Tratamento do DNA com RNAse

Para remoção do RNA e purificação do DNA, aos tubos contendo DNA foram adicionados 48 µL de água milli-Q esterilizada, 1 µL de Tris-HCl 1 M pH 7,5 e 1 µL de RNAse (USB Corporation, Cleveland, OH USA) a 10 mg/mL e colocados em banho- maria a 37ºC por 1h. O DNA foi precipitado com a adição de 10 µL de acetato de sódio (NaOAc) 3M e 220 µL de etanol absoluto gelado. A suspensão foi homogeneizada, incubada por 10 minutos no gelo e centrifugada por 15 minutos a 14.000 rpm. Após desprezar o sobrenadante, foram adicionados 500 µL de etanol 80% para retirar o sal. O tubo de microcentrifugação foi centrifugado, novamente, por 15 minutos a 14.000 rpm, o etanol retirado e o precipitado seco durante 5 a 10 minutos em fluxo laminar. A dissolução

3.4.1.4. Quantificação do DNA

Alíquotas de 5 µL de DNA foram diluídas em 1 mL de água milli-Q. Em seguida, a absorbância foi medida em 260 nm de comprimento de onda em espectrofotômetro (GeneQuantpro Amersham Pharmacia Biotech AB, Cambridge, England). Segundo Sambrook et al. (1989), a absorbância igual a 1, contém uma concentração de 50 µg/mL de DNA dupla fita, 40 µg/mL de DNA fita simples e ~ 20 µg/mL de oligonucleotídeos fita simples. Também foi medida a absorbância (Densidade Óptica - DO) em 280 nm de comprimento de onda para verificar a presença de proteínas e calcular a pureza do DNA. A razão entre as leituras DO260/DO280 permite uma estimativa da pureza do DNA, que deve apresentar valores entre 1,8 e 2,0. A razão abaixo de 1,6 indica grande quantidade de contaminantes e proteínas, e na sua ocorrência, a extração foi realizada novamente.

3.4.1.5. Seleção dos oligonucleotideos para genotipagem por RAPD

Um total de 7 oligonucleotídeos foram selecionados para tipagem por RAPD de isolados de C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis caracterizando ainda a diversidade intraespecífica destas amostras. A seleção desses oligonucleotídeos foi baseada em revisões bibliográficas publicadas nos últimos anos, sendo os mesmos previamente utilizados para tipagem de C. parapsilosis, sendo eles: 1281 (5’ - AAC GCG CAA C - 3’), 1253 (5’ - GTT TCC GCC C - 3´), PAO3 (5´- AGT CAG CCA C- 3´), RSD12 (5´- GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG - 3’), M2 (5´-CTT GAT TGC C - 3`), RP4-2 (5´- CAC ATG CTT C - 3´), B14 (5´- GAT CAA GTC C -3´) (Dassanayake et al., 2000; Xu et al., 1999; Bauer et al., 1993; Lehmann et al., 1992; Wlliams et al., 1990).

Para que um oligonucleotídeo possa ser utilizado em estudos genotípicos por RAPD, ele deve ter alto poder discrminatório entre os isolados e gerar resultados reprodutíveis (Soll, 2000).

3.4.1.6. Cepas controle para a avaliação da performance dos oligonucleotídeos

Para a escolha do oligonucleotídeo a ser utilizado em nosso estudo, foram selecionadas 20 cepas fenotípicamente identificadas como C. parapsilosis, incluindo cepas de referência C. parapsilosis (ATCC 90018), C. orthopsilosis (ATCC 96141) e C. metapsilosis (ATCC 96143). As cepas utilizadas nesse experimento piloto foram oriundas de 8 áreas geográficas distintas, obtidas de um mesmo hospital, porém de pacientes diferentes (Tabela 1). As 20 cepas incluídas nesta análise foram compostas por 2 isolados clínicos de cada centro médico distinto, sendo estes constituídos de 14 amostras de hemocultura e 6 isolados de sítios superficiais.

3.4.1.7. Reações de RAPD

Para essas reações foram adicionados em tubos de microcentrifugação de 0,2 mL, as seguintes substâncias: 11,5 µL de água milli-Q esterilizada, 2,5 µL de buffer 10 X (Invitrogen), 5 µL de dNTP mix 1,25 mM (Amersham - Pharmacia Biotech); 3,5µL de MgCl2 (Invitrogen) 25 mM, 1 µL do oligonucleotídeo 50 pmol (BIO.SYNTHESIS ) 0,13 µL de Tween-20; 0,4 µL de Taq DNA polimerase (Invitrogen) e 1 µL de DNA diluído a 40 ng/µL, totalizando em um volume de 25 µL.

