Tratamento com Rhosin

As atividades dos membros da família Rho dependem de um equilíbrio delicado entre o estado ativo ligado ao GTP e o estado inativo ligado ao GDP, que está sujeito a uma regulação rígida nas células em resposta a sinais fisiológicos e patológicos. Os fatores de troca de nucleotídeos de guanina (GEFs) representam a principal classe de enzimas de que vão atuar na ativação das Rho GTPases servindo para retransmitir uma variedade de sinais para catalisar a troca GDP/GTP (Hodge e Ridley, 2016). Até o momento, foram descritas aproximadamente 80 Rho GEFs que regulam as atividades das Rho GTPases em mamíferos (Vigil et al., 2010). A abundância dos substratos Rho GEFs se comparado com a quantidade de Rho GTPases permite que as GEFs funcionem de maneira específica para cada tipo de sinalização em tecido ou célula (Rossman et al., 2005).

O composto Rhosin foi sintetizado em 2012 por Shang e colaboradores e é o primeiro inibidor que atua inibindo especificamente Rho e não seus efetores (Shang et al., 2012). Apesar da alta homologia entre RhoA e RhoC, apenas a expressão de RhoC foi encontrada aumentada em LMA. Porém, ainda não existe um inibidor farmacológico específico de RhoC comercialmente disponível.

O primeiro tratamento com Rhosin descrito na literatura foi publicado pelo mesmo grupo que sintetizou o composto. Para testar a sua efetividade, linhagem de câncer de mama MCF7 foi tratada com as doses de 30μM e 50μM. O tratamento induziu diminuição do crescimento celular de mamoesferas e diminuição de apoptose, mas não houve alteração na progressão do ciclo celular. Rhosin ainda inibiu as atividades de migração e invasão de células MCF7 (Shang et al., 2013).

Sabe-se que RhoC atua na migração e na invasão de células tumorais (Hakem et al., 2005; Lang et al., 2017). Células esferoides têm capacidade de migração e invasão 3 a 5 vezes maior do que células monocamadas, e estas capacidades são dependentes da atividade de Rho. Em linhagem de adenocarcinoma gástrico difuso, o tratamento com Rhosin diminuiu a expressão do fator de transcrição de células-tronco, Sox2, e diminuiu a formação de esferoides em até 80% (Yoon et al., 2016).

O tratamento com Rhosin na dose de 50μM em conjunto com o tratamento com gastrina em linhagem de câncer de pâncreas reduziu a polarização celular e a formação de aderências celulares focais, ocasionando a diminuição da cicatrização de feridas e a diminuição da capacidade de invasão das células (Mu et al., 2018).

Um estudo recente mostrou que o tratamento na dose de 30μM em linhagem celular de câncer de próstata agiu como adjuvante da diminuição na reorganização do citoesqueleto de actina, diminuição da migração celular e da proliferação (Li et al. Cancer Biol Ther, 2018).

Não encontramos trabalhos publicados sobre o uso de Rhosin em linhagens mieloides e, portanto, tratamos nossas células inicialmente com várias concentrações deste fármaco (1μM-150μM) nos tempos de 24, 48, 72 e 96 horas. Rhosin induziu inibição das atividades de RhoA e de RhoC. Nossos ensaios subsequentes mostraram que o tratamento com Rhosin, sobretudo nas doses de 30μM e 50μM, promoveu diminuição da viabilidade celular, diminuição da apoptose, diminuição da proliferação clonal e da proliferação, aumento da autofagia e acúmulo de células na fase G1 do ciclo celular. Assim, as doses de Rhosin que foram mais efetivas em linhagens mieloides são as mesmas que foram previamente descritas em outros tipos celulares.

Além das linhagens celulares, tratamos com Rhosin as células CD34+ da medula óssea de três pacientes com LMA. Não conseguimos fazer a privação de SFB para aumentar a responsividade das células primárias, pois estas apresentam baixa viabilidade quando cultivadas in vitro. Após 48 horas de tratamento, observamos aumento de apoptose nas células de um paciente nas doses de 30μM e 50μM. Esta diferença na responsividade ao fármaco pode ser um reflexo da variabilidade de cada paciente e de suas diferentes respostas aos tratamentos.

