Marco A. Coutinho da Silva
Animal Reproduction and Biotechnology Laboratory Colorado State University, Fort Collins, CO 80523, USA
Introdução
Avanços nas técnicas de reprodução assistida tem ajudado na obtenção de gestações de animais subférteis. Em humanos, e também em varias espécies de animais domésticos, a produção in vitro de embriões tem sido realizada com sucesso. Entretanto, em eqüinos, a produção de embriões in vitro ainda não é bem sucedida. Comparado com as outras espécies, as razões que podem ser atribuídas ao progresso retardado da técnica de fertilização in vitro em eqüinos incluem: escassez de ovários para obtenção de ovócitos, e a falta de um método adequado para maturação dos ovócitos e para capacitação espermática. Atualmente, somente dois potros foram produzidos através de fertilização in vitro de ovócitos maturados in vivo(3, 50). Embora a fertilização in vitro não tenha alcançado sucesso em eqüinos, métodos alternativos para a fertilização in vitro ou in vivo de ovócitos eqüinos tem sido desenvolvidos, como a transferência de ovócito (OT), transferência intrafallopiana de gametas (GIFT) e a injeção intracitoplasmática de ovócitos (ICSI).
Transferência de Ovócito
OT envolve a transferência do ovócito da égua doadora para o oviduto da receptora, e inseminação intra-uterina da receptora com sêmen do garanhão desejado. OT é geralmente realizada em éguas valiosas, as quais não produzem mais embriões que possam ser coletados. Razões associadas com a falha na produção de embriões viáveis incluem: falha na ovulação, falha na captação do ovócito, e patologias no oviduto, útero e cervix[9]. Para OT, o ovócito é coletado antes da ovulação e, portanto, a única exigência para a égua doadora é o desenvolvimento de folículos pré-ovulatórios.
A primeira OT realizada com sucesso em eqüinos ocorreu em 1988[46]. Entretanto, altas taxas de prenhez com OT só foram obtidas por Carnevale e Ginther em 1995, quando uma taxa de desenvolvimento embrionário de 92% foi obtida após a transferência de ovócitos de doadoras jovens para receptoras jovens. O sucesso da OT depende da qualidade do ovócito, da receptora, e do sêmen utilizados.
Coleta, cultivo e transferência de ovócito.
Ovócitos podem ser coletados em diferentes estágios de maturação. Ovócitos utilizados em experimentos são geralmente coletados de ovários obtidos em abatedouro ou de éguas vivas. Entretanto, a qualidade dos
Coutinho da Silva, M.A. 2004. Transferência de ovócitos e injeção intracytoplasmatica de espermatozóide em eqüinos. Acta Scientiae Veterinariae, 32 (Supl ) 55-64.
ovócitos coletados de ovários de abatedouro tem sido inconsistente[5, 6]. A coleta de ovócitos de éguas vivas permite um maior controle de fatores que afetam a qualidade do ovócito, como a idade da doadora, o estagio do ciclo reprodutivo, prenhez, e condição corporal da doadora[1, 4, 25].
Vários métodos já foram utilizados para a coleta de ovócitos em eqüinos, entre eles: laparotomia[60], punção transcutanea pelo flanco[51] e aspiração transvaginal guiada por ultra-som (TVA;[22]). Atualmente, em nosso laboratório, o método utilizado para a coleta de ovócitos e a TVA utilizando um transdutor linear de ultra-som, como descrito por Carnevale e Ginther (1993). TVA tem a vantagem de ser um procedimento não-cirúrgico, permitindo coletas repetidas de ovócitos. Durante o procedimento, a probe do ultra-som, colocada em um prolongador de plástico que contem o guia da agulha, e introduzida na porção cranial da vagina. O ovário é colocado sobre o transdutor através de manipulação retal, e o folículo e visualizado. Uma agulha é introduzida no folículo e o conteúdo folicular é removido utilizando-se aspiração a vácuo e lavagem do folículo com meio.
As taxas de recuperação de ovócitos utilizando-se a TVA variam de acordo com o estágio de desenvolvimento do folículo. Taxas de recuperação para ovócitos eqüinos imaturos e baixa, variando de 12 a 47%[7, 33, 40, 48, 58]. Em comparação, as taxas de recuperação de ovócitos apos a indução da ovulação variam entre 50 e 85%[4, 11, 12, 14, 22-24, 43]. O aumento da taxa de recuperação de ovócitos pre-ovulatorios em comparação com ovócitos imaturos pode ser explicada por alterações morfologias nas conexões entre o ovócito e a parede do folículo que ocorrem durante a expansão das células do cumulus[35].
