicado no transmissor. A amplitude do sinal aplicado era de 5 V, o comprimento do filme era de L=4,52 cm e o comprimento sem alumínio na parte central era de 2 cm. Os picos na tensão que surgem a 14 kHz e a cerca de 27 kHz correspondem, respectivamente, à frequência de ressonância do filme e a uma
Fig. 5.5. Amplitude do sinal no receptor em função da frequência
do sinal aplicado no transmissor, para diferentes amplitudes (Vin=5
V, Vin=3 V, Vin=1 V) do sinal aplicado ao transmissor. O filme está
fixo a 4,52 cm, e tem 2 cm de comprimento sem alumínio na parte central………101
Fig. 5.6. Frequência de ressonância dos filmes em função do
inverso do dobro do comprimento, L, do filme (1/2L). A frequêencia
de ressonância é dada por fo=vs/2L. Do declive da recta ajustada
aos pontos obtém-se a velocidade média do som no PVDF, ou seja,
vs=1323 ms-1………..103
Fig. 5.7. Amplitude e fase do sinal no receptor em função da
frequência do sinal aplicado no transmissor, com o filme no ar em com 0,2 ml de solução tampão (PBS) sobre a área central do filme. O filme está fixo a 4,52 cm, e tem 2 cm de comprimento sem alumínio na parte central e o sinal aplicado ao transmissor tem uma amplitude de 5 V. ……….……….104
Fig. 5.8. Amplitude e fase do sinal no receptor em função da
frequência do sinal aplicado no transmissor, com o filme no ar em com diferentes volumes de solução tampão (PBS) sobre a área central do filme. O filme está fixo a 2,33 cm, e tem 2 cm de comprimento sem alumínio na parte central e o sinal aplicado ao transmissor tem uma amplitude de 5 V. ………. ……..105
Fig. 5.9. Ampliação do gráfico da fig. 5.8, em que se mostram
apenas os valores da tensão na zona em volta da frequência de ressonância. ………...………106
transmissor tem uma amplitude de 5 V. ………... ……….……106
Fig. 5.11. Evolução da frequência de oscilação do filme (L=4,6
cm). O filme oscila no ar durante os primeiros 70 minutos (f ~14020 Hz). Depois são adicionados 0,21 ml de solução de soro de albumina bovina e imediatamente se observa uma queda de cerca de 100 Hz na frequência de oscilação. A evaporação da solução inicia-se cerca dos 300 minutos e termina aos 400 minutos, resultando numa diminuição de 950 Hz no valor da frequência de oscilação. ……….…….108
Fig. 5.12. Variação (em valor absoluto e em %) do valor da
frequência de oscilação após evaporação total da solução, relativamente à frequência de oscilação antes da evaporação, para diferentes valores de volume de solução adicionado à superfície do filme. ………...…………...109
Fig. 5.13. Massa real presente nas soluções e massa calculada
(eq. 3.4) em função da variação (%) na frequência de oscilação, relativamente à frequência de oscilação antes da evaporação………110
Fig. 5.14. Gráfico em que se mostra a evolução da frequência de
oscilação dos filmes utilizando a primeira versão do circuito oscilante (ver secção 4.4.4). ……….………...112
Fig. 5.15. Gráfico em que se mostra a evolução da frequência de
oscilação dos filmes utilizando a segunda versão do circuito oscilante (ver secção 4.4.6). Comparando com a fig. 5.14 imediatamente se conclui que com a segunda versão do circuito oscilante a estabilidade da frequência de oscilação melhorou
Fig. 5.16. Evolução da frequência de oscilação do filme: no ar
durante os primeiros 15 minutos; o Immobilon-P é então embebido com metanol durante 2 minutos, e depois o filme é imerso em 4, 4 ml de PBS; finalmente, aos 40 minutos, adiciona-se uma solução de soro de albumina bovina ao tanque, perfazendo uma concentração final de proteína de 0,046%; passado pouco tempo regista-se uma subida na frequência de oscilação que está relacionada com a adsorção da proteína pelo Immobilon-P……...114
Fig. 5.17. O mesmo que está na fig. 5.16, mas com ampliação da
escala da frequência. Aqui pode observa-se melhor a subida no valor da frequência de oscilação após a adição da solução de albumina……… …115
Fig. 5.18. Variação na frequência de oscilação dos filmes para
diversas concentrações de albumina bovina.
PVDF………...42
Tabela 2.2. Constantes piezoeléctricas do PVDF………..49
Tabela 2.3. Resumo das propriedades electroactivas do PVDF
descritas nas secções anteriores……53
Tabela 3.1. Capacidades de ligação a proteínas………..55
Tabela 3.2. Capacidades de retenção de proteínas………...55
Tabela 3.3. Valores dos coeficientes piezoeléctricos do
Immobilon-P para diferentes campos e temperaturas de polarização………..67
Tabela 3.4. Propriedades piezoeléctricas do P(VDF/TrFE)
………...73
Tabela 3.5. Resumo das propriedades electroactivas da membrana
Immobilon-P, e comparação com os valores que aparecem na literatura para o PVDF………74
Tabela 5.1. Frequência de ressonância dos filmes de PVDF para
diferentes distâncias de fixação do filme, e respectiva velocidade do som………..102
Os sensores para detecção de agentes químicos e/ou biológicos são normalmente denominados bio-sensores. Os bio-sensores têm vindo a ganhar uma importância cada vez maior no mundo que nos rodeia. As necessidades na medicina, nomeadamente no diagnóstico clínico, as exigências da indústria agro-alimentar, as preocupações ambientais, as ameaças de armas químicas e biológicas são exemplos que demonstram a necessidade de um constante desenvolvimento de bio-sensores capazes de dar resposta a todas estas situações.