Células de carcinoma hepatocelular silenciadas com siRNA para RhoC apresentaram diminuição da proliferação, aumento de apoptose, aumento de Bax e diminuição de Bcl-2. Também foi observado acúmulo de células na fase G0/G1 do ciclo celular com diminuição de ciclina D1 e de CDK4 e aumento de p21 (Xie et al. Med Oncol, 2012). Estes dados também estão de acordo com

nossos resultados, já que observamos a diminuição da proteína anti-apoptótica Bcl-2 e aumento do inibidor de cinase dependente de ciclina p21 após o tratamento com Rhosin em células U937.

Além disso, descrevemos pela primeira vez os seguintes efeitos de Rhosin: diminuição da proliferação clonal, aumento da autofagia e acúmulo de células na fase G1 do ciclo, os quais estão de acordo com a diminuição da proliferação observada.

Considerando-se que Rhosin não é um inibidor específico para RhoC, não é possível afirmar se os efeitos aqui descritos são decorrentes da inibição de RhoA, RhoC ou de ambas. Futuramente será necessário inibir RhoC especificamente para verificar, se apenas com a inibição de RhoC, os efeitos celulares obtidos serão os mesmos.

Em conclusão, esta é a primeira vez que a expressão gênica de RhoC é avaliada em pacientes com leucemia mieloide aguda e se encontra aumentada quando comparada com doadores sadios. O presente estudo indicou que RhoC possui importantes funções na leucemia mieloide aguda. Além disso, a inibição dual de RhoA e de RhoC resultou em alterações na viabilidade celular, apoptose, autofagia, ciclo celular, formação de colônias e proliferação. Os achados aqui descritos sugerem que RhoC pode ser uma molécula alvo para a terapia de leucemia mieloide aguda, sendo importante elucidar seu papel nesta doença para direcionar possíveis novos tratamentos.

6. CONCLUSÕES

O conjunto de resultados apresentados neste trabalho permite as seguintes conclusões:

 A expressão gênica de RhoC, de RhoBTB2 e Rnd2 apresentam-se aumentadas em medula óssea de pacientes com LMA de novo, enquanto a expressão gênica de RhoQ, diminuída em medula óssea de pacientes com LMA secundária à SMD.

 RhoC é fator independente de pior sobrevida em LMA.

 O tratamento com o inibidor Rhosin em linhagens leucêmicas nas maiores concentrações:

 Reduziu viabilidade, proliferação e proliferação clonal em linhagens leucêmicas.

 Aumentou apoptose, autofagia e células na fase G1 do ciclo celular em linhagens leucêmicas.

7. REFERÊNCIAS

 Abdul-Hay M. Acute myeloid leukemia: a comprehensive review and 2016 update. Blood Cancer J. 2016; 6(7):e441.

 Adams G, Scadden D. The hematopoietic stem cell in its place. Nat Immunol. 2006, Vol. 4, 333-337.

 Ades, L., R. Itzykson, and P. Fenaux, Myelodysplastic syndromes. Lancet, 2014. 383(9936): p. 2239-52.

 Alan JK and Lundquist EA. Mutationally activated Rho GTPases in cancer. Small GTPases 2013; 4:159-63.

 Arber DA, Orazi A, Hasserjian R, Thiele J, Borowitz MJ, Le Beau MM, Bloomfield CD, Cazzola M, Vardiman JW: The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute leukemia. Blood 2016, 127(20):2391-2405.

 Aspenstrom P, Fransson Å, and Saras J. Rho GTPases have diverse effects on the organization of the actin filament system. Biochem J. 2004 Jan 15;377(Pt 2):327-37.

 Aspenstrom P, Ruusala A, and Pacholsky D. Taking Rho GTPases to the next level: the cellular functions of atypical Rho GTPases. Exp Cell Res 2007; 313:3673-9.

 Asquith, B.; Debacq, C.; et al. Quantifying lymphocyte kinetics in vivo using carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE). Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences, v.273, p.1165- 1171, 2006.

