CARACTERIZAÇÃO DA DIVERSIDADE GENOTÍPICA DE
CEPAS DE C
andida parapsilosis
ISOLADAS DE
HEMOCULTURAS
CARACTERIZAÇÃO DA DIVERSIDADE GENOTÍPICA DE
CEPAS DE C
andida parapsilosis
ISOLADAS DE
HEMOCULTURAS
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do Título de Doutor em Ciências.
Orientador: Prof. Arnaldo Lopes Colombo
Co-orientadora: Dra. Analy Salles de Azevedo Melo
São Paulo
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE MEDICINA
Chefe do Departamento: Profa. Dra. Emília Inoue Sato
Coordenador do Curso de Pós-Graduação: Prof. Dr. Ricardo Sobhie Diaz
CARACTERIZAÇÃO DA DIVERSIDADE GENOTÍPICA DE
CEPAS DE C
andida parapsilosis
ISOLADAS DE
HEMOCULTURAS
Presidente da banca:
Prof. Arnaldo Lopes Colombo
________________________________________________________________________
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Carlos Taborda
Profa. Dra. Maria Luiza Moretti
Profa. Dra. Olga Fischman Gompertz
Prof. Antonio Carlos Campos Pignatari
______________________________________________________________________
SUPLENTES
Dr. Guilherme Maranhão Chaves
Prof. Dr. Zoilo Pires de Camargo
Dedicatória
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Venceram porque se negaram a serem
Sumário
Dedicatória ... v
Agradecimentos especiais... vi
Agradecimentos... vii
Lista de figuras ... xiv
Lista de tabelas ... xv
Lista de abreviaturas e símbolos ... xvi
Resumo ... xviii
1.0. INTRODUÇÃO ... 01
1.1. Importância de Candida parapsilosis como agente de fungemia ... 02
1.2. História natural da fungemia por C. parapsilosis ... 05
1.3. Variabilidade genotípica entre isolados de C. parapsilosis ...... 11
1.4. Prevalência de C. orthopsilosis e C. metapsilosis ... 16
2.0. OBJETIVOS ... 20
3.0. MATERIAL E MÉTODOS ... 22
3.1. Seleção das amostras... 23
3.1.1. Seleção das amostras deste estudo ... 23
3.2. Verificação de viabilidade e pureza das leveduras armazenadas no LEMI ... 24
3.3. Identificação fenotípica ... 24
– bioMérrieux) ... 25
3.4. Tipagem molecular ... 26
3.4.1.Técnica do RAPD ... 26
47
6.0. FIGURAS ... 50
7.0. DISCUSSÃO ... 61
8.0. CONCLUSÕES... 77
9.0. ANEXOS ... 79
10.0 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 95
Abstract
Bibliografias Consultadas
Lista de figuras
Figura 1. Géis de agarose ilustrando os resultados de tipagem molecular por RAPD com os oligonucleotídeos: 1281 (A), 1253 (B), PA03 (C) e RSD12 (D)...
51
Figura 2. Dendrogramas obtidos através dos perfis de bandas gerados pela amplificação dos oligonucleotídeos 1281 (A); 1253 (B); PA03 (C) e RSD12 (D)...
53
Figura 3. Distribuição geográfica de acordo com os centros médicos, das leveduras obtidas a partir de hemocultura, identificadas fenotipicamente como C. parapsilosis
55
Figura 4. Géis de DNAs amplificados pela técnica de RAPD com os oligonucleotídeos 1281 (A) e 1253 (B) em algumas cepas do estudo utilizadas como amostras piloto
56
Figura 5. Distribuição dos isolados de C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C.
metapsilosis entre as 166 amostras estudadas por técnicas de RAPD e/ou
seqüenciamento da região ITS
57
Figura 6. Dendrograma de isolados sistêmicos avaliados neste estudo baseado em amplificação pelo RAPD usando o oligonucleotídeo 1281...
58
Figura 7. Dendrograma dos isolados de C. parapsilosis do estado de São Paulo
avaliados neste estudo, baseado em amplificação pelo RAPD usando o oligonucleotídeo 1281...
59
Figura 8. Dendrograma dos isolados sistêmicos de C. parapsilosis da cidade de
São Paulo avaliados neste estudo, baseado em amplificação pelo RAPD usando o oligonucleotídeo 1281...
Lista de tabelas
Tabela 1: Isolados sistêmicos de C. parapsilosis que foram submetidos à
tipagem por RAPD por diferentes oligonucleotídeos ...
48
Tabela 2. Comparação das seqüências ITS deste estudo com aquelas depositadas no GeneBank ...
Lista de abreviaturas e símbolo
A: Adenina
0C: Graus
Celsius.
C.: Candida
C: Citosina
CDC: Centers for Diseases Control and Prevention
DIPA: Doenças Infecciosas e Parasitárias.
DNA: Ácido desoxirribonucléico.
dATP: Desoxiadenosina trifosfato dCTP: Desoxicitosina trifosfato dGTP: Desoxiguanosina trifosfato dITP: Desoxinositol trifosfato dTTP: Desoxitimidina trifosfato dUTP: Desoxiuracila trifosfato dNTP: Desoxinucleosídeo
EDTA: Ácido etilenodiaminotetracético
et al: Colaboradores.
EUA: Estados Unidos da América G: Guanina
g: Gramas
g/L: Gramas por litro. h: Horas.
HCl: Ácido clorídrico IC: Intervalo de confiança L: Litro
LEMI: Laboratório Especial de Micologia. M: Molar.
Mol: Moléculas
mM: Milimolar
g/mL: Micrograma por mililitro. MgCl2: Cloreto de magnésio
mg: Miligrama.
mg/L: Miligrama por litro mg/mL: Miligrama por mililitro
L: Microlitro mL: Mililitro. no: Número.
NaCl: Cloreto de sódio NaOH: Hidróxido de sódio ng: Nanograma
ng/ L: Nanograma por microlitro nm : Nanômetro
nmol: Nanomol
NY: New York
OR: Odds ration
P: P valor
pb: Pares de base
pH: Potencial hidrogeniônico pmol: Picomol
q.s.p: Quantidade suficiente para : Marca registrada.
T: Timina
TM:
Trade mark
UFC: Unidades formadores de colônias. UNIFESP: Universidade Federal de São Paulo.
UV: Ultra violeta Volts: Voltagem
X: Vezes %: Por cento >: Maior <: Menor =: Igual a
Amorim, Clédja Soares de
Caracterização da diversidade genotípica de cepas de Candida parapsilosis isoladas de hemoculturas. / Clédja Soares de Amorim – São
Paulo, 2007.
xix,107f.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Infectologia.
Título em inglês: Characterization of genotypic diversity of Candida
parapsilosis strains isolates from hemocultures.
1. Candida parapsilosis. 2. Candida orthopsilosis. 3. Candida metapsilosis . 4.
Diversidade genotípíca. 5. Epidemiologia.