São inúmeros os bio-sensores dos mais diversos tipos que existem descritos na literatura ou comercializados. Entre estes também se encontram muitos bio-sensores que utilizam dispositivos piezoeléctricos. A sua grande maioria baseia-se em micro-balanças de cristais de quartzo ou em dispositivos de ondas acústicas superficiais. O objectivo deste trabalho é o desenvolvimento de um novo tipo de dispositivo piezoeléctrico para ser usado como bio-sensor. Esse dispositivo é um filme baseado no polímero piezoeléctrico difluoreto de polivinilideno (também conhecido por PVDF, do inglês polyvinylidene difluoride).
Neste trabalho foram usados dois tipos de difluoreto de polivinilideno para a construção dos filmes: o PVDF Solef (produzido pela Solvay), que tem boas propriedades piezoeléctricas, e a membrana Immobilon-P (produzida pela Millipore Co.), que é um tipo especial de difluoreto de polivinilideno poroso e que tem boas capacidades de adsorção de proteínas. A intenção inicial deste projecto era o desenvolvimento de filmes baseados apenas na membrana Immobilon-P. Face às dificuldades sentidas com esta membrana, resolveu-se depois
bio-sensores e descrevem-se os principais tipos de bio-sensores. No segundo capítulo serão revistas as propriedades gerais e electroactivas do PVDF, e também conceitos como a ferroelectricidade, piezoelectricidade e piroelectricidade.
No terceiro capítulo, por ser a intenção inicial construir filmes baseados na membrana Immobilon-P, serão descritas experiências
que demonstram que esta
membrana tem também propriedades electroactivas. Serão também descritos os processos pelos quais esta membrana tem que passar para que adquira propriedades piezoeléctricas.
No quarto capítulo, serão descritas as configurações por que passou o bio-sensor ao longo deste trabalho, os processos de construção de todos os filmes utilizados, a instrumentação e diversos circuitos electrónicos e os porta amostras para acondicionar os filmes.
No quinto capítulo, descrevem-se as diversas experiências realizadas com cada uma das configurações do bio-sensor, discutem-se os resultados obtidos em cada uma das experiências, e apontam-se também as razões que levaram à necessidade de se passar de uma dada configuração para outra, até se chegar à configuração actual.
Finalmente, no último capítulo, faz-se uma análise e comentário a todo o trabalho.
Este trabalho foi realizado na Secção de Materiais Electroactivos, do Departamento de Ciência dos Materiais, da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa.
1. BIO-SENSORES
1.1. INTRODUÇÃO
1.1.1. História e definições
O início da história dos sensores químicos, dos quais os bio-sensores são um subgrupo, situa-se no final do século XIX. As primeiras investigações procuravam novos princípios de funcionamento, materiais e técnicas de preparação para os sensores. Estas actividades de investigação tiveram uma grande expansão nos últimos vinte e cinco anos, e actualmente envolvem cientistas das mais variadas áreas, tais como a medicina, a física, a química, a biologia, a engenharia, etc. Historicamente, conceitos ligados ao termo bio-sensor foram inicialmente explorados por L. C. Clark e seus colaboradores, entre outros, em 1962 [Sharma et al. 1994]. O formato desses sensores era simples, e usavam o aprisionamento físico de enzimas solúveis ou a fixação de membranas enzimáticas num transdutor electroquímico. Actualmente, existem inúmeras técnicas de imobilização de bio-compostos em transdutores de diversos tipos (ópticos, electro-químicos, piezoeléctricos, etc). Os avanços técnicos na microelectrónica e fibras ópticas aumentou consideravelmente o número de transdutores disponíveis para serem usados em bio-sensores. Além disso, houve também avanços na bioquímica, imuno-química e biotecnologia que resultaram numa maior disponibilidade de enzimas, anticorpos, tecidos, organismos vivos e receptores para serem usados nestes dispositivos.
Devido às diferentes abordagens dos diferentes grupos de investigadores, o termo bio-sensor tem sido aplicado a variadíssimas configurações. Uma definição precisa para o termo bio-sensor é [Marco et al. 1996]: um dispositivo miniaturizado que
integra um elemento biologicamente sensível (anticorpos, enzimas, receptores, células, etc.) em contacto íntimo com um transdutor apropriado (óptico, electroquímico, piezoeléctrico, etc.) para a conversão da detecção num sinal primário (óptico ou eléctrico) que possa ser amplificado e subsequentemente processado. O sensor deverá responder directamente, selectivamente e continuamente à presença de um ou mais analítos quando em contacto com as amostras. Consequentemente, a reacção biológica deve ser reversível de modo a fornecer medições precisas in situ e em tempo real (ou quase).