 Balderman, S.R. & Calvi, L.M. Biology of BM failure syndromes: role of microenvironment and niches. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2014, 71-6 (2014).

 Belson M, Kingsley B e Holmes A (2007) Risk Factors for Acute Leukemia in Children: A Review. Environ Health Perspect 115: 138-145.  Boettner B., Van Aelst L. The role of Rho GTPases in disease

 Boureux A, Vignal E, Faure S, and Fort P. Evolution of the Rho family of ras-like GTPases in Eukaryotes. Molecular Biology and Evolution, 2006; 24:203-216.

 Brunett, A. K.; Acute Myeloid Leukemia: Treatment of Adult Under 60 Years. Reviews in Clinical and Experimental Hematology 2002; 6(1):26- 45.

 Burnett A, Wetzler M, Lowenberg B: Therapeutic advances in acute myeloid leukemia. J Clin Oncol 2011, 29(5):487-494.

 Charollais J, Van Der Goot FG. 2009. Palmitoylation of membrane proteins. Mol. Membr. Biol. 26, 55–66.

 Clark EA, Golub TR, Lander ES, Hynes RO. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 2000;406:532– 535.

 Cogle, C.R. et al. Bone marrow niche in the myelodysplastic syndromes. Leuk Res 39, 1020-7 (2015).

 Cook DR, Rossman KL, and Der CJ. Rho guanine nucleotide exchange factors: regulators of Rho GTPase activity in development and disease. Oncogene 2014; 33:4021-35.

 Corey, S.J. et al. Myelodysplastic syndromes: the complexity of stem-cell diseases. Nat Rev Cancer 7, 118-29 (2007).

 Cox, D. R. & Oakes, D., 1984. Analysis of Survival Data. London: Chapman & Hall.

 Cox, D. R., 1972. Regression models and life tables (with discussion). Journal of the Royal Statistical Society: Series B, 34:187- 220

 Crowley, J. & Breslow, N., 1994. Statistical analysis of survival data. Annual Review of Public Health, 5:385-411.

 DerMardirossian C, Bokoch GM (2005) GDIs: central regulatory molecules in Rho GTPase activation. Trends Cell Biol 15: 356–363.  Estey EH (2013) Acute myeloid leukemia: 2013 update on risk-

 Etienne-Manneville S and Hall A. Rho GTPases in cell biology. Nature 2002; 420(6916):629-35.

 Evrard, B.; Dosgilbert, A.; Jacquemot, N.; et al. CFSE flow cytometric quantification of lymphocytic proliferation in extracorporeal photopheresis: use for quality control. Transfusion and Apheresis Science, v.42, p-11-19, 2010.

 Ferrara, F.; Schiffer, C. A. Acute myeloid leukemia in adults. Lancet, 2013; 381(9865): 484-495.

 Florian, M. C., Dorr, K., Niebel, A., Daria, D., Schrezenmeier, H., Rojewski, M., et al., expression in tumourigenesis: evidence for a significant link. Bioessays 2005;27(6):602-13.

 Florian M. C., Dorr, K, Niebel A, Daria D, et al. Cdc42 activity regulates hematopoietic stem cell aging and rejuvenation. Cell Stem Cell, 2012. 10(5):520-30.

 Ganan-Gomez, I. et al. Deregulation of innate immune and inflammatory signaling in myelodysplastic syndromes. Leukemia 29, 1458-69 (2015).  Garcia-Manero G: Myelodysplastic syndromes: 2015 Update on

diagnosis, risk-stratification and management. Am J Hematol. 2015,90(9):831-41.

 Garcia-Mata R, Boulter E, and Burridge K. The 'invisible hand': regulation of Rho GTPases by RhoGDIs. Nat Rev Mol Cell Biol, 2011;(8):493-504.  Gidaro A, Deliliers GL, Gallipoli P, et al. Laboratory and clinical risk

assessment to treat myelodysplatic syndromes. Clin Chem Lab Med.  Gomez del PT, Benitah SA, Valeron PF, Espina C, and Lacal JC. Rho

GTPase expression in tumorigenesis: evidence for a significant link. Bioessays, 2005; (6)602-613.