As taxas de maturação de ovócitos eqüinos in vitro (IVM) são baixas quando comparadas com as de outras espécies. Alem disto, o desenvolvimento embrionário de ovócitos maturados in vitro também é baixo, variando entre 10 e 18%[52,58]. Em comparação, a transferência de ovócitos coletados de folículos pré- ovulatorios resulta em melhores taxas de desenvolvimento embrionário.
Geralmente, os ovócitos são coletados aproximadamente entre 24 e 36 h apos a administração de gonadotropina corionica humana (hCG). Ovócitos coletados as 24 h após a administração de hCG encontram- se em metáfase I e necessitam cultivo in vitro para completarem a maturação [13]. Esses ovócitos são cultivados a 38,5 ºC em uma atmosfera de 5 to 6% CO2em ar por aproximadamente 12 h. A maioria dos ovócitos coletados a 36 h apos a administração de hCG encontram-se em metáfase II[4] e, portanto, podem ser transferidos imediatamente para o oviduto da receptora. As taxas de recuperação de ovócitos e desenvolvimento embrionário para ovócitos coletados as 24 ou 36 h apos a administração de hCG são semelhantes[24, 38].
A transferência de ovócitos para o oviduto da receptora é realizada através de laparotomia pelo flanco[10, 14]. Após sedação e anestesia local, uma incisão e feita no flanco do animal e o ovário e o oviduto são exteriorizados. O ovócito e um pequeno volume de meio (< 150 µl) são aspirados em uma pipeta de vidro. A abertura do infundíbulo é localizada e a pipeta e introduzida de dois a três cm no oviduto, onde o ovócito e depositado. O ovário é reposicionado na cavidade abdominal e as camadas musculares e a pele são suturadas. As receptoras recebem phenylbutazona (2 g por dia) durante a cirurgia e por mais dois dias. O antibiótico (Penicilina G Procaína, 20,000 IU/kg, i.m., por dia) é administrado durante a cirurgia e por mais cinco dias após a transferência.
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Éguas receptoras
Durante OT, o transporte e a capacitatação espermática, bem como a fertilização e o desenvolvimento embrionário, ocorrem no trato reprodutivo da receptora. Portanto, a seleção de éguas receptoras para serem utilizadas em um programa de OT é muito importante. Éguas jovens (3 a 10 anos) são selecionadas após um completo exame físico e reprodutivo, e somente éguas em perfeito estado são selecionadas. Além disto, durante o exame reprodutivo, o comprimento do ligamento largo é avaliado para determinar se os ovários podem ser facilmente expostos durante a transferência; éguas com um comprimento pequeno do ligamento largo não são utilizadas como receptoras de ovócitos.
As receptoras de ovócitos podem ser cíclicas ou acíclicas. O uso de éguas cíclicas como receptoras envolve a sincronização entre a doadora e a receptora, e também a remoção do ovócito pré-ovulatório da receptora[10]. Portanto, as receptoras recebem 2000 I.U. de hCG ao mesmo tempo em que as doadoras, e o ovócito da receptora e coletado aproximadamente 24 h apos a administração do hCG. Somente são utilizadas as receptoras das quais o ovócito foi coletado. O uso de receptoras acíclicas elimina a necessidade de sincronização entre doadora e receptora e da coleta do ovócito da receptora antes da transferência[8]. Receptoras acíclicas recebem 3 mg de estradiol diariamente, por aproximadamente 3 a 6 dias antes da transferência. Suplementação de progesterona ou progestagenos apos a transferência e necessária, usando receptoras cíclicas ou acíclicas. Embora haja a formação de um corpo lúteo apos a aspiração do folículo pré-ovulatorio[39], a secreção de progesterona pode ser mais lenta e reduzida[46]. Em éguas acíclicas, a ausência de corpo lúteo exige a suplementação de progesterona. Portanto, Altrenogest (0.044 mg/kg) ou progesterona em óleo (200 mg/dia) é administrado[8].
Sêmen e inseminações
Para a fertilização ocorrer com sucesso, alem do ovócito maduro, e necessário que o espermatozóide esteja presente no oviduto. Para se obter uma alta taxa de fertilização, são necessários: numero suficiente de spermatozoides na inseminação, com boa motilidade, morfologia normal, e habilidade de sofrer a capacitação e a reação acrosomal. As receptoras de ovócitos devem ser inseminadas com um mínimo de 5 x 108 espermatozóides moveis, com sêmen fresco ou refrigerado. O uso de sêmen congelado para inseminação de receptoras de ovócitos não e aconselhável, porque a fertilidade do sêmen congelado é geralmente menor do que o sêmen a fresco ou refrigerado[54, 55].