RESUMO
Introdução: A heterogeneidade genética de Candida parapsilosis tem sido reportada com
emprego de distintos métodos moleculares, identificando claramente três grupos (grupos I, II e III). Recentemente, a análise filogenética baseada no polimorfismo de alguns genes propôs uma reclassificação de C. parapsilosis grupo II e III em espécies distintas: Candida
orthopsilosis e Candida metapsilosis, respectivamente. Ainda há poucos estudos
epidemiológicos avaliando a prevalência e relevância clínica dessas espécies. Métodos moleculares têm sido empregados para discriminar esses três grupos e também para tipagem intra-específica dessas novas espécies. Entretanto, isolados de C. parapsilosis
não têm demonstrado grande diversidade genotípica por estes métodos. É necessário o desenvolvimento de técnicas moleculares de baixo custo para viabilizar a identificação dessas espécies em laboratório de rotina. Objetivos: 1) selecionar oligonucleotídeos para utilização em RAPD que apresentem poder discriminatório para identificação de C.
parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis. 2) avaliar a prevalência dessas três
espécies em amostras de hemoculturas coletadas em hospitais da América Latina. 3) analisar a diversidade genotípica entre isolados de C. parapsilosis oriundos de diferentes
áreas geográficas. Material e métodos: Para este estudo, foram selecionadas todas as amostras de hemoculturas identificadas fenotipicamente como C. parapsilosis,
catalogadas no Banco de Microrganismos do Laboratório Especial de Micologia da UNIFESP, que foram coletadas durante o período de 2003 a 2005, incluindo as cepas de referência destas três espécies. Após identificação fenotípica, através do sistema de ID32C e microcultivo, as colônias sugestivas de C. parapsilosis foram submetidas ao
método RAPD para identificação de espécie. Para interpretação dos resultados, os perfis genotípicos gerados pelo RAPD foram submetidos à análise por dendrograma utilizando o programa GEL COMPAR II versão 4.5. Todas as amostras identificadas como C.
orthopsilosis e C. metapsilosis neste estudo foram submetidas ao seqüenciamento da
escolhido para realização neste estudo. Do total das 166 amostras estudadas, 148 (89%) eram C. parapsilosis, 13 (8%) C. orthopsilosis e 5 (3%) foram identificadas como C.
metapsilosis. A análise por dendrograma revelou que as cepas de C. orthopsilosis
apresentaram maior heterogeneidade genotípica entre si. Cepas de C. parapsilosis foram
geneticamente mais semelhantes entre si (Sab 80%) e formaram 6 subgrupos com uma similaridade superior a 90%. Estes subgrupos eram constituídos, em sua maioria, por cepas de mesma localidade geográfica demonstrando serem mais relacionadas entre si. As análises dos isolados oriundos do estado e da cidade de São Paulo demonstraram uma maior consistência do método, mostrando maior similaridade genética entre cepas de cidades vizinhas e de mesmo centro médico, revelando disseminação de cepas de mesma origem clonal que sofreram microevoluções nestes centros médicos. Conclusões: O RAPD, com o emprego do iniciador 1281 demonstrou ser uma ferramenta de grande utilidade na identificação das espécies do complexo C. parapsilosis. C. parapsilosis foi a
espécie de maior prevalência entre as amostras de hemocultura estudadas, seguida de C.
orthopsilosis e C. metapsilosis. Quanto à análise genotípica intra-específica, C.
orthopsilosis foi a espécie mais heterogênea do grupo. C. parapsilosis foi a espécie mais
1.1. Importância de Candida parapsilosis como agente de fungemia
A Candida parapsilosis é uma espécie emergente, oportunista,
representando importante patógeno nosocomial de infecções superficiais e sistêmicas. Foi considerada como levedura não-patogênica até 1940, quando foi relatado um caso fatal de endocardite por C. parapsilosis em paciente usuário de drogas. Embora menos comum
que a C. albicans, C. parapsilosis pode causar vaginite, peritonite, candidíase oral,
infecção do trato urinário, artrite séptica, endocardite e candidíase hematogênica (Krcmery
et al., 2002; Levy et al., 1998; Weems et al., 1992). Infecções sistêmicas têm sido
relacionadas à contaminação de soluções de nutrição parenteral (devido à capacidade de proliferar em soluções contendo glicose), dispositivo de monitoramento de pressão intravascular, cateteres vasculares (devido à aderência em materiais sintéticos e formação de biofilmes) e uso de drogas ilícitas por via intravenosa (Bonassoli et al., 2005; Levin et al., 1998; Branchini et al., 1994; Weems, 1992; Weems et al., 1987).
Atualmente, o gênero Candida responde por cerca 80% das infecções
fúngicas no ambiente hospitalar e é a quarta causa de infecções sangüíneas adquiridas em hospitais americanos, respondendo por cerca de 10% de todas as infecções deste sítio (Wispilinghoff et al., 2004; Gudlaugsson et al., 2003; CDC, 2000; Edmond et al., 1999;
Pfaller et al., 1998a). A infecção da corrente sangüínea (ICS) pelo gênero Candida
destaca-se não apenas por sua prevalência em diferentes centros médicos, como também por suas complicações, correlacionando-se à mortalidade atribuída da ordem de 50% (Colombo e Guimarães 2003; Gudlaugsson et al., 2003).
A incidência de candidemia entre pacientes hospitalizados aumentou durante os anos 1980s (Beck-Sague e Jarvis 1993). Mas recentemente, Morgan et al.
aumento de infecções da corrente sangüínea por espécies de Candida não-albicans tem
sido relatado em diferentes séries de fungemias publicadas (Colombo et al., 2006;
Almirante et al., 2005; Hajjeh et al., 2004; Colombo et al., 2003).
C. parapsilosis é uma das espécies não-albicans mais freqüentes que
causam candidemia em pacientes hospitalizados respondendo por 10-25% dos episódios de candidemia no mundo, particularmente em neonatos (Almirante et al., 2005; Roilides et al., 2004; Pappas et al., 2003; Lopez-Sastre et al., 2003; Asmundsdottir et al., 2002).
Existem variações na proporção de C. parapsilosis como causa de candidemia em
diferentes séries.
Nos EUA, candidemia responde por 8 a 15% das infecções nosocomiais (Wisplinghoof et al., 2004; Edmond et al., 1999). Hajjeh et al. (2004)
conduziram um estudo prospectivo de vigilância de ICS envolvendo dois centros médicos das cidades de Beltimore e Connecticut. No período de outubro de 1998 a setembro de 2000 foram documentados 1.143 episódios de candidemia. C. parapsilosis foi responsável
por 13% desses casos, sendo o terceiro agente causador de ICS por este gênero. Em outro estudo americano realizado em 34 centros médicos, C. parapsilosis foi considerada
a terceira espécie mais comum em pacientes maiores que 12 anos (12%) e a segunda em pacientes mais jovens (34%) (Pappas et al., 2003).
Na Europa, um estudo prospectivo conduzido pela European Confederation of Medical Mycology (ECMM), que envolveu 106 hospitais oriundos de sete países europeus, documentou 2.089 episódios de infecções por Candida spp na corrente
sangüínea no período de setembro de 1997 a dezembro de 1999. C. parapsilosis foi
responsável por 13% do total das candidemias, sendo a terceira espécie mais isolada, superada apenas por C. albicans (56,4%) e C. glabrata (13,6%) (Tortorano et al., 2004).
Na América do Sul, este patógeno é considerado o principal representante das espécies não-albicans em episódios de fungemia (Medrano et al., 2006;
Brito et al., 2006; Godoy et al., 2003; Pfaller et al., 1998a; Colombo et al., 1999). Em
casuística reunida por Pfaller et al. (1998a) neste continente, observou-se que C. albicans
(40,5%), C. parapsilosis (38,1%) e C. tropicalis (11,9%) foram as espécies mais
prevalentes em candidemias.
Na Argentina, um estudo sobre a etiologia das fungemias realizado por Giusiano et al. (2006) revelou que C. albicans (40,8%) foi o agente mais isolado seguido
por C. parapsilosis (26,6%) e C. tropicalis (15%).
No Brasil, um dos primeiros estudos epidemiológicos realizados em centros médicos brasileiros foi realizado por Colombo et al. (1999), que através de um
estudo prospectivo conduzido em 6 hospitais terciários nas cidades de São Paulo e do Rio de Janeiro, identificou 145 episódios de candidemia. Nesta casuística, C. parapsilosis foi
responsável por 25% desses casos. Dois outros estudos brasileiros reportaram resultados similares (Pasqualotto et al., 2005; Costa et al., 2000).