 Greenberg, P.L. et al. Myelodysplastic syndromes, version 2.2015. J Natl Compr Canc Netw 13, 261-72 (2015). 76.

 Greenberg, P.L. et al. Revised international prognostic scoring system for myelodysplastic syndromes. Blood 120, 2454-65 (2012).

 Gu, Y., Filippi, M. D., Cancelas, J. A., Siefring, J. E., Williams, E. P., Jasti, A. C., et al., Hematopoietic cell regulation by Rac1 and Rac2 guanosine triphosphatases. Science, 2003. 302(5644):445-9.

 Hakem A, Sanchez-Sweatman O, You-Ten A, Duncan G, Wakeham A, et al. RhoC is dispensable for embryogenesis and tumor initiation but essential for metastasis. Genes Dev. 2005;19:1974–1979.

 Hall A Rho family GTPases. Biochem Soc Trans. 2012; 40:1378-82.  Hall A, Paterson HF, Adamson P, Ridley AJ. Cellular responses

regulated by rho-related small GTP-binding proteins. Philos Trans R Soc Lond Ser B Biol Sci. 1993;340(1293):267–271.

 Hall, A., Rho GTPases and the control of cell behaviour. Biochem Soc Trans, 2005;33(Pt 5):891-5.

 Heasman SJ and Ridley AJ. Mammalian Rho GTPases: new insights into their functions from in vivo studies. Nat Rev Mol Cell Biol 2008; 9:690- 701.

 Hodge, Richard G. & Ridley, Anne J. Regulating Rho GTPases and their regulators. Nature Reviews Molecular Cell Biology volume 17, pages 496–510 (2016).

 Ikoma T, Takahashi T, Nagano S, Li YM, Ohno Y, et al. A definitive role of RhoC in metastasis of orthotopic lung cancer in mice. Clin Cancer Res. 2004;10:1192–1200.

 Islam M, Lin G, Brenner JC, Pan Q, Merajver SD, et al. RhoC expression and head and neck cancer metastasis. Mol Cancer Res. 2009;7:1771– 1780.

 Jaffe A.B., Hall A. Rho GTPases: Biochemistry and biology. Annu. Rev. Cell Dev.Biol. 2005;21:247–269.

 Jansen, M., Yang, F. C., Cancelas, J. A., Bailey, J. R., and Williams, D. A., Rac2-deficient hematopoietic stem cells show defective interaction with the hematopoietic microenvironment and long-term engraftment failure. Stem Cells, 2005. 23(3): p. 335-346.

 Issa, Jean-Pierre J. The myelodysplastic syndrome as a prototypical epigenetic disease. Blood May 2013, 121 (19) 3811-3817.

 Karlsson R, Pedersen ED, Wang Z, and Brakebusch C Rho GTPase function in tumorigenesis. Biochim Biophys Acta. 2009;1796:91-8.

 Kishore J, Goel MK, Khanna P. Understanding survival anaysis: Kaplan- Meier estimate. Int J Ayurveda Res. 2010 Oct;1(4):274-8.

 Kleer CG, Griffith KA, Sabel MS, Gallagher G, van Golen KL, et al. RhoC-GTPase is a novel tissue biomarker associated with biologically aggressive carcinomas of the breast. Breast Cancer Res Treat. 2005;93:101–110.

 Kundranda MN, Tibes R, Mesa RA. Transformation of a chronic myeloproliferative neoplasm to acute myelogenous leukemia: does anything work? Curr Hematol Malig Rep. 2012;7(1):78-86.

 Lane J, Martin TA, Jiang WG. Targeting RhoC by way of ribozyme trangene in human breast cancer cells and its impact on cancer invasion. World J Oncol. 2010;1(1):7‐13.

 Lang S, Busch H, Boerries M, Brummer T, Timme S, Lassmann S, et al. Specific role of RhoC in tumor invasion and metastasis. Oncotarget. 2017;8(50):87364–87378.

 Ley TJ, Miller C, Ding L, et al. Genomic and epigenomic landscapes of adult de novo acute myeloid leukemia. N Engl J Med 2013;368:2059–74.  Marcucci G, Yan P, Maharry K, et al. Epigenetics meets genetics in acute myeloid leukemia: clinical impact of a novel seven-gene score. J Clin Oncol. 2014;32(6):548–556.