Esta definição corresponde à de um bio-sensor ideal, pois na prática a maioria dos dispositivos apenas cumprem alguns destes requisitos. Por exemplo, muitos dos bio-sensores que aparecem na literatura não dão uma resposta directa à presença de um certo analíto, mas medem um sinal secundário que resulta de uma reacção enzimática ou de um composto fluorescente; alguns destes dispositivos não são reversíveis ou não operam continuamente; outros não podem ser miniaturizados ou então a configuração electrónica não permite que sejam usados in situ.
1.1.2. Necessidades do mercado
Os bio-sensores têm um mercado potencialmente vasto, cobrindo áreas como o diagnóstico clínico, o controlo de processos, a alimentação, a monitorização ambiental, aplicações militares, etc. Contudo, a comercialização dos bio-sensores referidos na literatura tem sido algo lenta. Em parte, isto deve-se ao facto de que os bio-sensores ainda não possuem as características de desempenho desejáveis, tais como a sensibilidade, gama dinâmica, reprodutibilidade, etc. Porém, há algumas excepções, sobretudo nas áreas de diagnóstico clínico e indústrias agrícola e alimentar, em que já existem diversos bio-sensores comerciais para a
ureia, glutamato, lactato, oxalato, etc [Sharma et al. 1994].
A libertação de produtos químicos para o meio ambiente tem crescido enormemente nas últimas décadas. Daí que, ultimamente, tem havido um enorme esforço no desenvolvimento de bio-sensores com aplicação na área ambiental que sejam baratos e capazes de realizar monitorização contínua in situ. Os analítos de interesse incluem compostos como pesticidas, PCB’s, fenólicos, hidrocarbonos aromáticos policíclicos, etc.
Ao longo das últimas décadas foram desenvolvidas e fabricadas inúmeras armas químicas e biológicas. Actualmente, as ameaças do uso deste tipo de armas por parte de certos países e grupos de terroristas têm aumentado, como o demonstram acontecimentos recentes. Isto levou a que vários governos tenham vindo a investir ao longo dos anos no desenvolvimento de dispositivos para a detecção de analítos como o gás Sarin, gás mostarda, e variadíssimas toxinas, bactérias, vírus, etc. Os requisitos para este tipo de aplicações são a durabilidade (operação por longos períodos de tempo em condições adversas), facilidade de utilização (uso por parte de pessoal não especializado) e operação remota e contínua com elevada sensibilidade e fiabilidade. Paddle [Paddle 1996] fez uma excelente revisão dos bio-sensores desenvolvidos para detectar vários agentes químicos, toxinas, vírus, bactérias e fungos.
1.2. CARACTERÍSTICAS DOS BIO-SENSORES
1.2.1. Componentes essenciais de um bio-sensor
Os componentes essenciais de um bio-sensor incluem um elemento biologicamente sensível, um transdutor, um amplificador eléctrico e
um sistema de processamento, aquisição e visualização de dados (ver fig. 1.1). O elemento biologicamente sensível pode incluir qualquer material biológico que possa reconhecer selectivamente um analíto ou uma classe de analítos, como, por exemplo, enzimas, receptores, anticorpos, micróbios, proteínas de transporte, tecidos (animais ou vegetais), etc. Quando moléculas interagem especificamente com o elemento de reconhecimento biológico, há uma mudança em um ou mais parâmetros fisico-químicos associados com a interacção. Esta mudança pode produzir iões, electrões, gases, calor, massa ou luz. Estas quantidades são convertidas num sinal eléctrico pelo transdutor, e depois amplificadas e processadas. Os bio-sensores são usualmente classificados pelo tipo de transdutor usado, que pode ser óptico, electroquímico, piezoeléctrico, térmico, etc.
Embora as características de um bio-sensor sejam ditadas, até um certo ponto, pelo mecanismo de transdução do sinal, há outros factores que são importantes na determinação das características que um biosensor deve ter. Por exemplo:
1) O método é reversivel, irreversível ou regenerável?
2) Têm que se adicionar outros reagentes para além do analíto de interesse?
3) Qual o interface entre o bio-sensor e o meio?
4) Quais são as características físicas do sistema (transportável, fixo, etc)?
Estes factores, e outras características operacionais, devem ser levadas em conta na caracterização de bio-sensores.
Fig. 1.1. Componentes essenciais de um bio-sensor. O transdutor
está em contacto íntimo com uma bio-molécula que interage especificamente com o analíto presente na amostra. Variações
fisico-químicas devidas a esta interacção são amplificadas e convertidas em sinais eléctricos quantificáveis e processáveis. De
acordo com a natureza do elemento para o reconhecimento biológico podem distinguir-se dois grandes grupos de bio-sensores:
os catalíticos e os baseados na afinidade.
1.2.2. Imobilização do elemento bio-sensível no transdutor
Para além dos factores já mencionados, o desempenho de um bio-sensor depende em último caso em quão bem se liga o elemento de reconhecimento biológico à superfície do transdutor e aí permanece durante o uso – ao que se chama imobilização.
A escolha de uma determinada técnica de imobilização depende de vários factores, por exemplo: 1) aspectos estruturais do elemento de reconhecimento biológico (i.e. tamanho, composição das sub-unidades, natureza hidrofóbica ou hidrofílica) e também sua composição química (i.e. presença de grupos como os carbohidratos, aminas, carbonilos); 2) a superfície do transdutor que pode ser feita de materiais como, por exemplo, o quartzo, silício, metais, polímeros, géles, e que podem ainda ter sido ou não quimicamente modificados; 3) e também aspectos relacionados
com o fabrico, o armazenamento e as condições e meio em que vai se usado.