Quando sêmen fresco ou refrigerado de boa qualidade é utilizado, as receptoras de ovócitos podem ser inseminadas apenas uma vez, aproximadamente 12 h antes da transferência. Em um estudo recente, Carnevale et al. (2002) inseminou as receptoras de ovócitos 12 h antes e 2 h depois da transferência com sêmen resfriado de garanhões diferentes; os autores observaram que 94% dos embriões produzidos foram originados da primeira inseminação. Entretanto, quando a qualidade espermática não e ótima, uma segunda inseminação 2 h após a cirurgia pode aumentar as chances de fertilização.
O útero das receptoras é avaliado por ultra-sonografia por 2 a 3 dias após a transferência para a detecção de fluido intra-uterino. As receptoras que acumulam fluido são tratadas com 20 a 30 IU de ocitocina a cada 12 h, ate a completa eliminação do fluido intra-uterino.
Aplicação clinica da transferência de ovócito
OT vem sendo realizada comercialmente na Colorado State University desde 1998. As éguas doadoras do programa de OT possuem historias de falha reprodutiva em programas de inseminação e transferência de embrião. Os procedimentos realizados no programa comercial são similares aos descritos acima. Quando se observa na doadora um folículo maior ou igual a 35 mm em diâmetro, juntamente com edema uterino, e relaxamento da cervix e útero, a doadora recebe uma combinação de GnRH e hCG. As doadoras recebem deslorelin (Ovuplant®, 2.2 mg; Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA, USA) e, apos 4 h, 2000 I.U. de hCG. A coleta de ovócito e realizada aproximadamente 22 h apos a administração do hCG.
As receptoras utilizadas no programa comercial são éguas jovens, e podem ser cíclicas ou acíclicas. Dados obtidos das estações reprodutivas entre 1998 e 2002 demonstraram taxas de prenhez similares quando os ovócitos foram transferidos em receptoras cíclicas (27/79, 34%) ou acíclicas (98/249, 39%). No dia da transferência, as receptoras começam a receber suplementação de progesterona injetável, em doses crescente (50, 100, 150 and 200 mg), ate que 200 mg de progesterona sejam administrados diariamente. O diagnóstico de gestação e feito nos dias 12, 14 e 16 apos a transferência e, quando prenha, as receptoras começam a receber Altrenogest (ReguMate®, 0.044 mg/kg, daily; Intervet Inc., Millsboro, DE, USA) e a administração de progesterona injetável e interrompida. A suplementação de progestágenos e interrompida por volta de 120 a 150 dias de gestação, desde que níveis elevados de progestágenos de origem placentária sejam observados.
Em nosso programa comercial, a maioria das receptoras são inseminadas com sêmen refrigerado de garanhões com fertilidade variada. Como já foi mencionado, o uso de sêmen de boa qualidade e necessário para o sucesso da OT. Os proprietários são aconselhados a utilizar sêmen de garanhões férteis, e a enviar múltiplas doses de sêmen por transferência para assegurar que um número suficiente de espermatozóides estarão no oviduto no momento da fertilização. As receptoras são inseminadas aproximadamente 12 h antes da transferência e, se houver sêmen suficiente, novamente 2 h apos a transferência.
Durante a estação reprodutiva de 2003, nosso programa comercial realizou OT em 30 éguas doadoras, com idades entre 4 e 20 anos (media = 19.2 anos). No total, 148 folículos foram aspirados, em 122 ciclos, e 110 ovócitos foram recuperados, resultando em uma taxa de recuperação de ovócito de 74% por folículo aspirado, e 90% por ciclo. Um total de 102 transferências foram realizadas e as taxas de prenhez obtidas nos dias 16 e 50 apos a transferência foram de 43% e 35% respectivamente. Uma ou mais gestações foram obtidas de 22/30 (73%) doadoras em nosso programa. Portanto, OT provou ser uma técnica eficaz na produção de gestações de éguas subférteis.