Recentemente, Colombo et al. (2006) conduziram estudo multicêntrico
prospectivo sobre candidemia no Brasil realizado entre março de 2003 e dezembro de 2004, que incluiu 11 centros médicos localizados em 9 grandes cidades brasileiras. Este estudo revelou a ocorrência de 712 casos de candidemia, em que C. parapsilosis
apareceu em 3° lugar respondendo por 20,5% dos caso s.
A razão dessa variação encontrada entre os estudos de incidência de candidemia por C. parapsilosis não está clara, mas pode estar relacionada à proporção de
neonatos de cada estudo, bem como influências regionais, diferenças climáticas, culturais e de práticas médicas, desde que candidemia por C. parapsilosis pode ser adquirida a
partir de fontes exógenas (Colombo et al., 2003; Weems et al., 1992).
1.2. História natural da fungemia por C. parapsilosis
Em relação à história natural das candidemias, acredita-se que em sua maioria, essas infecções sejam adquiridas por via endógena, pela translocação do patógeno através do trato gastrointestinal, local onde há rica colonização por Candida spp
em até 70% da população normal (Nucci et al., 2001; Cole et al., 1996).
Apesar da relevância da aquisição endógena de Candida spp, vários
estudos têm demonstrado a ocorrência de candidemia a partir de fontes exógenas, podendo estar relacionadas a surtos de infecção hospitalar (Levin et al., 1998; Weems et al.,1992). Infecções sistêmicas por C. parapsilosis têm sido relacionadas à utilização de
fluidos ou biomateriais contaminados por este agente, pela contaminação de procedimentos invasivos a partir da microbiota da pele do paciente ou transmissão pelas mãos de profissionais da área da saúde (Brito et al., 2006; Zancopé-Oliveira, 2000; Pfaller,
1996; Wenzel et al., 1995). Estes fatores podem ocasionalmente estar relacionados a
surtos (Bonassoli et al., 2005; Clark et al, 2004; Krcmery e Barnes 2002; Huang et al.,
1999; Levin et al., 1998; Branchini et al., 1994; Weems, 1992; Weems et al., 1987).
Brito et al. (2006) conduziram um estudo observacional comparativo
entre os episódios de candidemia por C. parapsilosis e C. albicans em 4 hospitais da
cidade de São Paulo, levando em consideração as condições de riscos associadas a fungemia por estas espécies de leveduras. Foram registrados 282 casos de candidemia entre março de 2002 e fevereiro de 2003, em que 107 (38%) foram causadas por C.
albicans e 64 (23%) causados por C.parapsilosis. Através de análise multivariada, a única
variável associada com a candidemia por C. parapsilosis foi a presença de cateter venoso
central (CVC) implantados cirurgicamente (P= 0, 64; OR 3,71; IC 95% 1,28-10,70),
Weems et al. (1992) conduziram estudo em hospital pediátrico em
Washington para avaliar a relação da fungemia por C. parapsilosis com nutrição parenteral
e contaminação de cateteres vasculares. No período de setembro de 1983 a maio de 1985 foram documentados 205 casos de candidemia, sendo 32 (16%) em pacientes com C.
parapsilosis. De 23 pacientes com cultura positiva de cateter venoso central para Candida
spp, 12 (51%) tinham cultura positiva para C. parapsilosis e 7 (30%) destes pacientes
estavam recebendo nutrição parenteral. O tempo médio de exposição do cateter venoso central para infecção por C. parapsilosis foi de 23,6 dias.
Uma das justificativas da alta freqüência de C. parapsilosis em
materiais plásticos é sua capacidade de aderir-se a este tipo de material através da formação de biofilme. Branchini et al. (1994) demonstraram através de experiência in vitro
que a maioria dos isolados de C. parapsilosis de sangue e cateter venoso central tem a
capacidade de produzir grande quantidade de biofilme em soluções contendo glicose, podendo causar infecção em indivíduos que recebem hiperalimentação intravenosa. Neste trabalho, não houve correlação da produção de biofilme e o tipo de genótipo encontrado em isolados de C. parapsilosis.
Estudo realizado por Sanchez et al. (1993) no Hospital Harper
(Michigan, EUA) relatou a transmissão de C. parapsilosis através das mãos de
profissionais deste hospital. Para identificar os aspectos epidemiológicos das infecções nosocomiais por esta espécie, os autores realizaram culturas de material proveniente de diferentes sítios dos pacientes admitidos na unidade de transplante de medula óssea e na unidade de terapia intensiva (UTI), como também de superfícies inanimadas e mãos dos profissionais da área da saúde. Com a utilização de métodos genotípicos, foram identificados três padrões distintos geneticamente em 32 cepas de C. parapsilosis
Baseado em um estudo caso-controle, Levin et al. (1998) avaliaram 6
casos de fungemia por C. parapsilosis entre pacientes internados em unidades
hematológica, oncológica e unidade de transplantados de medula óssea ocorridos entre janeiro e março de 1994. Entre as variáveis epidemiológicas avaliadas, somente o uso de cateter venoso implantável e semi-implantável de longa duração foi significantivamente associada ao maior risco de ocorrência de candidemia por este agente (P=0,016). Estes
cateteres tinham sido inseridos em seis pacientes localizados em três unidades diferentes. Nesta casuística foram colhidas 60 amostras de culturas de mãos de 26 profissionais que manusearam os pacientes. Verificou-se que três delas foram positivas para C.
parapsilosis. A cariotipagem eletroforética mostrou que os perfis genotípicos de duas
cepas isoladas das mãos de profissionais da área da saúde foram iguais as 5 das 6 amostras isoladas dos pacientes envolvidos no estudo, confirmando a possibilidade de surto de aquisição exógena deste patógeno.
Zancope-Oliveira et al. (2000) investigaram 8 casos de candidemia por
C. parapsilosis ocorridos em pacientes internados na UTI de um centro médico localizado
na cidade do Rio de Janeiro. Amostras de nutrição parenteral prolongada (NPP) prescritas a estes pacientes foram da mesma forma cultivadas. Este trabalho revelou através dos métodos de RAPD (Amplificação Randômica de DNA Polimórfico) e cariotipagem eletroforética, padrões de bandas idênticos entre as cepas de 3 pacientes e uma proveniente da NPP, sugerindo fortemente ser a NPP a fonte de contaminação da candidemia.
Clark et al. (2004), em um estudo de caso-controle, estudaram uma
coleção de cepas de C. parapsilosis obtidas de hemocultura e de cultura de ponta de CVC
provenientes de pacientes adultos internados em diferentes unidades médicas de um hospital americano durante 1999 a 2001. Nesta casuística, houve um aumento em 7 vezes nas taxas de ICS por C. parapsilosis relacionadas ao uso de CVC notificada nos 6
nutrição parenteral total (OR 9,2; IC 95%, 0,9 a 98,1) os fatores mais relevantes na aquisição da candidemia. Neste estudo, através de técnica de genotipagem utilizando RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphic) e hibridização com a sonda Cp3-13 (específica para C. parapsilosis), foi possível identificar 22 casos envolvidos no surto de
candidemia, sendo 15 confirmados e 7 considerados prováveis. Os resultados confirmaram a participação de cepas isoladas de profissionais da área da saúde como fonte de contaminação desses pacientes através do manuseio do CVC.