Há vários métodos pelos quais o elemento biológico pode ser imobilizado na superfície do transdutor. Dois dos métodos mais utilizados são a adsorção (devida a interacções iónicas e hidrofóbicas) e a ligação covalente [Williams et al. 1994]. A adsorção não proporciona uma grande carga superficial de proteínas, o que implica uma menor sensibilidade, porém, tem a vantagem de ser reversível (i.e. a proteína por ser desadsorvida da superfície). A ligação covalente leva a uma maior carga superficial de proteínas, mas também a uma maior irreversibilidade. Dentro destes dois métodos existem técnicas de optimização da imobilização de anticorpos, donde se destacam a ligação através da ponte avidina-biotina [Sharma et al. 1994], o uso das proteínas A e G [Dubrovsky 1966] e também a transferência de filmes pela técnica de Langmuir-Blodget [Ahluwalia et al. 1991; Barraud et al. 1993]. Para além destes métodos, existe um outro método que consiste em confinar os anticorpos numa determinada região, através de uma membrana [Martins 1995]. As membranas utilizadas têm uma determinada porosidade, que permite a passagem do analíto para detecção, mas são estanques para os anticorpos. Esta técnica, quando utilizada na detecção de analítos em solução, tem a desvantagem de necessitar de um longo tempo de resposta devido ao tempo de difusão através da membrana.
1.2.3. Princípios de detecção
Os princípios de detecção para os bio-sensores podem classificar-se em dois grupos: os sensores baseados na afinidade e os bio-sensores catalíticos [Sharma et al.1994; Marco et al. 1996].
Nos bio-sensores baseados na afinidade detectam-se as variações fisico-químicas associadas à ocorrência de uma ligação
directamente através de uma variação física na superfície do sensor ou indirectamente através de rotulação óptica ou enzimática. Uma grande variedade de elementos bio-sensíveis têm sido usados neste tipo de detecção: anticorpos, ADN, receptores de proteínas, células, tecidos, etc. A principal vantagem deste tipo de bio-sensores é a grande gama de afinidades disponíveis, aumentando assim o número de analítos que podem ser detectados selectivamente. Isto é especialmente verdadeiro quando se usam anticorpos como elemento bio-sensível.
Os bio-sensores catalíticos baseiam-se na conversão de um substrato não detectável num produto, óptica ou electroquimicamente detectável. Este processo permite a detecção de substratos, produtos, inibidores e moduladores da reacção catalítica. Para aumentar a gama de analítos detectáveis uma segunda ou terceira enzima pode ser usada para converter um produto primário não detectável num produto secundário detectável.
1.3. IMUNO-SENSORES
O interesse no desenvolvimento de bio-sensores baseados no uso de anticorpos (imuno-sensores) tem vindo a crescer consideravelmente. Uma das grandes vantagens do uso de anticorpos como elemento bio-sensível é a possibilidade de utilizar convenientemente a afinidade e a quase ilimitada selectividade que apresentam.
Os eventos fisico-químicos resultantes do fenómeno de reconhecimento anticorpo-analíto são extremamente subtis e, consequentemente, as exigências no transdutor são muito severas. As moléculas a detectar são em geral pequenas o que torna a detecção da ligação ainda mais difícil. Por esta razão, a maioria
dos dispositivos fazem medições indirectas, usando configurações competitivas (fig. 1.2) e/ou rótulos como enzimas, substâncias fluorescentes ou substâncias electroquimicamente activas. A amplificação do sinal é então feita pela detecção das propriedades físicas (electroactividade, fluorescência, etc.) de um marcador ou do produto de uma reacção enzimática (ver fig. 1.2.a), ou da ligação do anticorpo à superfície sensível em vez da do analíto (ver fig. 1.2.b). No entanto, também têm sido feitas tentativas de detecção directa do analíto, usando dispositivos piezoeléctricos ou ópticos [Marco et al. 1996].
Fig. 1.2. Para melhorar a sensibilidade, os imuno-sensoreses
operam frequentemente em configurações competitivas. a) O analíto compete com um analíto rotulado pelos sítios de ligação aos
anticorpos imobilizados na superfície do transdutor. A natureza do rótulo depende do sistema transdutor. b) O analíto compete com o analíto imobilizado pelos sítios de ligação aos anticorpos (rotulados ou não) em solução. A ligação dos anticorpos à superfície sensora
produz maiores variações fisico-químicas melhorando a sensibilidade do imuno-sensores.
Uma outra limitação dos imuno-sensoreses é o facto de a interacção anticorpo/antigénio não ser imediatamente reversível. Por isso, os imuno-sensoreses são em geral de “um só uso”, embora
[Marco et al. 1996].
1.4. TIPOS DE TRANSDUÇÃO PARA BIO-SENSORES
1.4.1. Transdutores electroquímicos
Devido à sua simplicidade, a transdução electroquímica constitui uma boa alternativa para criar bio-sensores de baixo custo quando acoplados a enzimas. Contudo, a detecção electroquímica de uma imuno-reacção é difícil, e por isso torna-se necessário o uso de enzimas que levem à formação de substâncias electroactivas. Este tipo de bio-sensores está vastamente descrito na literatura, e muitos deles foram comercializados com bastante sucesso. Descrevem-se aqui as três principais classes de bio-sensores electroquímicos: potenciométricos, amperométricos e medições de condutância/capacitância.