Transferência Intrafallopiana de Gametas
Embora as siglas OT e GIFT sejam utilizadas indistintivamente na literatura, algumas diferenças devem ser mencionadas. Durante OT, o ovócito da doadora e transferido para o oviduto da receptora, e a receptora e inseminada no útero. GIFT envolve a transferência do ovócito e de um baixo número de espermatozóides (2 to 5 x 105 sperm) para o oviduto da receptora. Uma vez que a GIFT exige um baixo número de espermatozóides e os espermatozóides são depositados próximo ao local de fertilização, essa técnica tem o
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potencial para ser utilizada nos casos em que o número de espermatozóides disponíveis para a inseminação são baixos, i.e., garanhões subférteis, sêmen congelado, e sêmen sexado.
Durante GIFT, os espermatozóides são depositados na região do infundíbulo ou ampola do oviduto, não passando pelo útero e a junção utero-tubarica. Portanto, os espermatozóides devem ser separados do plasma seminal, contaminação e debri. Além disto, spermatozoides com morfologia normal e móveis devem ser selecionados do ejaculado. O método escolhido para separar espermatozóides para serem usados em GIFT foi o gradiente de Percoll[8, 9, 23, 24]. Nestes estudos, sêmen foi centrifugado através do gradiente de Percoll (90/45%), e aproximadamente 2 a 5 x 105 espermatozóides foram transferidos para o oviduto juntamente com os ovócitos. A taxa de desenvolvimento embrionário com GIFT utilizando-se sêmen a fresco (não diluído) variou de 27 a 82%, demonstrando que GIFT pode ser uma técnica alternativa a OT, quando o numero de espermatozóides disponível é baixo.
Entretanto, em programas comerciais, a maioria das inseminações de rotina são feitas com sêmen refrigerado e congelado. Portanto, em um estudo recente, o uso de sêmen refrigerado e congelado para GIFT foi investigado[24]. Quando as receptoras foram inseminadas com sêmen resfriado no útero (OT) ou no oviduto (GIFT), as taxas de desenvolvimento embrionário foram 83% (19/23) e 25% (4/16) respectivamente. O uso de sêmen congelado para GIFT resultou em uma taxa de desenvolvimento embrionário de apenas 8% (1/12). As baixas taxas de desenvolvimento embrionário encontradas com o uso de sêmen resfriado ou congelado podem ser causadas por fatores associados com os processos de refrigeração e congelamento que prejudicam a fertilização quando o sêmen e depositado no oviduto. Estudos são necessários para investigar os efeitos do meio diluente, refrigeração e congelacão dos espermatozóides nas interações entre espermatozóide, oviduto e ovócito, apos a inseminação no oviduto. Para a indústria do cavalo, a utilização bem sucedida de sêmen resfriado e congelado para GIFT resultaria em uma nova técnica de reprodução assistida para ser usada na produção de gestações de éguas e garanhões subférteis.
Injeção Intracitoplasmática de Espermatozóide
A fertilização in vitro (IVF) em eqüinos tem produzido resultados insatisfatórios. As taxas de fertilização apos IFV descritas na literatura variam de 4 a 33%[19, 29, 61], mas somente um laboratório, que obteve altas taxas de fertilização, publicou trabalhos subseqüentes utilizando a mesma técnica, e a taxas de fertilização não foram reproduzidas[27, 28]. Uma das razões para a falta de sucesso da IVF em eqüinos é a inabilidade do espermatozóide em penetrar a zona pelúcida. Isto pode ser atribuído a métodos ineficientes de capacitação espermática in vitro e/ou alterações na zona pelúcida que a fazem resistente à penetração. Os problemas associados com a penetração do espermatozóide na zona pelúcida podem ser superados pela injeção do espermatozóide através da zona pelúcida, em um procedimento chamado injeção intracitoplasmática de espermatozóide (ICSI). ICSI tem sido utilizada em eqüinos porque ela faz com que não sejam necessários alguns dos eventos críticos para a fertilização, como a capacitação espermática, reação acrosomal, aderência e penetração da zona pelúcida, e fusão do espermatozóide com o ovócito.
Os ovócitos usados para ICSI podem ser coletados e maturados in vivo ou in vitro. O desenvolvimento embrionário de ovócitos maturados in vitro (IVM) e geralmente menor do que o de ovócitos maturados in
vivo, quando transferidos para o oviduto de receptoras[52, 58]. Entretanto, a maioria dos estudos realizados com ICSI utilizaram ovócitos coletados de ovários obtidos em abatedouros e maturados in vitro[2, 16-18, 20, 26- 28, 32, 36, 37, 43-45, 59]. Após a maturação, as células do cúmulos são removidas e somente os ovócitos que expeliram o primeiro corpúsculo polar, e estão em metáfase II, são injetados com o espermatozóide.