Barchiesi et al. (2004) reportaram um surto comprovado pelo perfil
genotípico idêntico de isolados de C. parapsilosis recuperados de 6 pacientes de unidade
oncológica pediátrica de um hospital universitário da Itália. Nesse estudo foram isoladas cepas do meio ambiente, mãos e unhas de profissionais de saúde. Através da cariotipagem eletroforética, foi verificada a presença de um único padrão genotípico de C.
parapsilosis em quatro pacientes, sendo o mesmo identificado nos isolados das mãos de
profissionais da área da saúde, confirmando ser esta a principal rota de transmissão desse surto.
Apesar desse agente constituir importante causa de infecção da corrente sangüínea, há dados sugerindo que fungemia por C. parapsilosis relaciona-se a
baixa mortalidade.
Pappas et al. (2003) registraram em seu estudo que pacientes adultos
com candidemia por C. parapsilosis tinham menores índices de mortalidade (24% vs 46%; P< 0,001) e menores índices de mortalidade atribuída (2% vs 12%; P<0,001) do que por
outras espécies de Candida. A mesma tendência foi encontrada na população infantil
desse mesmo estudo, com baixos valores de mortalidade (15% vs 28%; P=0,08) e
mortalidade atribuída (4% vs 12%; P=0,219) do que C. albicans e C. glabrata.
O sucesso na virulência de C. albicans deve-se principalmente ao fato
hospedeiro normal e invadir quando ocorrem deficiências no sistema imune. Por outro lado, C. parapsilosis é considerada como espécie ubíqua, podendo ser isolada de
diferentes nichos ecológicos ambientais (de Bernardis et al., 1999; Pipper et al., 1998;
Weems et al., 1992). Este fator possivelmente exige uma maior adaptação deste
organismo na invasão do hospedeiro humano. A grande maioria dos estudos de virulência com isolados de Candida spp foi realizado com C. albicans.
Estudos inéditos em modelos animais sugerem que C. parapsilosis
apresenta menor virulência que C. albicans (Andriolle e Hasenclever 1962). King et al.
(1980), avaliando a aderência de 7 espécies de Candida de importância médica,
demonstraram que C. parapsilosis apresentaram capacidade de aderência a células
epiteliais bucais humanas altamente inferior à C. albicans. Castaldo et al. (1991)
reportaram que isolados de C. parapsilosis aderiram significantemente menos que C.
albicans à mucina intestinal de ratos. Além de vários autores terem demonstrado menor
aderência de C. parapsilosis, ainda não foram descritas adesinas nesta espécie.
Apesar de C. parapsilosis ser capaz de produzir proteinase in vitro,
apenas dois genes SAPs foram descritos para esta espécie. Além disso, as funções
destes genes e seu envolvimento na virulência desta espécie ainda não foram determinados (de Viragh et al., 1993; Hube e Naglik 2002). Ghannoum et al. (2000)
também relataram que C. parapsilosis produz significantemente menos fosfolipase que C.
albicans, outro importante fator de virulência desta espécie.
Estudos utilizando modelos de infecção experimental também reportam a limitada virulência de C. parapsilosis. Por exemplo, Andriolle e Hasenclever (1962)
relatam que quando injetada intravenosamente, cepas de C. parapsilosis apenas foram
letais em camundongos com diabetes experimentalmente induzida. Animais inoculados por via intravenosa com C. parapsilosis e imunossupressão induzida por ciclofosfamida
hiperalimentação de glicose, constataram que em animais imunossuprimidos por ciclofosfamida inoculados com C. parapsilosis não foram recuperadas culturas viscerais
positivas, enquanto que naqueles inoculados com a mesma quantidade de células de C.
albicans e C. tropicalis, culturas positivas foram encontradas em 62 % e 24 % dos animais,
respectivamente.
Apesar de C. albicans ainda ser considerada a espécie mais virulenta
do gênero Candida, Brito et al. (2006) demonstraram em um estudo envolvendo
candidemia por C. parapsilosis e C. albicans, que apesar da mortalidade por C.
parapsilosis ter sido significativamente menor, quando era incluído o APACHE II score na
análise multivariada, a mortalidade por C. parapsilosis não foi significativamente menor.
Da mesma forma, entre os pacientes tratados, não houve diferença significativa (P=0,79)
no índice de mortalidade entre as duas espécies.
O menor índice de mortalidade em decorrência de fungemia por C.
parapsilosis, verificado por alguns autores, pode ser justificado devido ao fato de que a
maioria dos pacientes que desenvolveram candidemia por C. parapsilosis fazia uso de
CVC e tinha este dispositivo removido mais freqüentemente (Nucci et al., 2001; Weems et al., 1992). Meunier et al. (1990) revelaram em seu estudo que culturas de sangue de
pacientes com câncer, que apresentaram fungemia relacionada ao CVC por C.
parapsilosis tornaram-se estéreis com a remoção desse procedimento invasivo. Nucci et
al. (1998), em um estudo realizado no Brasil em que foram avaliados fatores de risco para
óbito em pacientes com candidemia, observaram que a infecção por C. parapsilosis foi um
fator protetor para óbito identificado em análise multivariada. Dados semelhantes também foram identificados por Tortorano et al., (2002).
A baixa mortalidade dessa espécie como causa de fungemia foi observada na população pediátrica, onde a prevalência foi de 17 a 50% dos casos (Levy
et al., 1998). Valores de sobrevida de crianças com candidemia por C. parapsilosis foram
podem existir outros fatores que influenciam nessa sobrevida, e que variáveis clínicas são importantes na patogenicidade dessa espécie (Pappas et al., 2003).
1.3. Variabilidade genotípica entre isolados de C. parapsilosis
A análise dos caracteres genotípicos dos microrganismos constitui
grande avanço para caracterização das espécies em diferentes grupos de patógenos, permitindo também a avaliação de variabilidade intra-específica entre as mesmas. Vale mencionar ainda que tais técnicas geram resultados com maior rapidez e consistência, fato importante para permitir agilidade na instituição para controle de infecções hospitalares (Melo et al., 1998; Sullivan et al., 1996; Pfaller, 1995). Entre as técnicas
moleculares correntemente em uso para tipagem de microrganismos podemos citar: RAPD, a cariotipagem realizada com eletroforese em campo pulsátil (Pulsed Field Gel Electrophoresis–PFGE), análise de fragmentos de restrição de DNA e hibridação com sondas específicas de DNA, análise das seqüências de nucleotídeos de genes ribossômicos, entre outras (Sader, 1995).
A heterogeneidade genética de C. parapsilosis tem sido reportada em
vários estudos. Sherer e Stevens (1987), aplicando ensaio de análise das variações de tamanho de fragmentos de DNA gerados por digestão com enzimas de restrição em amostras clínicas de Candida, revelaram três grupos distintos de C. parapsilosis. Os
dados, a partir deste estudo, sugeriram que C. parapsilosis seria genotipicamente mais
heterogênea que C. albicans e C. tropicalis. Lehmann et al. (1992), com base no uso de
RAPD, relataram a presença de três grupos distintos geneticamente de C. parapsilosis
de 3 perfis genotípicos diferentes resultantes da análise de isoenzimas, por RAPD e análise da região ITS (Espaçadores Transcritos Internos) do gene rDNA. Estes autores utilizaram as seqüências dos ITS1, ITS2 e do gene rRNA 5.8S para estimar a filogenia dos grupos de C. parapsilosis e encontraram várias diferenças na comparação das
seqüências ITS1. Neste estudo, o padrão genotípico de C. parapsilosis do grupo I foi
detectado na maioria das amostras, seguido pelo do grupo II e III, respectivamente. Diferenças bioquímicas também foram encontradas, como a não assimilação de D-xilitol pelo grupo I e II, o que resultou no mesmo código 6756171 de identificação do kit API 20 C, enquanto que os únicos dois isolados do grupo III assimilaram fortemente este açúcar, sendo identificados pelo código 6776171.