1.4.1.1. Potenciométricos
Usualmente, a potenciometria era usada na medição de pH, mas a partir de 1965, quando apareceram eléctrodos capazes de seleccionar iões, esta técnica teve um grande crescimento [Sharma et al. 1994] e a sua aplicação aos bio-sensores começou a ser explorada.
Neste tipo de medição detecta-se a variação no potencial eléctrico que ocorre após a ligação de um dado analíto (por exemplo, anticorpos ou antigénios) ao elemento imobilizado. A diferença de potencial é medida entre um eléctrodo, onde ocorre a imobilização, e um eléctrodo de referência. O potencial desenvolvido está relacionado com a actividade do analíto na amostra através da
relação de Nernst [Sharma et al. 1994]. O uso de membranas selectoras de iões pode tornar estes transdutores sensíveis a vários iões (e. g. H+, F-, I-) e gases como o CO
2 e NH3 [Sharma et al.
1994]. Este tipo de transdução tem sido usada para medir a actividade de enzimas como a penicilinase, urease, oxidase de glucose, acetilcolinesterase [Sharma et al. 1994], dinitrofenol, e fenilacetato [Marco et al. 1996]. A utilização deste tipo de transdução em imuno-sensoreses tem como principal desvantagem o facto de que a variação no potencial devida à interacção entre o anticorpo e o antigénio é demasiado pequena (1-5 mV) [Marco et al. 1996], e por isso a fiabilidade e sensibilidade das análises estão limitadas por efeitos de ruído de fundo.
Um outro tipo de transdutores potenciométricos bastante usados em bio-sensores são os Transistores de efeito de campo sensores
de iões (ISFET – ion-sensitive field effect transistors) [Sethi 1994;
Sharma et al. 1994; Marco et al. 1996], que se baseiam em semicondutores. Nestes transdutores a condutância entre a source e a drain é modulada pela tensão da gate através do efeito de campo num semicondutor. A membrana da gate é usualmente construída de nitreto de silício (Si3N4) que é sensível a protões, mas
pode ser construída de outros materiais para ser sensível a Na+,
K+, Ca2+, NH4+, Ag+, Cl- e Br- [Sharma et al. 1994]. Estes
dispositivos podem ser construídos quer como condensadores quer como transistores de efeito de campo. A miniaturização destes sensores num integrado e a sua integração num sistema completamente automatizado é facilmente realizada. Uma variante deste tipo de transdutores são os ENFET (Enzyme-sensitive field –
effect transistors), que se obtêm dos INFET aplicando uma camada
fina de uma enzima sobre a membrana selectora de iões. Estes dispositivos já foram usados para detectar glucose, ureia, potássio [Sethi 1994], paratião, DFP, cianeto [Paddle 1996].
Fig. 1.3. Dispositivo potenciométrico [Sharma et al. 1994].
Os light-adressable potenciometric sensors (LAPS) [Marco et al. 1996] são um outro tipo de bio-sensor potenciométrico, também baseados em transistores de efeito de campo. A diferença entre eles está no mecanismo usado para detectar variações no potencial eléctrico no interface silício-isolador. Os LAPS medem uma foto-corrente gerada devido à incidência de luz na amostra. Existe no mercado um dispositivo baseado neste princípio que se chama ThresholdTM da Molecular Devices. Estes dispositivos já foram
usados para detectar DFP, Soman, Paraoxon, toxina naja-naja, toxina mojave, ricína, as bactérias Neisseria Meningitidis, Brucella
Militensis e Francisella Tularensis [Paddle 1996].
Embora existam na literatura muitos exemplos de bio-sensores potenciométricos [Sharma et al. 1994], as dificuldades numa imobilização consistente e o número limitado de enzimas que podem ser colocadas nestes transdutores continuam a ser um desafio.
1.4.1.2. Amperométricos
Este tipo de dispositivos medem a corrente gerada pela oxidação ou redução de espécimes redox na superfície de um eléctrodo, que é mantido a um determinado potencial eléctrico. A corrente observada tem uma relação linear com a concentração de espécies electroactivas.
O facto de que uma determinada tensão nos eléctrodos é essencial para que ocorra uma reacção específica requer a inclusão de um eléctrodo de referência, com potencial conhecido, fixo e estável. Por exemplo, um eléctrodo de referência de prata/cloreto de prata tanto no estado sólido como no estado líquido é muito usado [Sharma et al. 1994]. Outros materiais como a platina, ouro ou carbono são também muito usados. Adjacente ao eléctrodo, encurralado por uma membrana ou directamente imobilizado, encontra-se um dos imuno-reagentes envolvidos num arranjo imunológico competitivo. Em certas circunstâncias, tais como valores de pH elevados, uma célula de três eléctrodos com um eléctrodo de referência adicional é usada com um circuito modificado, empregando potenciostática em vez de uma simples fonte de corrente contínua.
Fig. 1.4. Circuito para medição amperométrica usando dois
Normalmente, este tipo de bio-sensores usam enzimas como as oxireductases ou enzimas hidrolíticas que convertem analítos não activos electroquimicamente, em produtos que podem ser oxidados ou reduzidos num eléctrodo, mantido a um potencial específico em relação ao eléctrodo de referência.