 McCollum G, Keng PC, States JC, McCabe MJ. (2005). “Arsenite delays progression through each cell cycle phase and induces apoptosis following G(2)/M arrest in U937 myeloid leukemia cells”. J Pharmacol Exp Therap 2: 877-887.

 Medinger M, Lengerke C, Passweg J: Novel Prognostic and Therapeutic Mutations in Acute Myeloid Leukemia. Cancer Genomics Proteomics 2016 09-10;13(5):317-29.

 Morrison S, Spradling A. Sten cells and niches: mechanisms that promote stem cell maintenance throughout life. Cell. 2008, Vol. 4, 598- 611.

 Mufti, G.J. Pathobiology, classification, and diagnosis of myelodysplastic syndrome. Best Pract Res Clin Haematol 17, 543-57 (2004).

 Mulloy, J. C., Cancelas, J. A., Filippi, M. D., Kalfa, T. A., Guo, F., and Zheng, Y., Rho GTPases in hematopoiesis and hemopathies. Blood, 2010;115(5):936-47.

 Navarro-Lerida I, Sanchez-Perales S, Calvo M, Rentero C, Zheng Y, Enrich C, Del Pozo MA. 2012. A palmitoylation switch mechanism regulates Rac1 function and membrane organization. EMBO J. 31, 534– 551.

 Neha K, Yasemin Yuksel D, LeWei B, Sofia DM, Mohamed EHE. "Smart" nanoparticles enhance the cytoplasmic delivery of anti‐RhoC silencing RNA and inhibit the migration and invasion of aggressive breast cancer cells. Mol Pharmaceut. 2015;12(7):2406‐2417.

 Nimer SD. Myelodysplastic syndromes. Blood. 2008;111(10): 4841-51.  Nobes, C D et al. A new member of the Rho Family, Rnd1, promotes

disassembly of actin filament structures and loss of cell adhesion. The journal of cell biology, 1998-vol 141:187-197.

 Nolte F, Hofmann WK: Myelodysplastic syndromes: molecular pathogenesis and genomic changes. Ann Hematol 2008, 87(10):777- 795.

 Oleksy A, Opaliński Ł, Derewenda U, Derewenda ZS, Otlewski J. The molecular basis of RhoA specificity in the guanine nucleotide exchange factor PDZ-RhoGEF. J Biol Chem. 2006;281(43):32891-7.

 Pajic M, Herrmann D, Vennin C, Conway JR, Chin VT, Johnsson AK, Welch HC, and Timpson P. The dynamics of Rho GTPase signaling and implications for targeting cancer and the tumor microenvironment. Small GTPases 2015;6:123-33.

 Pardee AB. A restriction point for control of normal animal cell proliferation. Proc Natl Acad Sci USA 1974; 71: 1286–1290.

 Porter AP, Papaioannou A, Malliri A. Deregulation of Rho GTPases in cancer. Small GTPases 2016; 7:1-16.

 Quah BJ, Warren HS, Parish CR: Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2007;2(9):2049-56.

 Raza, A. and N. Galili, The genetic basis of phenotypic heterogeneity in myelodysplastic syndromes. Nat Rev Cancer, 2012. 12(12):849-59.  Resh MD. 2006. Trafficking and signaling by fatty-acylated and

prenylated proteins. Nat. Chem. Biol. 2, 584–590.

 Ridley AJ Rho GTPase signalling in cell migration. Curr Opin Cell Biol 2015; 36:103-12.

 Ridley AJ. Rho GTPases and cell migration. J. Cell Sci. 2001;114:2713– 2722.

 Ridley AJ. RhoA, RhoB and RhoC have different roles in cancer cell migration. J Microsc 2013;251:242-9.

 Ridley AJ: Rho GTPases and actin dynamics in membrane protrusions and vesicle trafficking. Trends Cell Biol. 2006;16(10):522-9.