Roy e Meyer (1998) examinaram composição de bases de DNA nuclear, reassociação DNA-DNA e RFLP em 14 isolados clínicos e ambientais de C.
parapsilosis previamente agrupados por Lin et al. (1995) sendo 9 do grupo I, dois do grupo
II e três do grupo III. A correlação entre os DNAs foi maior que 95% entre isolados do mesmo grupo e menor que 25% entre grupos diferentes. A proporção de base G+C contida nos isolados foi de 40,2 a 41,5 mol % para o grupo I, 38 a 40,5 mol % para o grupo II e 39,4 a 40,7 mol % para o grupo III. O polimorfismo foi evidente nestas amostras após a digestão dupla com Hind III e Hae III; Hind III e Pvu II que discriminaram as amostras em
grupo I, II ou III.
Recentemente, Tavanti et al. (2005) relataram divergências entre cepas
de C. parapsilosis ao realizarem comparação das seqüências de 11 genes essenciais pelo
método MLST (Multilocus Sequence Typing). Os produtos de PCR (Reaction Chain Polymerase) destes genes quando seqüenciados apresentaram diferenças na seqüência de apenas quatro deles: COX3, LIA1, SADH e SYAQ diferenciando C. parapsilosis nos
Sendo assim, foi proposta uma reclassificação de C. parapsilosis grupo II e III em espécies
distintas: Candida orthopsilosis e Candida metapsilosis, respectivamente.
A utilização de RFLP hibridizado com sondas tem-se mostrado um método efetivo para genotipagem de Candida spp. Esta técnica tem sido usada como
método de escolha para estudos epidemiológicos devido a sua alta reprodutibilidade, e passível de automação e sensível na detecção de microevoluções (Kuhn et al., 2004). No
entanto, é um método que depende do sucesso da clivagem de enzimas o que limita o seu uso.
Uma sonda espécie-específica para C. parapsilosis (Cp3-13) foi
desenvolvida por Enger et al. (2001). Estes autores analisaram 89 isolados dessa espécie,
analisando-os poderemos distinguir isolados da mesma espécie que apresentam baixo grau de variação genética (Lasker et al., 2006).
Em um estudo recente, realizado por Lasker et al. (2006), o
desempenho da análise de microsátelites de C. parapsilosis foi avaliado através da
comparação com os resultados da tipagem obtidos da hibridização de fragmentos de restrição com a sonda Cp3-13. A análise de microsatélites mostrou-se altamente reprodutível e com grande capacidade de discriminar isolados epidemiologicamente não relacionados com alta concordância (80%) com os resultados obtidos com a hibridização do DNA pela sonda Cp3-13. No entanto, apesar do seu excelente poder discriminatório, esta técnica requer conhecimento prévio das seqüências de DNA para construção dos oligonucleotídeos, além do alto custo para aquisição de aparelho de seqüenciamento e programa para análise das seqüências, o que seria inviável para aplicação em laboratórios de pequeno porte.
Vários estudos demonstraram vantagem no emprego do RAPD em relação a alguns métodos moleculares na identificação dos grupos de C. parapsilosis.
Como demonstrado por Lehmann et al. (1992), que utilizaram RAPD para
caracterização e identificação genotípica de espécies do gênero Candida,
organismos submetidos a esta técnica podem ser analisados geneticamente pela comparação de seus perfis genotípicos com perfis de cepas de referência, podendo ser montado inclusive um banco de dados de RAPD. O RAPD é uma ferramenta molecular que pode discriminar perfis genotípicos distintos de espécies fisiologicamente similares como descrito para C. parapsilosis. Essas diferenças
genéticas podem representar comportamentos distintos diante da terapia antifúngica ou podem ser responsáveis por diferentes quadros clínicos.
Melo et al. (1998), utilizando o RAPD, estudaram 13 isolados brasileiros
de hemocultura fenotipicamente identificados como C. parapsilosis. Neste estudo, foi
Zancopé-Oliveira et al. (2000) analisaram 8 casos de fungemia
causados por C. parapsilosis no Rio de Janeiro, Brasil, utilizando RAPD e cariotipagem
eletroforética. Todos os isolados dos pacientes, além de uma cepa isolada de solução de nutrição parenteral, foram avaliados para verificar se havia relação genética entre eles. Ambas as técnicas mostraram-se eficazes na identificação dos grupos de C. parapsilosis e
da rota de transmissão, caracterizando o surto. Para avaliar o poder discriminatório de cada método de tipagem aplicado nesse estudo, um índice numérico de discriminação (D) foi calculado. Neste estudo, o índice de Simpson de diversidade foi usado baseado na probabilidade de que duas cepas não relacionadas oriundas de amostras populacionais foram colocadas dentro de grupos diferentes. Baseado nesse critério, o RAPD demonstrou um poder discriminatório melhor (índice de 0,804) quando comparado à cariotipagem (índice de 0,723).
No mesmo ano, Dassanayake e Samaranayake (2000) observaram vantagem significativa do RAPD quando comparado ao RFLP em um estudo sobre a diversidade genotípica entre 15 isolados sistêmicos e superficiais de C. parapsilosis. O
RAPD apresentou melhor poder discriminatório inter-específico nos 15 isolados testados por estes autores produzindo 10 genótipos distintos.
procedimento simples e rápido para análise de surtos e investigação de rotas de transmissão.
1.4. Prevalência de C. orthopsilosis e C. metapsilosis
Após a proposta da criação de duas novas espécies, C. orthopsilosis e
C. metapsilosis, sugerida por Tavanti et al. (2005), substituindo a designação de C.
parapsilosis grupo II e grupo III respectivamente, um número limitado de estudos de prevalência, com definição da fonte de isolamento da cepa analisada, tem sido registrado. Dados da prevalência dessas duas novas espécies foram descritos apenas em trabalhos de identificação de surtos ou em estudos envolvendo a diversidade genotípica encontrada entre cepas de bancos de microrganismos, muitas vezes sem a informação da fonte de isolamento.
Um dos primeiro trabalhos relatando a presença de C. orthopsilosis e C.
metapsilosis,ainda designadas como C. parapsilosis grupo II e III em isolados clínicos, foi
realizado por Stevens e Scherer (1987) com amostras isoladas no estado da Califórnia, EUA. Esses autores classificaram os 7 isolados clínicos testados de C. parapsilosis em
três grupos (I, II e III), sendo o grupo II detectado em 2 das amostras e o grupo III também em dois casos. Nenhum dado clínico sobre a origem das cepas desse estudo foi mencionado.
Lehmann et al. (1992), no estado do Texas (USA), aplicando RAPD em
8 cepas originalmente identificadas com C. parapsilosis, identificaram 3 (37%) delas como
foram identificadas como C. parapsilosis grupo III, sendo uma delas de origem
desconhecida e a outra de cultura de mão.
Lin et al. (1995) avaliaram 45 amostras clínicas de C. parapsilosis
provenientes de diferentes regiões dos EUA, incluindo as cepas identificadas anteriormente por Lehmann et al. (1992). Estas amostras foram submetidas a testes
fenotípicos, análise isoenzimática e seqüenciamento. Desse total, o grupo II foi identificado em 10 (22%) dos casos, sendo 4 dessas amostras oriundas da urina, uma de sangue, uma de fezes, uma de sutura, uma de ponta de cateter e duas não tiveram seu sítio de isolamento identificado. As duas (4,4%) amostras, identificadas como grupo III nesse estudo, foram oriundas de cultura de mão e a outra de origem não identificada.