A amplificação foi realizada em um termociclador (Gene Amp PCR System 9600, Perkin Elmer Corporation, Norwalk, CT, USA) programado com ciclos de

3.4.1.8. Eletroforese em gel de agarose

O gel de agarose (Ultra Pure Agarose-Invitrogen) para a eletroforese foi usado na concentração de 1,2% em solução tampão TAE 1X (Tris acetato EDTA). Os produtos amplificados pelos PCRs foram diluídos em tampão orange G (10 µL da reação em 2 µL do tampão orange G) e 1 µl do marcador de peso molecular (100 base pair Ladder / Invitrogen), foi diluído em 9 µL de água milli-Q esterilizada e 2 µL do tampão Orange G. Foram adicionadas 12 µL da reação diluída a cada orifício do gel , que foi submetido a corrente elétrica de 100 volts por 30 minutos e em seguida a 55 volts por 5 horas e 30 minutos.

Após o término da eletroforese, o gel foi corado com solução de brometo de etídio (USB Corporation, Cleveland, OH USA) durante 20 minutos (400 mL de TAE 1X + 20 µL de brometo de etídio 10 mg/mL) e descorado em água destilada por 15 minutos.

Os padrões de bandas contidos nos géis tiveram sua imagem visualizada em um transiluminador de raios UV (UVP – BioDoc – it TM System), capturada e transferida para um disquete (no formato JPEG) para posterior análise em Software Analítico.

3.5. Avaliação da similaridade dos padrões de bandas

A análise dos resultados gerados pelo método do RAPD foi realizada por dendrograma utilizando o programa GEL COMPAR II versão 4.5 Bionumerics (Applied

Maths, Kortrijk, Bélgica) através de análise de agrupamento, de acordo com a similaridade dos padrões de bandas obtidos.

Os géis foram comparados entre si após o aporte de suas imagens pelo programa Gel Compar II. Este programa corrige distorções do gel, como padrões de sorriso, através da comparação com um padrão universal e seleciona automaticamente, as bandas presentes no gel. As imagens originais dos géis foram analisadas visualmente para desconsiderar os artefatos. O coeficiente de Dice (com tolerância de 2%) foi utilizado para esta análise porque leva em consideração a presença e ausência de bandas, bem como oferece maior peso para as bandas em comum entre as amostras analisadas para gerar a matriz de similaridade. Para construir o dendrograma, utilizou-se o método UPGMA (Unweighted Pair-Group Method Using Arithmetic Averages), que baseado na matriz de similaridade, fez o agrupamento par a par das amostras, gerando desta maneira uma árvore enraizada.

3.6. Seqüenciamento da região ITS

Todas as amostras identificadas pela técnica de RAPD como C. orthopsilosis e C. metapsilosis, como também aquelas cuja identificação foi inconclusiva, foram submetidas ao seqüenciamento da região ITS do rDNA.

Para o seqüênciamento, a região ITS foi amplificada por PCR utilizando os oligonucleotídeos: CparapITSout F (5' CCG TCG TGC TGG GGA TAG AG 3' e CparapITSout R (5' CAT CGC ACG GGA TTC TCA CC 3') construídos usando o programa DNA Star (Padovan, 2005).

Para essas reações de PCR foram adicionados em tubos de microcentrifugação de 0,2 mL, os seguintes componentes: 25µL de PCR Master Mix 2X

diluído a 40 ng/µL, 22 µL de água milli-Q esterilizada livre de nucleases (PROMEGA), totalizando um volume de 50µL.