Para se obter sucesso com a ICSI, algumas características devem ser observados com relação ao espermatozóide escolhido para a injeção. Na teoria, não ha necessidade de que o espermatozóide a ser utilizado para ICSI seja móvel, uma vez que o espermatozóide e injetado dentro do ovócito. Entretanto, Lazzari et al. (2002) observaram baixas taxas de fertilização (9%) e ausência de desenvolvimento embrioná- rio quando espermatozóides sem motilidade foram utilizados para a ICSI. No mesmo estudo, quando espermatozóides de garanhões subférteis com motilidade entre 10 e 30% foram utilizados, taxas de fertiliza- ção e morula/blastocisto de 79 e 36% foram observadas, respectivamente. Portanto, a utilização de espermatozóides móveis para ICSI resultou em maiores taxas de fertilização e desenvolvimento embrionário. Durante a preparação do espermatozóide para ICSI, o flagelo do espermatozóide é danificado para imobilizar o espermatozóide e também para lesar a membrana plasmática. Acredita-se que a ruptura da membrana plasmática facilite a liberação de fatores espermáticos para ativação do ovócito[30]. A ativação do ovócito durante a fertilização induz oscilações dos níveis de cálcio intracelular, importantes para o reinicio da meiose, formação dos pronúcleos, síntese de DNA, e inicio das divisões celulares[15, 31, 42, 49]. Em eqüinos, existe controvérsia com relação a necessidade de se ativar o ovócito após ICSI. A ativação química dos ovócitos após ICSI foi benéfica quando sêmen a fresco foi utilizado[37, 41, 56, 57]. Entretanto, quando se utilizou sêmen congelado, taxas satisfatórias de formação de pronúcleo (50%) foram observadas sem a necessidade de ativação do ovócito[27, 28, 36, 47]. Além disto, Choi et al. (2002) obteve taxas de formação de pronúcleo similares utilizando sêmen a fresco ou congelado, sem a ativação dos ovócitos. Portanto, a necessidade de ativação dos ovócitos eqüinos apos ICSI permanece obscura; resultados similares podem ser obtidos com a ICSI utilizando-se sêmen a fresco ou congelado.
Após a ICSI, os zigotos podem ser cultivados in vitro ou transferidos imediatamente para o oviduto da receptora. Poucos estudos foram realizados na área de cultivo de embriões eqüinos e, ate o momento, não existe um sistema adequado. O maior problema associado com a falta de pesquisa na área de cultivo de embriões eqüinos e o numero escasso de embriões disponíveis para pesquisa, uma vez que a produção de embriões in vitro não e bem sucedida. Alternativamente, os zigotos podem ser transferidos para o oviduto da receptora após a ICSI. Em alguns estudos, os zigotos foram transferidos com sucesso para o oviduto de ovelhas[34, 43], camundongo[36] e éguas[20, 47]. A transferência de zigotos para o oviduto de receptoras resultou em taxas de morula/blastocisto entre 19 e 50%. Hinrichs et al. (2004) obteve maiores taxas de blastocisto quando os zigotos foram transferidos para o oviduto de éguas (36%) comparado com vários métodos de cultivo in vitro (0-20%). Além disto, McKinnon et al. (2000) observou uma redução significativa nas taxas de prenhez após a transferência de embriões cultivados por 24 (17%) ou 48 h (0%) apos a ICSI, comparado com um cultivo de 4-6 h (38%). A transferência de zigotos apos a ICSI para o oviduto de receptoras proporcionou melhores condições para o desenvolvimento embrionário do que os métodos de cultivo in vitro. Entretanto, somente 52 a 67% dos embriões transferidos foram recuperados do oviduto apos a transferência[16, 20].
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produzidos com essa técnica[21, 45, 47, 59]. Além disto, durante a estação reprodutiva de 2003, nosso laborató- rio produziu 4 potros utilizando sêmen de um garanhão subfértil. Entretanto, ICSI exige um equipamento caro e treinamento extensivo e, portanto, a utilização clinica desta técnica ainda e limitada. Em um futuro próximo, com a melhora nas taxas de desenvolvimento embrionário da ICSI devido aos avanços obtidos com pesquisas nas áreas de maturação e ativação de ovócitos e cultivo de embriões, ICSI poderá ser utilizada para a produção de gestações a partir de animais subférteis.
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