Ainda nos EUA, Roy e Meyer (1998), utilizando técnicas moleculares tais como RFLP, estudo da composição das bases nitrogenadas e reassociação do DNA, estudaram 5 amostras clínicas e ambientais. Estes autores relataram a presença de 2 espécies pertencentes ao grupo II, sendo uma representante de urina e o outra de origem ambiental . Três cepas (21%) de C. parapsilosis grupo III foram confirmados nesse estudo,
sendo uma isolada de cultura de mão e as demais de origem desconhecida.
Na Europa, Tavanti et al. (2005) estudaram 32 cepas de C. parapsilosis
No Brasil, Melo et al. (1998), utilizando o RAPD em 13 cepas de C.
parapsilosis isoladas de episódios de candidemia, reportaram a presença de 9 (69%) C.
parapsilosis, 4 (30%) de C. orthopsilosis e nenhuma C. metapsilosis.
Um surto de candidemia por de C. orthopsilosis foi detectado com base
em dois métodos moleculares na cidade do Rio de Janeiro por Zancopé et al. (2000) em
que 9 cepas foram envolvidas, sendo 8 de hemocultura e uma de nutrição parenteral prolongada, a qual foi implicada como origem da infecção.
Iida et al. (2005), através de seqüenciamento da região ITS, analisaram
24 isolados de candidemia por C. parapsilosis do Brasil e 34 do Japão. Nesta pesquisa,
além da cepa ATCC (América Type Culture Collection) incluída como controle, nenhuma
C. orthopsilosis foi identificada entre amostras clínicas. Contudo, 3 (5%) isolados foram
identificados como a C. metapsilosis. Quatro amostras brasileiras nesse estudo foram
consideradas como C. parapsilosis grupo IV, apresentando 94% de similaridade com a
cepa ATCC de C. orthopsilosis, 49 foram identificadas C. parapsilosis (grupo I) e outras
duas não tiveram resultados conclusivos suficientes, demonstrando similaridade tanto com
C. orthopsilosis quanto com o grupo IV, classificadas, portanto em um grupo intermediário.
Recentemente, Kocsubé et al. (2007) estudaram 209 casos de
candidemia oriundos de dois hospitais húngaros entre 2004 e 2005. Neste estudo, 20 (9,6%) dessas amostras foram identificadas como C. parapsilosis sensu latu (grupos I, II e
III) com base em critérios fisiológicos, morfológicos e PCR utilizando oligonucleotídeos espécie-específicos para o complexo C. parapsilosis. Utilizando RAPD e seqüenciamento
da região ITS, foi detectada entre essas amostras a presença de duas cepas pertencentes à recente espécie descrita C. metapsilosis, sendo o primeiro relato em literatura desta
A presente investigação teve por objetivos:
I - Selecionar oligonucleotídeos para utilização em RAPD, que tivessem alto poder discriminatório e boa reprodutibilidade no padrão de bandas, para diferenciar cepas de
C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis.
II - Caracterizar a prevalência de C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis
entre cepas isoladas de hemoculturas de pacientes oriundos de áreas geograficamente
distintas, identificadas originalmente como C. parapsilosis.
III - Analisar a diversidade genotípica de C. parapsilosis entre isolados de sangue,
documentados em hospitais de diferentes áreas geográficas no Brasil e na América Latina.
IV - Comparar a diversidade genotípica de isolados hematogênicos de cepas de C.
parapsilosis do estado de São Paulo.
V - Avaliar a diversidade genotípica entre isolados hematogênicos de C. parapsilosis
3.1. Seleção das amostras
3.1.1 Seleção das amostras deste estudo
Neste estudo foram incluídas todas as amostras de leveduras isoladas de hemoculturas, durante o período de 2003 a 2005, identificadas fenotipicamente como
C.parapsilosis, catalogadas no Banco de Microrganismos do Laboratório Especial de
Micologia (LEMI) da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP).
Os isolados, incluindo as cepas referência ATCCs, foram numerados para facilitar o estudo e submetidos à identificação por testes micromorfológicos e bioquímicos para confirmação da identificação de espécie.
Vale salientar que todas as amostras do banco de microrganismo foram cultivadas em meio YEPD (Yeast Extract Peptone Dextrose) por estarem congeladas em freezer a -70°C.
Parcela significativa das cepas catalogadas para o estudo foram obtidas de pacientes incluídos no estudo epidemiológico Rede Candidemia Brasil (Colombo et al.,
2006) sendo disponíveis os dados relacionados à doença de base, procedimentos médicos realizados na evolução clínica e também, área geográfica de isolamento das leveduras.
3.2. Verificação de viabilidade e pureza das leveduras armazenadas no LEMI
Previamente aos experimentos, as cepas foram submetidas à verificação de sua pureza e viabilidade. Para isso, foram semeadas em meio ágar Sabouraud dextrose (SDA / OXOID, Basingstoke, Hampshine, England) contendo cloranfenicol, com repiques sucessivos, a fim de que os testes fossem realizados com culturas recentes.
Para avaliação da pureza, as leveduras foram semeadas com alça de níquel-cromo pela técnica de esgotamento, em placas de Petri (90x15 mm) descartáveis contendo meio CHROMagar Candida® (CHROMagar Microbiology, Paris, France), meio
cromogênico seletivo, que permite a identificação de culturas mistas de leveduras. Após 48 horas de incubação a 37oC, as colônias sugestivas de
C. parapsilosis tiveram sua
identificação confirmada por microcultivo e perfil bioquímico utilizando o ID32C (Baumgartner et al.,1996; Warren e Hazen 1995).
3.3. Identificação Fenotípica
3.3.1. Análise da micromorfologia (microcultivo)
Com a finalidade de observarmos as estruturas micromorfológicas características de C. parapsilosis, cada amostra foi semeada, com o auxílio de agulha de
3.3.2. Perfil bioquímico: identificação de C. parapsilosis pelo sistema ID 32C (API – bioMérrieux)
Para realização das provas de identificação das leveduras por este sistema comercial foram utilizados isolados com crescimento a temperatura de 30°C, em SDA após 24-48 horas de incubação. Em seguida, foi preparado o inóculo, consistindo de uma suspensão do microrganismo em água destilada esterilizada com turbidez ajustada ao padrão n° 2 da escala de McFarland. Foram dispen sados 250 µL de cada suspensão de inóculo a ser testado em ampola contendo o meio C, sendo o conteúdo final delicadamente homogeneizado. Finalmente, 135 µL do conteúdo da ampola foi pipetado em cada poço da galeria. Foi preparada uma câmara úmida para evitar a desidratação dos testes, onde foram armazenadas as galerias para incubação durante 72h, a 30°C. Foram realizadas leituras a cada 24h até a leitura final após 72h, sendo a assimilação positiva indicada nos poços que apresentaram turvação superior àquela do controle negativo (Fricker-Hidalgo et al., 1996).
3.4. Tipagem molecular
3.4.1. Técnica do RAPD
3.4.1.2. Extração do DNA e formação de protoplastos
As amostras previamente identificadas por métodos fenotípicos como
C. parapsilosis foram submetidas à identificação molecular para possível identificação das
espécies de C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis pela técnica de RAPD.
Uma colônia de cada levedura isolada foi semeada em placa de SDA com 300 mg/L de cloranfenicol e incubada por 48 horas a 30ºC.
Na extração do DNA foi utilizado o protocolo de isolamento de Wach et al. (1994). Para este procedimento, uma única colônia da placa foi retirada, adicionada em
4 mL de caldo YEPD (Difco Laboratories) e incubada “overnight” a 35ºC sob agitação constante (200 rpm). Foi transferido, em seguida, uma alíquota de 1,3 mL da cultura para tubo de microcentrifugação de 1,5 mL, sendo o mesmo, centrifugado a 6000 rpm por 3 minutos. As células foram lavadas em 1 mL de água milli-Q esterilizada e ressuspensas no agitador de tubos.