As amplificações foram realizadas em um termociclador (Gene Amp PCR System 9600, Perkin Elmer Corporation, Norwalk, CT, USA) com os seguintes programas: ciclo inicial de 94°C por 5 minutos segu idos de 40 ciclos a 94°C - 1 minuto; 47°C - 1 minuto; 72°C - 2 minutos. No último ciclo, a temperatura de 72°C foi mantida por um período de extensão de 10 minutos e, em seguida, reduzida para 4°C, na qual as

ng dos fragmentos amplificados (aproximadamente 2 µl) foram colocados em uma reação padrão contendo 2 µl de “Big Dye TM Terminator versão 3.1 / Sequencing Standard Kit” – DNA polimerase AmpliTaq, tampão Tris-HCl pH 9,0, MgCl2, deoxinucleotídeos trifosfato (dATP,dCTP, dITP, dUTP) e dideoxinucleotídeos marcados com um doador e um aceptor de fluorescência, 1,6 pmol de oligonucleotídeo, 2 µl de tampão Save Money 2.5 X e água milli-Q para completar 10 µl. As condições de ciclagem foram: 25 ciclos de 96ºC por 10 segundos, 50ºC por 5 segundos e 60ºC por 4 minutos, em um termociclador Applied Biosystems GeneAmp PCR system 9700.

A fase de precipitação foi realizada à temperatura ambiente adicionando 8 µl de água milli-Q e 32 µl de etanol 100%. Durante 15 minutos, o precipitado foi protegido da luz e, em seguida, o material foi centrifugado durante 45 minutos a 2970 g, a placa foi então invertida e foi realizada centrifugação a 500 g por 30 segundos com a placa invertida; adicionou-se 150 µl de etanol 70% e centrifugou-se durante 45 minutos a 2970 g. O material foi secado por 1 minuto a 90ºC no termociclador. No momento do seqüenciamento, as amostras foram ressuspendidas em 10µl de formamida HI-DI, desnaturadas por 5 minutos a 90ºC e mantidas no gelo por 5 minutos.

A análise das seqüências em bancos genômicos foi feita através dos “sites” NCBI (National Center for Biotechnology Information - http://www.ncbi.nlm.nih.gov) utilizando o serviço “blast” (Basic Local Alignment Search Tool). Esta ferramenta caracteriza-se por programas de procura de similaridade que são designados para identificar e classificar os homólogos em potencial para uma determinada seqüência. Estes programas são capazes de analisar seqüências de DNA e aminoácidos.

Os critérios utilizados para certificação da qualidade do alinhamento e interpretação correta da identificação da espécie foram realizados de acordo com números de bases idênticas (porcentagem de identidade) com outras seqüências da região ITS armazenadas no banco genômico. O E-value que corresponde à probabilidade ao acaso da seqüência em questão ter se alinhado com outra seqüência, também foi analisado.

Neste caso, E-values menores que 10-5 _{refletem que este alinhamento não se deu ao} acaso, portanto, são de alta confiabilidade.

4.1. Seleção dos oligonucleotídeos para genotipagem de C. parapsilois, C. orthopsilosis e C. metapsilosis por RAPD.

A seleção de oligonucleotídeos teve como objetivo identificar ao menos dois oligonucleotídeos para serem utilizados na tipagem por RAPD de cepas de C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis. Neste sentido, utilizou-se como critério de seleção destes iniciadores as seguintes propriedades: (1) capacidade de amplificar o DNA de todas as amostras, (2) poder discriminatório para variações inter e intra-específicas, (3) produção de número de bandas suficientes para análise dos perfís genotípicos por dendrograma, (4) capacidade de agrupar isolados aparentemente relacionados, discriminando as diferenças entre isolados epidemiologicamente não relacionados.

Os oligonucleotídeos foram testados em 20 cepas fenotipicamente identificadas como C. parapsilosis oriundas de 8 áreas geográficas distintas, incluindo as cepas de referência (ATCC) de C. parapsilosis, C. metapsilosis e C. orthopsilosis (Tabela

1).

Todas as amplificações realizadas com os 7 oligonucleotídeos testados foram repetidas ao menos duas vezes. Em cada caso, a maior parte das bandas de alta intensidade foi reprodutível até mesmo quando era repetida a extração do DNA do mesmo isolado, sendo essas bandas utilizadas para identificação inter-específica. Entretanto, diferenças entre as bandas de menor intensidade, quando eram reprodutíveis, eram utilizadas para identificação intra-específica.

Sendo assim, dos 7 oligonucleotídeos testados, três deles (RP4-2, M2 e B14) apresentaram baixo poder discriminatório entre as espécies com formação de poucas bandas, que não eram consistentemente conservadas entre diferentes ensaios com os mesmos isolados (dados não ilustrados em figura).

