Tratamentos com Diferentes Concentrações de Furocumarinas

As curvas de sobrevivência obtidas após tratamento da bactéria com soluções de 8- MOP, TMP e 3-CPs a diferentes concentrações, seguido de irradiação com doses crescentes de UVB, são mostradas nos gráficos 1, 2 e 3, respectivamente. O efeito letal provocado pelas associações 8MOP-UVB, TMP-UVB e 3-CPs-UVB mostrou dependente tanto da concentração da FC quanto da dose de irradiação.

No caso da 8-MOP, concentrações crescentes causaram aumento da sensibilidade bacteriana a UVB. Em contraste, no caso da TMP, a cepa bacteriana apresentou maior sensibilidade a UVB na menor concentração, com uma redução gradual da sensibilidade à medida que a concentração desta FC aumentou. O aumento na concentração de 3-CPs conferiu maior resistência aos danos induzidos por UVB.

0 30 60 90 1E-5 1E-4 1E-3 0,01 0,1 1 10 100 S ob re vi vê nc ia ( % )

Tempo de exposição (seg.)

UVB

UVB + 8-MOP (0,23mM) UVB + 8-MOP (0,115mM) UVB + 8-MOP (0,0575mM) UVB + 8-MOP (0,02875mM)

Gráfico 1. Curvas de sobrevivência obtidas após tratamento da cepa ISP255 com diferentes concentrações de 8-MOP (mM, millimolar) em diferentes tempos de exposição à luz UVB de 312 nm (seg, segundos).

EFEITOS DE FUROCUMARINAS ASSOCIADAS A UVB (312 nm) EM S. AUREUS

35 0 15 30 45 60 1E-5 1E-4 1E-3 0,01 0,1 1 10 100 S ob re vi vê nc ia ( % )

Tempo de exposição (seg.)

UVB

UVB + TMP (0,23mM) UVB + TMP (0,115mM) UVB + TMP (0,0575mM) UVB + TMP (0,02875mM)

Gráfico 2. Curvas de sobrevivência obtidas após tratamento da cepa ISP255 com diferentes concentrações de TMP (mM, millimolar) em diferentes tempos de exposição à luz UVB de 312 nm (seg, segundos). 0 30 60 90 120 150 1E-3 0,01 0,1 1 10 100 S ob re vi vê nc ia ( % )

Tempo de exposição (seg.)

UVB

UVB + 3-CPs (0,23mM) UVB + 3-CPs (0,115mM) UVB + 3-CPs (0,0575mM) UVB + 3-CPs (0,02875mM)

Gráfico 3. Curvas de sobrevivência obtidas após tratamento da cepa ISP255 com diferentes concentrações de 3-CPs (mM, millimolar) em diferentes tempos de exposição à luz UVB de 312 nm (seg, segundos).

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Os resultados obtidos indicaram que a 8-MOP e a TMP atuam como agente fotossensibilizante para UVB. Comparando-se os resultados aqui apresentados com os anteriormente obtidos com UVA (BARROS e SIQUEIRA-JUNIOR, 2002), pode-se perceber que ambas FCs são mais eficientes como agentes fotosssensibilizante para UVB do que para UVA. Na ausência de FC (ou algum outro xenobiótico excitável por UV), UVA e UVB apresentam diferentes efeitos em sistemas celulares. A UVB tem como alvo primário o DNA, enquanto que a UVA pode causar danos no DNA através de reações indiretas de fotooxidação (CADET et al.,2003; BRENDLER-SCHWAAB et al.,2004; RASTOGI et al.,2010). Destarte, FCs-UVA e

FCs-UVB provavelmente poderiam afetar a célula de diferentes maneiras, mas sem descartar algum mecanismo em comum para a inativação celular (SCHEINFELD e DELEO, 2003). As FCs podem se ligar de forma reversível no escuro e formar MA e BA no DNA após exposição a radiações com comprimento de onda maior que 300 nm (HASS E WEBB, 1979; JAMES e COOHILL, 1979; RONTÓ et al., 1989). Deste modo, o efeito fotossensibilizante demonstrado pelas associações 8-MOP-UVB e TMP-UVB pode ser atribuído ao acúmulo de MA e BA formadas no DNA.