Foram adicionados 0,6 volumes de isopropanol (MERCK) ao precipitado, ou seja, para 500 µL de centrifugado obtido, foram adicionados 300 µL de isopropanol e misturado suavemente por inversão, incubando, em seguida, à temperatura ambiente por 5 minutos. Após centrifugação em velocidade máxima por 5 minutos, o sobrenadante foi desprezado, sendo 1 mL de etanol (MERCK) 70% adicionado ao precipitado, homogeneizado por inversão e incubado à temperatura ambiente por 10 minutos e, novamente, centrifugado por 10 minutos em velocidade máxima.
A lavagem com etanol foi repetida, o precipitado seco por 10 minutos em fluxo laminar e o DNA dissolvido em 50 µL de água milli-Q esterilizada.
3.4.1.3. Tratamento do DNA com RNAse
3.4.1.4. Quantificação do DNA
Alíquotas de 5 µL de DNA foram diluídas em 1 mL de água milli-Q. Em seguida, a absorbância foi medida em 260 nm de comprimento de onda em espectrofotômetro (GeneQuantpro Amersham Pharmacia Biotech AB, Cambridge,
England). Segundo Sambrook et al. (1989), a absorbância igual a 1, contém uma
concentração de 50 µg/mL de DNA dupla fita, 40 µg/mL de DNA fita simples e ~ 20 µg/mL de oligonucleotídeos fita simples. Também foi medida a absorbância (Densidade Óptica - DO) em 280 nm de comprimento de onda para verificar a presença de proteínas e calcular a pureza do DNA. A razão entre as leituras DO260/DO280 permite uma estimativa da pureza do DNA, que deve apresentar valores entre 1,8 e 2,0. A razão abaixo de 1,6 indica grande quantidade de contaminantes e proteínas, e na sua ocorrência, a extração foi realizada novamente.
3.4.1.5. Seleção dos oligonucleotideos para genotipagem por RAPD
Um total de 7 oligonucleotídeos foram selecionados para tipagem por RAPD de isolados de C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis caracterizando
ainda a diversidade intraespecífica destas amostras. A seleção desses oligonucleotídeos foi baseada em revisões bibliográficas publicadas nos últimos anos, sendo os mesmos previamente utilizados para tipagem de C. parapsilosis, sendo eles: 1281 (5’ - AAC GCG
CAA C - 3’), 1253 (5’ - GTT TCC GCC C - 3´), PAO3 (5´- AGT CAG CCA C- 3´), RSD12 (5´- GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG - 3’), M2 (5´-CTT GAT TGC C - 3`), RP4-2 (5´- CAC ATG CTT C - 3´), B14 (5´- GAT CAA GTC C -3´) (Dassanayake et al., 2000; Xu
Para que um oligonucleotídeo possa ser utilizado em estudos genotípicos por RAPD, ele deve ter alto poder discrminatório entre os isolados e gerar resultados reprodutíveis (Soll, 2000).
3.4.1.6. Cepas controle para a avaliação da performance dos oligonucleotídeos
Para a escolha do oligonucleotídeo a ser utilizado em nosso estudo, foram selecionadas 20 cepas fenotípicamente identificadas como C. parapsilosis, incluindo
cepas de referência C. parapsilosis (ATCC 90018), C. orthopsilosis (ATCC 96141) e C.
metapsilosis (ATCC 96143). As cepas utilizadas nesse experimento piloto foram oriundas
de 8 áreas geográficas distintas, obtidas de um mesmo hospital, porém de pacientes diferentes (Tabela 1). As 20 cepas incluídas nesta análise foram compostas por 2 isolados clínicos de cada centro médico distinto, sendo estes constituídos de 14 amostras de hemocultura e 6 isolados de sítios superficiais.
3.4.1.7. Reações de RAPD
Para essas reações foram adicionados em tubos de microcentrifugação de 0,2 mL, as seguintes substâncias: 11,5 µL de água milli-Q esterilizada, 2,5 µL de buffer
10 X (Invitrogen), 5 µL de dNTP mix 1,25 mM (Amersham - Pharmacia Biotech); 3,5µL de MgCl2 (Invitrogen) 25 mM, 1 µL do oligonucleotídeo 50 pmol (BIO.SYNTHESIS ) 0,13 µL
de Tween-20; 0,4 µL de Taq DNA polimerase (Invitrogen) e 1 µL de DNA diluído a 40
ng/µL, totalizando em um volume de 25 µL.
3.4.1.8. Eletroforese em gel de agarose
O gel de agarose (Ultra Pure Agarose-Invitrogen) para a eletroforese foi usado na concentração de 1,2% em solução tampão TAE 1X (Tris acetato EDTA). Os produtos amplificados pelos PCRs foram diluídos em tampão orange G (10 µL da reação em 2 µL do tampão orange G) e 1 µl do marcador de peso molecular (100 base pair Ladder / Invitrogen), foi diluído em 9 µL de água milli-Q esterilizada e 2 µL do tampão Orange G. Foram adicionadas 12 µL da reação diluída a cada orifício do gel , que foi submetido a corrente elétrica de 100 volts por 30 minutos e em seguida a 55 volts por 5 horas e 30 minutos.
Após o término da eletroforese, o gel foi corado com solução de brometo de etídio (USB Corporation, Cleveland, OH USA) durante 20 minutos (400 mL de TAE 1X + 20 µL de brometo de etídio 10 mg/mL) e descorado em água destilada por 15 minutos.
Os padrões de bandas contidos nos géis tiveram sua imagem visualizada em um transiluminador de raios UV (UVP – BioDoc – it TM System), capturada e transferida para um disquete (no formato JPEG) para posterior análise em Software Analítico.
3.5. Avaliação da similaridade dos padrões de bandas
Maths, Kortrijk, Bélgica) através de análise de agrupamento, de acordo com a similaridade dos padrões de bandas obtidos.
Os géis foram comparados entre si após o aporte de suas imagens pelo programa Gel Compar II. Este programa corrige distorções do gel, como padrões de sorriso, através da comparação com um padrão universal e seleciona automaticamente, as bandas presentes no gel. As imagens originais dos géis foram analisadas visualmente para desconsiderar os artefatos. O coeficiente de Dice (com tolerância de 2%) foi utilizado para esta análise porque leva em consideração a presença e ausência de bandas, bem como oferece maior peso para as bandas em comum entre as amostras analisadas para gerar a matriz de similaridade. Para construir o dendrograma, utilizou-se o método UPGMA (Unweighted Pair-Group Method Using Arithmetic Averages), que baseado na matriz de similaridade, fez o agrupamento par a par das amostras, gerando desta maneira uma árvore enraizada.
3.6. Seqüenciamento da região ITS
Todas as amostras identificadas pela técnica de RAPD como C.
orthopsilosis e C. metapsilosis, como também aquelas cuja identificação foi inconclusiva,
foram submetidas ao seqüenciamento da região ITS do rDNA.
Para o seqüênciamento, a região ITS foi amplificada por PCR utilizando os oligonucleotídeos: CparapITSout F (5' CCG TCG TGC TGG GGA TAG AG 3' e
CparapITSout R (5' CAT CGC ACG GGA TTC TCA CC 3') construídos usando o programa
DNA Star (Padovan, 2005).
diluído a 40 ng/µL, 22 µL de água milli-Q esterilizada livre de nucleases (PROMEGA), totalizando um volume de 50µL.
ng dos fragmentos amplificados (aproximadamente 2 µl) foram colocados em uma reação padrão contendo 2 µl de “Big Dye TM Terminator versão 3.1 / Sequencing Standard Kit” – DNA polimerase AmpliTaq, tampão Tris-HCl pH 9,0, MgCl2, deoxinucleotídeos trifosfato
(dATP,dCTP, dITP, dUTP) e dideoxinucleotídeos marcados com um doador e um aceptor de fluorescência, 1,6 pmol de oligonucleotídeo, 2 µl de tampão Save Money 2.5 X e água
milli-Q para completar 10 µl. As condições de ciclagem foram: 25 ciclos de 96ºC por 10 segundos, 50ºC por 5 segundos e 60ºC por 4 minutos, em um termociclador Applied Biosystems GeneAmp PCR system 9700.