Por vezes o substrato ou o produto da reacção enzimática podem ser medidos amperometricamente sem se recorrer a um mediador. Estes sensores são chamados de eléctrodos de enzimas amperométricos não mediados.
Embora este tipo de bio-sensores seja dos que mais aparece na literatura, eles têm uma série de limitações relacionadas com a cinética de saturação das enzimas e o grande potencial necessário para a oxidação do analíto que pode provocar a oxidação de outros compostos (por exemplo, o ácido ascórbico e ácido úrico, que estão presentes em muitas amostras biológicas). Além disso, a corrente medida pode ser afectada por uma série de parâmetros, tais como o potencial de funcionamento e a natureza dos eléctrodos, a adsorção, difusão e cinética química não relacionadas com o analíto de interesse. No entanto, uma série de inovações têm surgido na literatura que ajudam a ultrapassar estas limitações [Sharma et al. 1994]. Por exemplo: o uso de membranas que limitam a difusão mantém a concentração do substrato abaixo dos níveis de saturação das enzimas, e também reduz as variações na sensibilidade devidas às variações da actividade enzimática; o uso de mediadores para a oxidação-redução, que facilita a transferência de electrões da enzima para o eléctrodo polarizado, pode reduzir o potencial necessário para a detecção do analíto. Este tipo de transdutores é usado para detectar uma enorme quantidade de analítos, como por exemplo, lactose [Sharma et al.
1994], glucose, galactose [Sethi 1994], alguns herbicídas [Marco et al. 1996], paraoxon, cianeto, ocratoxina [Paddle 1996].
1.4.1.3. Medições de condutância-capacitância
As medições de conductividade tiveram início nos finais do século XIX (Friedrich Kohlrausch 1840-1910). Usando uma definição simples, a condutividade K de um electrólito é a condutância G de uma célula com dois eléctrodos afastados de uma distância d de 1 cm, em que a área A dos eléctrodos é 1 cm2, ou seja K=Gk, em que k=d/A é a constante da célula [Sharma et al. 1994]. Portanto, é
possível monitorizar reacções químicas que alteram a condutividade global da solução, quer produzindo quer consumindo espécimes iónicos. A resistência da solução é determinada pela medição da mobilidade iónica que envolve a migração de todos os iões presentes. Estas medições podem ser aplicadas quer em líquidos condutores quer em materiais sólidos. Em materiais não condutores podem medir-se variações na polarização de cargas fixas. Este tipo de bio-sensores são considerados relativamente não específicos.
Várias configurações de eléctrodos interdigitais planares têm sido referidas na literatura como transdutores condutimétricos para bio-sensores [Sharma et al. 1994; Sethi 1994]. Enzimas como a urease foram imobilizadas em eléctrodos interdigitais planares para medir a decomposição de ureia em amónio, bicarbonato e iões hidroxílicos [Sharma et al. 1994]. Um dispositivo baseado no uso de um polímero condutor dopado com iodo, no qual se imobilizaram anticorpos específicos, foi usado para detectar atrazina [Marco et al. 1996]. Com este tipo de transdutores também se detectou a asparagina, a creatinina [Sethi 1994], a atrazina [Haupt 1999], entre outros.
1.4.2. Transdutores calorimétricos
Um dispositivo calorimétrico mede a presença ou concentração de espécimes químicas registando variações na temperatura devidas à presença desses mesmos espécimes químicos. A variação de temperatura pode ser devida a uma reacção exotérmica ou endotérmica, ou devida a uma variação da condutividade térmica do meio originada por um gradiente de temperatura entre o transdutor e o meio envolvente. Existem disponíveis três tipos de sensores calorimétricos: catalíticos, piroeléctricos e os que se baseiam no efeito de Seebeck [Sharma et al. 1994]. Dada a natureza exotérmica da maioria das reacções catalisadas por enzimas, os termistores de enzimas são transdutores potencialmente versáteis.
Uma vasta gama de analítos, como a ureia, glucose, etanol, lactato, penicilina, oxalato, sacarose e urato [A. Sharma et al. 1994] têm sido medidos com estes transdutores.
1.4.3. Transdutores ópticos
As medições ópticas podem basear-se em várias técnicas de transdução: absorção ou emissão de luz pelos reagentes, fluorescência, fosforescência, polarização, rotação, interferência, etc. A escolha da técnica depende da aplicação e sensibilidade pretendidas. Os primeiros desenvolvimentos deste tipo de sensores deveram-se à flexibilidade e baixo custo das fibras ópticas. As fibras ópticas podem ser acopladas a praticamente todas as técnicas ópticas. O formato do bio-sensor pode envolver detecção directa do analíto ou detecção indirecta através de amostras rotuladas opticamente.
