Tratamento com inibidor Rhosin

As linhagens leucêmicas foram tratadas com o inibidor de Rho GTPases Rhosin (Calbiochem). O Rhosin é um inibidor novo sintetizado em 2012 e atua como inibidor dual de RhoA e RhoC. As concentrações utilizadas foram as doses de 1µM, 3µM, 5µM, 10µM, 30µM, 50µM, 70µM, 100µM e 150µM, que foram posteriormente padronizadas de acordo com os melhores resultados e sem morte celular exacerbada. As linhagens foram incubadas por 12 horas com privação de soro fetal bovino 1% e cultivadas com soro fetal bovino 2% por 24, 48, 72 e 96 horas.

3.6.1 Ensaio de Pull Down para avaliação da atividade de Rho GTPases

A atividade das proteínas Rho GTPases RhoA e RhoC foi determinada por ensaio de precipitação por afinidade em extratos proteicos provenientes de células U937 e THP1 tratadas com Rhosin nas doses de 3μM, 5μM, 10μM, 30μM e 50μM no tempo de 48 horas. Resumidamente, após coleta as células foram lisadas com tampão de lise (50mM de Tris, 1% triton-X 100, 0,5% deoxicolato de sódio, 0,1% SDS, 500mM NaCl, 10mM de MgCl2 e inibidores de proteases) e o lisado proteico foi então incubado com proteínas Rhotekin contendo os domínios de ligação a Rho (GST-TRBD) a 4oC sob agitação durante 4 horas, para que a ligação entre as proteína fossem efetuadas. Após 4 lavagens com tampão específico, as amostras foram submetidas à eletroforese em gel de acrilamida 15% e, após transferência para membrana de nitrocelulose, as membranas foram incubadas com anticorpos anti-RhoA ou anti-RhoC. A atividade de RhoA/C foi quantificada pela expressão proteica normalizada por GAPDH ou Actina.

3.6.2 Western blotting

Ao precipitado celular contendo 5x106 células foi acrescentado tampão de extração de proteínas contendo 100 mM Tris (pH 7.6), 1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 0,1 mg Aprotinina, 35 mg PMSF/ml, 10 mM Na3VO4, 100mM NaF, 10mM Na4P2O7, e 4 mM EDTA. As amostras foram homogeneizadas e após 30 minutos a 4oC, foram centrifugadas durante 20 minutos. Alíquotas com mesma concentração proteica foram utilizadas com adição de tampão laemmli e aquecidos em banho fervente por 5 minutos. O extrato total ou as proteínas imunoprecipitadas foram submetidas ao fracionamento em gel de 10% ou 12% ou 15% de poliacrilamida contendo SDS (SDS-PAGE) em aparelho de eletroforese. A eletrotransferência das proteínas do gel para a membrana de nitrocelulose foi realizada em 90 minutos a 120 V (constante) em aparelho de transferência da Bio-Rad. A ligação dos anticorpos às proteínas não específicas foi reduzida por pré-incubação da membrana por 1 hora com tampão de bloqueio (5% leite em pó magro, 10 mmol/L Tris, 150 mmol/L NaCl, and 0.02% Tween 20) a 4°C. A membrana de nitrocelulose foi incubada com anticorpos específicos em tampão de bloqueio (3% de leite em pó magro) por 12 horas a 4°C e então lavadas 3 vezes com solução basal (10 mmol/L Tris, 150 mmol/L NaCl, and 0.02% Tween 20). Os anticorpos primários utilizados estão descritos na Tabela 3.

Tabela 3. Anticorpos utilizados para ensaio de western blotting.

Anticorpo Animal Fabricante

Anti-Bcl-2 Cabra Santa Cruz Biotecnology

Anti-LC3 Coelho Abcam

Anti-ciclina A Camundongo Santa Cruz Biotecnology Anti-ciclina D Camundongo Santa Cruz Biotecnology Anti-ciclina E Coelho Santa Cruz Biotecnology

CDK4 Camundongo Santa Cruz Biotecnology

CDK6 Camundongo Santa Cruz Biotecnology

RhoA Coelho Cell signaling

RhoC Coelho Cell signaling

Anti-Actina Cabra Santa Cruz Biotecnology Anti-GAPDH Camundongo Santa Cruz Biotecnology