Entretanto, 4 oligonucleotídeos apresentaram bons resultados com relação à identificação das espécies. Os géis de RAPD obtidos a partir destes últimos estão representados nas figuras 1A, 1B e 2A, 2B.

O oligonucleotídeo 1281 (Figura 1A) foi capaz de amplificar todas as 20 amostras, diferenciando as três cepas de referência de C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis. Este oligonucleotídeo produziu de 17 a 20 bandas que variaram entre 250 e 2.000 pb. Em relação à posição e presença de bandas, as de maior peso molecular foram conservadas e de maior densidade, o que possibilitou a identificação de espécie entre as amostras testadas. A maior parte das bandas de menor densidade foi da mesma forma reprodutível e algumas vezes variável quanto a sua posição o que permitiu a discriminação entre as cepas da mesma espécie. O oligonucleotídeo 1281 foi capaz de identificar entre as amostras avaliadas, uma cepa de C. orthopsilosis (4A) que apresentou um padrão de bandas similar ao da cepa referência desta espécie (II). As demais amostras clínicas foram identificadas visualmente como C. parapsilosis apresentando diversidade genotípica entre seus representantes. Quando a análise foi realizada através do dendrograma (Figura 2A), os isolados identificados visualmente como C. parapsilosis foram agrupados com um coeficiente de similaridade de 86%, sendo incluída nesse grupo a cepa de referência C. parapsilosis ATCC. A capacidade de agrupar amostras relacionadas foi observada nos isolados de C. parapsilosis 2A e 2B sendo o maior coeficiente de similaridade (98%) observado entre este par de isolados. Este oligonucleotídeo foi capaz de gerar 20 genótipos diferentes entre as amostras desta espécie. Este grupo de C. parapsilosis apresentou similaridades menores em relação às cepas de referência de C. metapsilosis (81%) e C. orthopsilosis (74,5%). A amostra 4A foi identificada como C. orthopsilosis por esta análise agrupando-se com a cepa de referência de C. orthopsilosis (ATCC).

A análise visual do gel de RAPD com o oligonucleotídeo 1253 (Figura

1B) revelou que este oligonucleotídeo foi capaz de identificar as 3 espécies, sendo que

oligonucleotídeo foi de 5-17 bandas com 150 a 2.000pb. As amostras amplificadas revelaram ainda um padrão de bandas único para cada isolado, resultando em 19 genótipos diferentes Entretanto, não foi capaz de amplificar uma das amostras (9B), apesar de várias tentativas de repetição da reação e extração de DNA. A amostra 4A também gerou um padrão de bandas semelhante a C. orthopsilosis ATCC (II) sugerindo pertencer a esta espécie. Entretanto, o RAPD com este oligonucleotídeo não mostrou consistência nas bandas de baixa intensidade, o que dificulta a análise intra-específica. A análise do dendrograma executado a partir do perfil de bandas amplificadas por este oligonucleotídeo (Figura 2B) revelou a presença de um agrupamento de isolados de C. parapsilosis, incluindo a cepa de referência, com uma similaridade de 65%. Este grupo

Como o oligonucleotídeo 1253 não amplificou a amostra 9B apresentando limitações na consistência das bandas de baixa intensidade, mas apresentou bom poder discriminatório entre as três espécies, ele foi utilizado em nosso estudo quando a identificação de espécies, após amplificação com o oligonucleotídeo 1281, gerava dúvida.

4.2 Seleção das amostras deste estudo

As amostras tiveram sua identificação fenotípica confirmada por testes micromorfologicos. Todas os isolados apresentaram crescimento satisfatório, com colônias que variavam de branco a rosa, sem presença de sinais de contaminação, cor esta, sugestiva de C. parapsilosis, segundo o fabricante. Após essa triagem inicial, foi analisado o perfil bioquímico destas cepas pelo método de identificação semi-automatizado ID32 C (bioMérieux, Marcy-I’Étoile, França) geraram os códigos 5547350717 e 5546350717 identificando os isolados como C. parapsilosis. Foi realizada a análise de microcultivo, em que foi observado a presença de pseudohifas curvas e blastoconídeos, características estas compatíveis com a espécie.

Ao final da seleção das amostras, alcançamos um universo de 166 leveduras escolhidas para serem submetidas aos testes moleculares para identificação das espécies de C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis e avaliação da diversidade genotípica das cepas de C. parapsilosis (Anexo 2).