1.4.3.1. Sensores de onda evanescente
A reflexão interna total tem sido usada em guias de onda planares ou de fibra óptica como transdutor do sinal em inúmeros bio-sensores referidos na literatura [Sharma et al. 1994]. Nestes transdutores, a luz propaga-se num guia de onda gerando uma onda electromagnética (onda evanescente) no interface entre o guia de onda, opticamente mais denso, e o meio adjacente, opticamente menos denso. A amplitude desta onda decresce exponencialmente com a profundidade no meio opticamente menos denso. A profundidade de penetração do campo evanescente é defenida como sendo a distância em que a sua intensidade foi reduzida para 1/e do seu valor no interface e, geralmente, tem um valor de algumas dezenas de nanómetros. A profundidade de penetração depende do ângulo de incidência no interface e é proporcional ao comprimento de onda da luz excitadora. Quando moléculas com um espectro de absorção que inclui o comprimento de onda da luz excitadora estão dentro do campo evanescente, absorvem energia levando a uma atenuação da luz reflectida no guia de onda. Porém, a sensibilidade conseguida não é suficiente. É necessário usar moléculas rotuladas capazes de reemitir os fotões absorvidos a um comprimento de onda maior, como a fluorescência. Esta fluorescência pode ser recolhida quer fora do guia de onda quer acoplando as frequências de emissão de volta ao guia de onda. Este tipo de bio-sensores podem detectar uma grande quantidade de analítos, como por exemplo, atrazina, terbutrina, bifenílicos, paratião [Marcos et al. 1996], paraoxon, bungarotoxina, toxina botulínica, ricina, yersinia pestis, vírus da doença de
Newcastle, bacillus anthracis [Paddle 1996], etc. Recentemente,
outros tipos de sensores de onda evanescente, como os grating
sem recorrer a rótulos fluorescentes [Marco et al. 1996].
No grating coupler mede-se a variação do ângulo crítico provocada pela imuno-reacção. O ângulo crítico é o ângulo que produz a reflexão interna total e é muito sensível ao índice de refracção e à espessura da camada de moléculas dentro do campo evanescente. Desta variação pode calcular-se o índice de refracção total devido ao efeito do campo evanescente. Considerando que o índice de refracção, n1, do guia de onda é constante, pode obter-se uma espessura. Este princípio tem sido usado para desenvolver imuno-sensoreses que medem terbutrina e atrazina sem recorrer a rótulos, embora a sua sensibilidade ainda seja baixa [Marco et al. 1996].
Num interferómetro de Mach-Zehnder a luz é dividida em dois braços: um tem a camada sensora e o outro serve de referência. O campo evanescente no braço medidor recolhe informação acerca da imuno-reacção, devido à variação provocada no índice de refracção. Consequentemente, a velocidade da onda neste braço varia. No fim, a recombinação das ondas dos dois braços permite a observação de interferência construtiva ou destrutiva, que se relaciona com a imuno-reacção que ocorreu no braço sensor.
Fig. 1.5. Princípio de funcionamento de alguns bio-sensores
ópticos. a) Bio-sensor de guia de onda de campo evanescente (CE). O campo evanescente excita as moléculas rotuladas num arranjo competitivo. A fluorescência é acoplada de volta ao guia de onda
b) Grating coupler. O ângulo a que acontece a reflexão total é afectado pelas moléculas que estão dentro do campo evanescente.
b) Interferómetro de Mach-Zehnder. A luz deivide-se em dois braços, um que tem a bio-molécula apropriada, e o outro que actua
como referência. Como consequência da interacção biológica, a recombinação das ondas permite a observação de interferências
1.4.3.2. Surface plasmon resonance (SPR)
Um surface plasmon resonance é um campo electromagnético evanescente gerado à superfície de um condutor metálico (usualmente Ag ou Au) quando excitado pelo impacto de luz com um comprimento de onda apropriado a um determinado ângulo (p). Surface plasmons são gerados por electrões à superfície do metal e
comportam-se de modo diferente dos do interior do metal. Estes electrões são excitados pela luz incidente, produzindo uma oscilação (ressonância) a uma frequência diferente da do interior do filme metálico. A absorção de energia pelos surface plasmons durante a ressonância é observada como um mínimo na reflectância da luz quando o ângulo de incidência variável atinge um valor crítico. Este ângulo crítico depende do comprimento de onda e estado de polarização da luz incidente, e também das propriedades dieléctricas do meio adjacente à superfície metálica. Portanto, é afectado pelos analítos que se ligam a essa superfície. Este princípio permite assim a monitorização de interacções biológicas. Como um exemplo, o dispositivo comercial BIAcore™ da Pharmacia foi usado para detectar atrazina [Marco et al. 1996]. Um sistema chamado IAsys™ desenvolvido pela Fisons pode monitorizar eventos de ligação em tempo real [Marco et al. 1996]. Este sistema explora uma nova forma de bio-sensores ópticos que combinam a tecnologia dos guias de onda com o fenómeno da
Fig. 1.6. Diagrama esquemático do surface plasmon resonance
(SPR) [Sharma et al.1994].
1.4.3.3. Reflectometric interference spectroscopy (RIFS)
O princípio básico destes sensores baseia-se na luz reflectida que se produz quando um feixe de luz passa através de um filme fino. Um feixe de luz que passa num interface entre dois meios com índices de refracção diferentes será parcialmente reflectido. Portanto, um filme fino transparente produzirá um conjunto de feixes reflectidos em cada um dos interfaces, que podem ser considerados como sendo apenas dois feixes reflectidos quando a reflectância dos interfaces é pequena (< 0,05). Estes feixes terão uma diferença de fase () que se relaciona directamente com a espessura do filme. Se o produto entre a diferença de fase e o comprimento de onda for inferior ao comprimento de coerência da fonte de luz, então os dois feixes interferem, originando uma modulação da intensidade da luz como consequência da interferência construtiva e destrutiva. Assim, através das variações do espectro de interferência podem determinar-se variações na espessura do filme. Este princípio foi aplicado num imuno-sensores para a detecção de atrazina [Marcos et al. 1996].