3.6.3 Ensaio de viabilidade celular

A viabilidade celular foi mensurada com o reagente 3-(4.5- dimethylthiazol-2-yl)-2.5- diphenyltetrazolium bromide (MTT). Possíveis diferenças na viabilidade celular podem ser em decorrência da diminuição da taxa de proliferação ou do aumento de morte celular. Um total de 2×104 células foi distribuída e cultivada em meio RPMI com diferentes concentrações de SFB e com diferentes concentrações de Rhosin por 24, 48, 72 e 96 horas. Em resumo, 10μL de uma solução a 5mg/mL de MTT foi adicionada as células de cada poço e incubadas na estufa à 37ºC por 4 horas. A reação foi interrompida pela adição de 100μL de 0,1N HCl em isopropanol. A atividade mitocondrial foi então mensurada por um espectrofotômetro a 550 nm de absorbância no leitor de ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Este ensaio avalia a atividade mitocondrial através da redução do MTT (sal de coloração amarela e solúvel em água) a Formazan (sal de coloração arroxeada e insolúvel em água), catalisada pela atividade enzimática de desidrogenases mitocondriais. A redução do MTT a Formazan é diretamente proporcional à atividade mitocondrial.

3.6.4 Avaliação de apoptose por citometria de fluxo

A apoptose foi avaliada através da marcação de anexina-V (BD, Biosciences), uma vez que a célula em apoptose perde a assimetria de membrana, pois o fosfolipídeo fosfatidilserina é deslocado do interior da

membrana plasmática para fora dela, com sua exposição no ambiente externo. As células foram marcadas com 3μL de anexina V e 3 μL de iodeto de propídio (PI) e incubadas no escuro durante 15 minutos em temperatura ambiente. Após este período, a leitura foi realizada em um FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA). Dez mil eventos foram adquiridos para cada amostra.

3.6.5 Avaliação de autofagia por citometria de fluxo

A formação de vesículas ácidas foi avaliada por citometria de fluxo com o reagente laranja de acridina, uma vez que este marca as vesículas ácidas formadas durante o processo autofágico. Resumidamente, as células foram marcadas com 5μM de laranja de acridina (3,6-dimetillaminoacridina) (Sigma) e incubadas ao abrigo de luz por 15 minutos, em temperatura ambiente. Após este período, as células foram centrifugadas e a intensidade de fluorescência foi determinada (canais FL1 e FL3) em um FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA). Dez mil eventos foram adquiridos para cada amostra.

3.6.6 Avaliação do ciclo celular

As células foram coletadas e após centrifugação foram fixadas em etanol 70% e armazenadas em geladeira por um período mínimo de quatro horas. Após nova centrifugação e lavagem com PBS, as amostras foram ressuspendidas em tampão específico para marcação do ciclo celular (0,1% triton, 10mg/mL idodeto de propídeo, 0,1mg/mL RNAse A), incubadas a 37oC por 15 minutos e submetidas à leitura em citômetro de fluxo. A marcação de cada condição (controle e siRNA) foi feita em duplicata, a leitura foi realizada por citometria de fluxo e a análise com o programa ModFit. Dez mil eventos foram adquiridos para cada amostra.

3.6.7 Ensaio de clonogenicidade (formação de colônias)

Em uma placa de 12 poços foram cultivadas 3x103 células por poço em meio semi-sólido (Methocult H4230, StemCell Technologies Inc) desprovido de quaisquer fatores de crescimento. As células foram incubadas por 7 dias,

foram contadas através de camâra de Neubauer e coradas com 200µL de MTT (5mg/mL).

3.6.8 Proliferação celular com o reagente CFSE (5,6-carboxy-fluorescein-

succinimidyl-ester)

O CFSE é um corante com propriedades fluorescentes, utilizado para mensurar a proliferação celular ao entrar no citoplasma e marcá-lo. Ao se dividir, uma célula marcada com CFSE gera duas células filhas que contém metade da quantidade de CFSE da célula original, e assim por diante. A marcação é herdada pelas células filhas após uma divisão celular e não é transferida para as células adjacentes em uma população, sendo efetiva por até 8 divisões celulares (Quah et al., 20017).

Células U937 foram incubadas com o reagente CFSE (Invitrogen, Life Technologies), previamente diluído (concentração 1:5000) em PBS com SFB 5% por 20 minutos a 37oC. As células foram então lavadas 2 vezes com PBS e cultivadas em diferentes concentrações de Rhosin. Após 24 ou 48 horas, as células foram lavadas, ressuspendidas em PBS, fixadas com paraformoldeído 1%. A fluorescencia foi avaliada através de um FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA) e análise a proliferação foi analisada com o software MOD FIT, que identifica a porcentagem de células em cada geração e calcula um índice de proliferação (IP) relativo à marcação celular no tempo 0 (IP=1). Dez mil eventos foram adquiridos para cada amostra.