As 166 cepas oriundas de infecções sistêmicas selecionadas para o estudo foram isoladas do primeiro episódio de candidemia de pacientes diferentes. As amostras eram provenientes de dezesseis centros médicos distintos, sendo os estados do Rio de Janeiro e São Paulo representados por dois hospitais cada um, totalizando oito estados brasileiros e 3 países da América do Sul (Figura 3).

4.3 Identificação de C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis pela técnica de RAPD.

Todas as 166 amostras selecionadas tiveram seu DNA extraído e amplificado por RAPD inicialmente com o emprego do oligonucleotídeo 1281 e, em caso de dúvida quanto à identificação, essas amostras foram amplificadas pelo oligonucleotídeo 1253.

Os padrões de bandas dessas amostras, obtidos com eletroforese dos fragmentos de DNA em gel de agarose, foram comparados visualmente aos padrões obtidos com cepas referência das três espécies em questão. A Figura 4 mostra o perfil genotípico obtido para alguns isolados pelos oligonucleotídeo 1281 e 1253 onde foi possível discriminar as 3 espécies. C. orthopsilosis foi a espécie que apresentou maior heterogeneidade genotípica.

Apenas 11 cepas não tiveram sua identificação conclusiva como C. parapsilosis, C. orthopsilosis ou C. metapsilosis pelos dois oligonucleotídeos testados e, portanto, foram submetidas à técnica de seqüenciamento da região ITS.

Todas as amostras identificadas como C. orthopsilosis e C. metapsilosis neste estudo foram submetidas ao seqüenciamento da região ITS para comprovação da identificação da espécie.

4.4 Prevalência de C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis

127 e 729) geraram resultados inconclusivos quanto à identificação de espécie. Estas cepas foram submetidas a seqüenciamento da região ITS sendo obtidos os seguintes resultados: 4 delas ( 87, 91, 100 e 101) foram identificadas como C. orthopsilosis, uma (729) foi identificada com C. metapsilosis e as 6 demais como C. parapsilosis. A porcentagem de identidade dessas seqüências com aquelas armazenadas em banco genômico foi de 93-100%, com e-value menor que 10-5 (Tabela 2).

As cepas identificadas com sucesso pelo método de RAPD totalizaram 155 amostras, sendo 142 C. parapsilosis, 9 C. orthopsilosis e 4 C. metapsilosis. As cepas identificadas como C. orthopsilosis e C. metapsilosis pelo RAPD foram da mesma forma submetidas à técnica de seqüenciamento para confirmar a identificação da espécie, onde houve confirmação dos resultados do RAPD em todas elas (Tabela 2).

Ao final, entre as 166 cepas identificadas fenotipicamente como C. parapsilosis, fomos capazes de identificar 148 (89%) C. parapsilosis, 13 (8%) C. orthopsilosis, e 5 (3%) C. metapsilosis (Figura 5). Deste universo, a técnica de RAPD foi capaz de identificar 69% (9/13) das cepas de C. orthopsilosis, 80% (4/5) das amostras de C. metapsilosis e 96% (142 /148) das amostras de C. parapsilosis.

4.5 Diversidade genotípica entre todos os isolados analisados

O dendrograma da Figura 6 ilustra o poder discriminatório do RAPD utilizando-se o oligonucleotídeo 1281 na tipagem molecular das 155 amostras possíveis de serem analisadas por este método (Anexo 3). Nesta análise, foi possível discriminar 110 genótipos distintos agrupando-os com um coeficiente de similaridade de 67,5%. Foi observada clara aglutinação das espécies de C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis.

Houve variações no coeficiente de similaridade para os grupamentos de cada espécie. As cepas de C. orthopsilosis foram divididas em 2 subgrupos distintos, sendo que o subgrupo A apresentou Sab de 71% e o subgrupo B Sab de 85% entre seus isolados. Esta divisão se deu provavelmente devido a maior heterogeneidade genotípica da espécie. As amostras de C. metapsilosis agrupadas no dendrograma tiveram índice de similaridade de 78% entre seus isolados e uma similaridade mais baixa (72%) com as cepas de C. parapsilosis. A similaridade de C. parapsilosis com os subgrupos A e B de C. orthopsilosis também foi baixa, com 67,5% e 77%, respectivamente. O maior grau de similaridade genética foi encontrado entre os isolados de C. parapsilosis, que apesar de estarem em maior número, foi o grupo mais conservado geneticamente com Sab de 80%

(Figura 6).