Os bio-sensores piezoeléctricos baseiam-se principalmente na medição de uma variação na frequência de ressonância de um cristal piezoeléctrico como resultado de variações de massa na sua superfície. Estas são causadas pela interacção de analítos com um agente bio-específico imobilizado na superfície do cristal. Normalmente, a frequência de vibração do cristal diminui à medida que o analíto se liga ao receptor imobilizado na superfície. Em geral, os imunosensores piezoeléctricos podem adoptar dois modos principais (Fig. 1.7): dispositivos de ondas acústicas superficiais e dispositivos de ondas acústicas longitudinais.
Existem descritas na literatura inúmeras aplicações deste tipo de bio-sensores. Por exemplo, detecção de substâncias como imunoglobulinas G e M, cocaína, polisacaridas, hormônas, ácidos nucleicos, enzimas [Ngeh-Ngwainbi et al. 1990], albmina humana [Muratsugu et al. 1993], clorofórmio, cloro-benzeno [Liron 1997], vírus da herpes [Konig et al. 1994], pesticidas [Marco et al. 1996], ricina, yersinia pestis, salmonella typhomurium [Paddle 1996].
1.4.4.1. Dispositivos de ondas acústicas longitudinais
Nesta configuração (Fig. 1.7.a) tem-se um disco de um material piezoeléctrico com eléctrodos em ambas as faces ligados a um circuito oscilador. A ressonância ocorre em toda a massa do cristal. Se um cristal com um anticorpo imobilizado numa das suas faces é colocado num ambiente que contenha o antigénio específico ocorre uma imuno-reacção entre os anticorpos e os antigénios, que produz um aumento na massa do cristal. Então, a frequência de ressonância decresce de acordo com a equação de Sauerbrey: f=-2.3x106f 2(m/A), em que f é a frequência de oscilação em Hz, m é
Fig. 1.7. Desenho esquemático de imuno-sensoreses
piezoeléctricos. A frequência de oscilação do cristal piezoeléctrico depende da sua massa. (a) Num dispositivo de ondas longitudinais toda a massa do cristal oscila a uma frequência diferente depois da
interacção biológica. (b) A onda acústica gerada entre os dois conjuntos de eléctrodos ao longo da superfície do cristal altera a
sua frequência como consequência da imunoreacção.
Os cristais são geralmente de quartzo e operam a frequências que podem ir até a algumas dezenas de MHz. Estes sensores são normalmente designados de micro-balanças de cristais de quartzo (em inglês QCM, quartz crystal microbalance). Estes dispositivos podem operar em líquidos e têm limites de detecção de massa da ordem de 10-10 a 10-11 g [Sharma et al. 1994]. Por exemplo, Suri
conseguiu detectar imunoglobulinas M em concentrações que variavam entre 10-6 e 10–2 mg/ml [Suri et al. 1994].
Existe também descrito na literatura um outro bio-sensor piezoeléctrico que utiliza um filme fino do polímero difluoreto de polivinilideno (PVDF) [Walton et al.1993]. Neste dispositivo o filme de PVDF está inserido num circuito oscilador, que faz com que o filme oscile longitudinalmente. A frequência de oscilação depende das dimensões do contentor onde está inserido o filme e da velocidade da onda acústica. O filme de PVDF tem eléctrodos em
de PVDF, os autores afirmam que podem chegar a sensibilidades muito superiores às das micro-balanças de cristais de quartzo. Este bio-sensor foi testado com albumina bovina e imunoglobulinas G. Porém, os autores não fornecem valores para os limites de detecção pois o trabalho estava numa fase preliminar.
1.4.4.2. Dispositivos de ondas acústicas superficiais
Este tipo de dispositivo (Fig. 1.7.b) é basicamente constituído por dois conjuntos de eléctrodos interdigitais simétricos evaporados na superfície de um cristal piezoeléctrico. Aplicando um sinal eléctrico alternado a um dos conjuntos de eléctrodos, gera-se uma onda acústica. Esta onda é recebida pelo outro conjunto de eléctrodos, situado a alguns milímetros na extremidade oposta do cristal, e é convertida de novo num sinal eléctrico. A frequência, tempo de propagação e modo da onda acústica que se propaga através do cristal variam com o espaçamento entre os “dedos” dos eléctrodos interdigitais, o espaçamento entre os conjuntos de eléctrodos, o corte e espessura do cristal.
Na área entre os dois conjuntos de eléctrodos (isto é, no caminho de propagação da onda acústica) imobiliza-se um elemento de reconhecimento biológico – anticorpos, por exemplo. Quando uma solução que contenha o antigénio específico é colocada sobre esta área, o antigénio liga-se ao material imobilizado. Isto resulta num aumento da massa do cristal, afectando assim a frequência da onda propagada. A variação na frequência está directamente relacionada com a interacção anticorpo-antigénio. As frequências de operação podem ir até algumas centenas de MHz, o que lhes confere uma maior sensibilidade relativamente às QCM. Porém, têm dificuldades de operação com líquidos devido ao excessivo amortecimento do sinal. Este tipo de sensores são também muito usados na detecção
de gases. Por exemplo, Hok conseguiu detectar CO2 com uma