 Rosenthal DT, Zhang J, Bao L, Zhu L, Wu Z, Toy K, Kleer CG, Merajver SD (2012) RhoC impacts the metastatic potential and abundance of breast cancer stem cells. PLoS One 7(7):e40979.

 Rossman, K.L., Der, C.J., and Sondek, J. (2005). GEF means go: turn- ing on RHO GTPases with guanine nucleotide-exchange factors. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 167–180.

 Rund D, Krichevsky S, Bar-Cohen S, Goldschmidt N, Kedmi M, Malik E, Gural A, Shafran-Tikva S, Ben-Neriah S, Ben-Yehuda D: Therapy-related leukemia: clinical characteristics and analysis of new molecular risk factors in 96 adult patients. Leukemia 2005, 19(11):1919-1928.

 Sahai E and Marshall CJ. Rho GTPases and cancer. Nat Rev Cancer 2002;2:133- 42.

 Sandler, DP e Ross, JA (1997) Epidemiology of acute leukemia in children and adults. Semin Oncol 24: 3-16.

 Shang X, et al. Rational design of small molecule inhibitors targeting RhoA subfamily Rho GTPases. Chem Biol. 2012;19(6):699–710.

 Sherr C and Roberts J. Cdk inhibitors: positive and negative regulators of G1-phase progression. Genes Dev 13: 1501–1514, 1999.

 Shikada Y, Yoshino I, Okamoto T, Fukuyama S, Kameyama T, Maehara Y. Higher expression of RhoC is related to invasiveness in non-small cell lung carcinoma. Clin Cancer Res. 2003;9(14):5282–5286.

 Shinto E, Tsuda H, Matsubara O, Mochizuki H. Significance of RhoC expression in terms of invasion and metastasis of colorectal cancer. Nihon Rinsho. 2003;61(Suppl 7):215–219.

 Short NJ, Ravandi F. Acute Myeloid Leukemia: Past, Present, and Prospects for the Future. Clin Lymphoma Myeloma Leuk. 2016;16 Suppl:S25-9.

 Shuli X, Mingguang Z, Guoyue L, et al. Overexpression of Ras homologous C (RhoC) induces malignant transformation of hepatocytes in vitro and in nude mouse xenografts. PLoS ONE. 2013;8(1):e54493.  Sundstrom C, Nilsson K (1976). “Establishment and characterization of a

humam histiocytic lymphoma cell line (U937)”. Int J Cancer 17: 565-577.  Takai Y., Sasaki T., Matozaki T. Small GTP-binding proteins. Physiol.

Rev. 2001;81:153–208.

 Tcherkezian J and Lamarche-Vane N. Current knowledge of the large RhoGAP family of proteins. Biol Cell 2007; 99:67-86.

 Tesfai Y, Ford J, Carter KW, Firth MJ, O'Leary RA, Gottardo NG, Cole C, Kees UR: Interactions between acute lymphoblastic leukemia and bone marrow stromal cells influence response to therapy. Leuk Res 2012;36(3):299-306.

 Testa U, Riccioni R: Deregulation of apoptosis in acute myeloid leukemia. Haematologica 2007, 92(1):81-94.

 Troeger A and Williams DA: Hematopoietic-specific Rho GTPases Rac2 and RhoH and human blood disorders. Exp Cell Res. 2013 Sep 10; 319(15): 2375–2383.

 Tsuchiya S, et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int. J. Cancer 26: 171-176, 1980.

 van Golen KL, Wu ZF, Qiao XT, Bao LW, Merajver SD. RhoC GTPase, a novel transforming oncogene for human mammary epithelial cells that partially recapitulates the inflammatory breast cancer phenotype. Cancer Res. 2000;60:5832–5838.

 van Helden, S. F., Anthony, E. C., Dee, R., and Hordijk, P. L., Rho GTPase expression in human myeloid cells. Plos One, 2012. 7(8):e42563.

 Vega FM and Ridley AJ. Rho GTPases in cancer cell biology. FEBS Lett 2008; 582(14):2093-101.

 Vernell, R., Helin, K., and Muller, H. 2003. Identification of target genes of the p16INK4A-pRB-E2F pathway. J. Biol. Chem. 278:46124–46137.  Vigil D, Cherfils J, Rossman KL, Der CJ. Ras superfamily GEFs and

GAPs: validated and tractable targets for cancer therapy? Nat. Rev. Cancer. 2010;10:842–857.