A fase de precipitação foi realizada à temperatura ambiente adicionando 8 µl de água milli-Q e 32 µl de etanol 100%. Durante 15 minutos, o precipitado foi protegido da luz e, em seguida, o material foi centrifugado durante 45 minutos a 2970 g, a placa foi então invertida e foi realizada centrifugação a 500 g por 30 segundos com a placa invertida; adicionou-se 150 µl de etanol 70% e centrifugou-se durante 45 minutos a 2970 g. O material foi secado por 1 minuto a 90ºC no termociclador. No momento do seqüenciamento, as amostras foram ressuspendidas em 10µl de formamida HI-DI, desnaturadas por 5 minutos a 90ºC e mantidas no gelo por 5 minutos.
A análise das seqüências em bancos genômicos foi feita através dos “sites” NCBI (National Center for Biotechnology Information - http://www.ncbi.nlm.nih.gov) utilizando o serviço “blast” (Basic Local Alignment Search Tool). Esta ferramenta caracteriza-se por programas de procura de similaridade que são designados para identificar e classificar os homólogos em potencial para uma determinada seqüência. Estes programas são capazes de analisar seqüências de DNA e aminoácidos.
Os critérios utilizados para certificação da qualidade do alinhamento e interpretação correta da identificação da espécie foram realizados de acordo com números de bases idênticas (porcentagem de identidade) com outras seqüências da região ITS armazenadas no banco genômico. O E-value que corresponde à probabilidade ao acaso
Neste caso, E-values menores que 10-5 refletem que este alinhamento não se deu ao
4.1. Seleção dos oligonucleotídeos para genotipagem de C. parapsilois, C.
orthopsilosis e C. metapsilosis por RAPD.
A seleção de oligonucleotídeos teve como objetivo identificar ao menos dois oligonucleotídeos para serem utilizados na tipagem por RAPD de cepas de C.
parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis. Neste sentido, utilizou-se como critério de
seleção destes iniciadores as seguintes propriedades: (1) capacidade de amplificar o DNA de todas as amostras, (2) poder discriminatório para variações inter e intra-específicas, (3) produção de número de bandas suficientes para análise dos perfís genotípicos por dendrograma, (4) capacidade de agrupar isolados aparentemente relacionados, discriminando as diferenças entre isolados epidemiologicamente não relacionados.
Os oligonucleotídeos foram testados em 20 cepas fenotipicamente identificadas como C. parapsilosis oriundas de 8 áreas geográficas distintas, incluindo as
cepas de referência (ATCC) de C. parapsilosis, C. metapsilosis e C. orthopsilosis (Tabela
1).
Todas as amplificações realizadas com os 7 oligonucleotídeos testados foram repetidas ao menos duas vezes. Em cada caso, a maior parte das bandas de alta intensidade foi reprodutível até mesmo quando era repetida a extração do DNA do mesmo isolado, sendo essas bandas utilizadas para identificação inter-específica. Entretanto, diferenças entre as bandas de menor intensidade, quando eram reprodutíveis, eram utilizadas para identificação intra-específica.
Entretanto, 4 oligonucleotídeos apresentaram bons resultados com relação à identificação das espécies. Os géis de RAPD obtidos a partir destes últimos estão representados nas figuras 1A, 1B e 2A, 2B.
O oligonucleotídeo 1281 (Figura 1A) foi capaz de amplificar todas as 20 amostras, diferenciando as três cepas de referência de C. parapsilosis, C. orthopsilosis e
C. metapsilosis. Este oligonucleotídeo produziu de 17 a 20 bandas que variaram entre 250
e 2.000 pb. Em relação à posição e presença de bandas, as de maior peso molecular foram conservadas e de maior densidade, o que possibilitou a identificação de espécie entre as amostras testadas. A maior parte das bandas de menor densidade foi da mesma forma reprodutível e algumas vezes variável quanto a sua posição o que permitiu a discriminação entre as cepas da mesma espécie. O oligonucleotídeo 1281 foi capaz de identificar entre as amostras avaliadas, uma cepa de C. orthopsilosis (4A) que apresentou
um padrão de bandas similar ao da cepa referência desta espécie (II). As demais amostras clínicas foram identificadas visualmente como C. parapsilosis apresentando
diversidade genotípica entre seus representantes. Quando a análise foi realizada através do dendrograma (Figura 2A), os isolados identificados visualmente como C. parapsilosis
foram agrupados com um coeficiente de similaridade de 86%, sendo incluída nesse grupo a cepa de referência C. parapsilosis ATCC. A capacidade de agrupar amostras
relacionadas foi observada nos isolados de C. parapsilosis 2A e 2B sendo o maior
coeficiente de similaridade (98%) observado entre este par de isolados. Este oligonucleotídeo foi capaz de gerar 20 genótipos diferentes entre as amostras desta espécie. Este grupo de C. parapsilosis apresentou similaridades menores em relação às
cepas de referência de C. metapsilosis (81%) e C. orthopsilosis (74,5%). A amostra 4A foi
identificada como C. orthopsilosis por esta análise agrupando-se com a cepa de referência
de C. orthopsilosis (ATCC).
oligonucleotídeo foi de 5-17 bandas com 150 a 2.000pb. As amostras amplificadas revelaram ainda um padrão de bandas único para cada isolado, resultando em 19 genótipos diferentes Entretanto, não foi capaz de amplificar uma das amostras (9B), apesar de várias tentativas de repetição da reação e extração de DNA. A amostra 4A também gerou um padrão de bandas semelhante a C. orthopsilosis ATCC (II) sugerindo
pertencer a esta espécie. Entretanto, o RAPD com este oligonucleotídeo não mostrou consistência nas bandas de baixa intensidade, o que dificulta a análise intra-específica. A análise do dendrograma executado a partir do perfil de bandas amplificadas por este oligonucleotídeo (Figura 2B) revelou a presença de um agrupamento de isolados de C.
Como o oligonucleotídeo 1253 não amplificou a amostra 9B apresentando limitações na consistência das bandas de baixa intensidade, mas apresentou bom poder discriminatório entre as três espécies, ele foi utilizado em nosso estudo quando a identificação de espécies, após amplificação com o oligonucleotídeo 1281, gerava dúvida.
4.2 Seleção das amostras deste estudo
As amostras tiveram sua identificação fenotípica confirmada por testes micromorfologicos. Todas os isolados apresentaram crescimento satisfatório, com colônias que variavam de branco a rosa, sem presença de sinais de contaminação, cor esta, sugestiva de C. parapsilosis, segundo o fabricante. Após essa triagem inicial, foi analisado
o perfil bioquímico destas cepas pelo método de identificação semi-automatizado ID32 C (bioMérieux, Marcy-I’Étoile, França) geraram os códigos 5547350717 e 5546350717 identificando os isolados como C. parapsilosis. Foi realizada a análise de microcultivo, em
que foi observado a presença de pseudohifas curvas e blastoconídeos, características estas compatíveis com a espécie.
Ao final da seleção das amostras, alcançamos um universo de 166 leveduras escolhidas para serem submetidas aos testes moleculares para identificação das espécies de C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis e avaliação da
diversidade genotípica das cepas de C. parapsilosis(Anexo 2).