Dentro dos isolados de C. parapsilosis verificou-se agrupamentos que não parecem ocorrer de forma randômica, com formação de subgrupos que apresentavam maior similaridade entre os isolados oriundos de mesma área geográfica ou de centros médicos. Observamos a formação de 6 principais subgrupos de similaridade maior que 90%.

O subgrupo com maior consistência foi o subgrupo 4 que foi formado por 100% (8/8) das amostras da Argentina e 90% (9/10) dos isolados do Chile. Se essa distribuição fosse randômica, a chance desses isolados estarem neste subgrupo seria de 14%. Esse fato reforça a consistência dessa análise gerada por este método.

Dos 43 isolados de C. parapsilosis da cidade de São Paulo, oriundos de dois hospitais (HSP e HSPE), apenas os isolados do HSP tiveram seus isolados distribuídos principalmente em dois subgrupos: subgrupo 1 e 5. Os isolados do HSP tiveram 54% de suas 22 amostras distribuídas nestes grupos. No subgrupo 5, foi detectado um provável surto no HSP devido a similaridade de 100% apresentada em 3 das 8 cepas deste hospital, sendo duas delas isoladas no mês de março de 2003 e uma terceira no mês de junho de 2004. O HSPE revelou uma distribuição mais heterogênea sem representabilidade significativa na formação dos subgrupos, o que pode ser explicado

pelo fato deste centro médico receber frequentemente pacientes provenientes de diversas cidades do estado de São Paulo.

Dos 24 isolados da cidade de Ribeirão Preto, 37,5% deles foram selecionados no subgrupo 2 e 21% no subgrupo 3. No subgrupo 2, estes isolados foram agrupados com as amostras da cidade de Campinas resultando na concentração de cepas do interior de São Paulo nesse subgrupo. Cinco destes isolados da cidade de Ribeirão Preto apresentaram 100% de similaridade entre si, sugerindo um surto nesta cidade, e consequentemente neste hospital, que poderia ser a mesma cepa encontrada em 2 pacientes do mesmo centro médico de Campinas, já que a as datas das hemoculturas foram realizadas entre abril de 2003 e novembro de 2004 .

Cinqüenta por cento das amostras de São José Rio Preto (SJRP), 37,5% das amostras Vitória juntamente com 44% das amostras da cidade do Rio de Janeiro, (representadas por dois centros médicos: H. Lagoa e UFRJ) foram agrupadas no

subgrupo 3 com Sab de 95,5%. As amostras de Lima (Peru) ficaram com 2 das suas 3

amostras isoladas em um único ramo, caracterizando o subgrupo 6 , cujo o Sab foi de 97%.

Os demais centros analisados tiveram os seus isolados distribuídos em diversos subgrupos, não apresentando similaridade significativa entre eles.

4.5.1 Diversidade genotípica dos isolados sistêmicos de C. parapsilosis provenientes do Estado de São Paulo

Quando amostras sistêmicas da espécie de C. parapsilosis do estado de São Paulo foram analisadas separadamente, o coeficiente de similaridade entre as

amostras de C. parapsilosis aumentou de 80 para 82% reforçando serem estas cepas mais próximas geneticamente (Figura 7).

A análise apenas de cepas referentes ao estado de São Paulo deixou mais evidente a capacidade do método de aglutinar cepas oriundas de pacientes epidemiologicamente relacionados. Nesta análise observa-se 8 subgrupos com similaridade superior a 90% entre os seus representantes.

Das 10 amostras da cidade de Campinas, 60% foram incluídas no

subgrupo 1 e 20% no subgrupo 5. A cidade de Ribeirão Preto, representada por 23 amostras, tiveram 73% dos seus isolados distribuídos nos subgrupos 2, 4 e 5, sendo 17% dos isolados no subgrupo 2, 13% no subgrupo 4 e 43% localizados no subgrupo 5. Alguns isolados de Ribeirão Preto apresentaram similaridade de 100% nos subgrupos 2 e

5 sugerindo a ocorrência de surtos neste hospital devido a datas próximos de isolamento

dessas cepas ocorridas entre março e julho de 2004. As outras amostras desta cidade não agruparam significativamente de acordo com a sua localização geográfica.