 Wang D, Dou K, Xiang H, Song Z, Zhao Q, Chen Y, and Li Y. Involvement of RhoA in progression of human hepatocellular carcinoma. J Gastroenterol Hepatol 2007; 22:1916-20.

 Wang W, Wu F, Fang F, Tao Y, Yang L. RhoC is essential for angiogenesis induced by hepatocellular carcinoma cells via regulation of endothelial cell organization. Cancer Sci. 2008;99(10):2012.

 Wang, L., Yang, L., Filippi, M. D., Williams, D. A., and Zheng, Y., Genetic deletion of Cdc42GAP reveals a role of Cdc42 in erythropoiesis and hematopoietic stem/progenitor cell survival, adhesion, and engraftment. Blood, 2006. 107(1):98-105.1

 Wheeler AP, Ridley AJ. Why three Rho proteins? RhoA, RhoB, RhoC, and cell motility. Exp Cell Res. 2004;301:43–49.

 Williams, D. A., Zheng, Y., and Cancelas, J. A., Rho GTPases and regulation of hematopoietic stem cell localization. Methods Enzymol, 2008. 439:365-93.

 Yang, L., Wang, L., Geiger, H., Cancelas, J. A., Mo, J., and Zheng, Y., Rho GTPase Cdc42 coordinates hematopoietic stem cell quiescence and niche interaction in the bone marrow. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007;104(12):5091-6.

 Yun S, Vincelette ND, Abraham V, et al. Targeting epigenetic pathways in acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndrome: a systematic review of hypomethylating agents trials. Clinical Epigenetic. 2016; 8 (68): 1-9.

 Zheng, H., Xu, L., Zhang, Z. et al. Sci. China Phys. Mech. Astron. (2010) 53: 1799. Zhou W, Zhang C, Jiang H, Zhang Z, Xie L, He X. MiR-493 suppresses the proliferation and invasion of gastric cancer cells by targeting RhoC. Iran J Basic Med Sci. 2015;18(10):1027–1033

 Zini G. Diagnostics and Prognostication of Myelodysplastic Syndromes [published online ahead of print August 2016]. Annals of laboratory medicine.

 Williams DA. Rho GTPases in hematopoietic stem cell functions. Curr Opin Hematol. 2009;16(4):249-54.

8. APÊNDICES

Apêndice 1. Avaliação da atividade mitocondrial em células U937 cultivadas com 10% SBF e tratadas com Rhosin em dose única. Células U937 foram tratadas com Rhosin nas concentrações de 1μM, 3μM, 5μM, 10μM, 30μM e 50μM nos tempos de 24, 48, 72 e 96 horas sem reposição do fármaco. (A-B) Observamos diminuição gradativa da viabilidade em todas as doses no tempo de 24 horas e diminuição nas doses de 30μM e 50μM no tempo de 48 horas. (C-D) Nos tempos de 72 e 96 horas de tratamento não houve diminuição da viabilidade celular com o tratamento com Rhosin.

Apêndice 2. Avaliação da atividade mitocondrial em células U937 cultivadas com 10% de SBF e tratadas com Rhosin a cada 24 horas. Células U937 foram tratadas com Rhosin nas concentrações de 1μM, 3μM, 5μM, 10μM, 30μM e 50μM nos tempos de 24, 48, 72 e 96 horas com reposição do fármaco. (A-C) Observamos diminuição da viabilidade celular na dose de 50μM nos tempos de 24 e 72 horas. (B) Observamos diminuição gradativa na viabilidade celular a partir de 3μM no tempo de 48 horas. (D) No tempo de 96 horas observamos aumento da viabilidade em todas as doses, exceto na dose de 50μM em que houve significativa redução da viabilidade celular.

No documento Investigação da expressão de genes da família Rho GTPase em leucemia mieloide aguda e em síndromes mielodisplásicas e avaliação dos efeitos de um inibidor de Rho em células leucêmicas (páginas 91-108)