A UVB, da mesma forma que a UVC, causa principalmente formação de CPDs (RAVANAT et al., 2001; SCHUCH e MENCK, 2010), cuja formação, pode ser inibida por FCs intercaladas, o que pode ser explicado pelo conceito de transferência de energia, resultando em um efeito fotoprotetor (BARRETO e SIQUEIRA-JUNIOR, 2006). Deste modo, é possível que uma curva de sobrevivência obtida após tratamento com 8MOP-UVB ou TMP-UVB seja o reflexo de dois efeitos provocados pela FC: fotossensibilização, decorrente da formação de MA e BA e fotoproteção, como consequência da inibição de CPDs. No entanto, os resultados contrastantes entre 8MOP-UVB e TMP-UVB verificados quando a cepa foi tratada com diferentes concentrações de cada FC poderiam ser explicados pela especificidade diferencial de intercalação das duas FCs por certas sequências de nucleotídeos.

A 8-MOP exibe uma forte especificidade por sequencias (AT)n, ligando-se

preferencialmente em sítios 5’AT (SAGE et al., 1988; SAGE e MOUSTACCHI, 1987; TESSMAN et al.,1985), os quais são passíveis de sofrer a formação de BA devido à proximidade das timinas situadas em fitas opostas (SMITH e BRODBELT, 2010).Tais sequências são importantes para a viabilidade celular, uma vez que geralmente estão situadas em sítios de origem de replicação, sítios de integração, sítios de recombinação e regiões

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promotoras (BOYER et al., 1988; SAGE et al., 1988). Assim, a intercalação preferencial da 8- MOP nestas sequências biologicamente importantes pode levar a formação de BA, as quais, juntamente com as MA e CPDs contribuem para o efeito fotossensibilizante observado. Uma possível explicação para a maior sensibilização da cepa com o aumento da concentração de 8- MOP poderia ser a de que o processo de reparo deste conjunto de lesões se tornaria mais lento e complexo, resultando em maior mortalidade (CALSOU et al., 1996; KLEINAU et al., 1997).

O aumento na concentração de TMP resultou em uma redução da sensibilidade da bactéria à UVB. A TMP, assim como outros compostos metilados, apresenta alta reatividade com o DNA e baixa especificidade pelos sítios fortes (AT)n, sendo capazes de se ligar em

sítios contendo timinas adjacentes ou isoladas, os quais são considerados sítios fracos ou sítios não preferenciais para a fotorreação de diferentes FCs com o DNA (KRAMER e PATHAK, 1970; SAGE et al., 1988; MIOLO et al.,1989). Neste caso, é possível que a redução da sensibilidade em função do aumento da concentração tenha ocorrido devido a uma maior disponibilidade de moléculas para intercalação no DNA, levando a inibição de um maior número de CPDs. Apesar da maior disponibilidade de moléculas para intercalação, um número menor de BA serão formadas em razão da baixa especificidade da TMP por sítios (AT)n

(SMITH e BRODBELT, 2010).

Por outro lado, não podemos descartar a possibilidade de ligação a proteínas no escuro influenciar na biodisponibilidade de uma dada FC para intercalação no DNA. A constante de associação com proteína no escuro é 15 vezes mais alta para TMP do que para 8-MOP (VERONESE, 1979). Na verdade, é digno de nota que TMP protege contra UVC apenas em concentrações ≥ 0,23 mM (LIRA, 2007).

A 3-CPs apresenta baixa afinidade por DNA, ligando-se quase que exclusivamente nos sítios fortes (SAGE, et al.,1988; BOYER et al.,1988). Por ser monofuncional devido a presença do grupo carbetoxi no carbono 3, este composto forma apenas 4’,5’-MA. De acordo com Dall’acqua et al.,(1978), as 3,4-MA correspondem a 74 - 93% do total de lesões formadas no DNA após tratamento com psroraleína-UVA (365 nm), enquanto que as lesões do tipo 4’,5’- MA e as BA são formadas em menor quantidade. O efeito fotoprotetor exercido por este composto se deve, provavelmente, à inibição da formação de CPDs nos sítios importantes para

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a viabilidade celular, à sua incapacidade de formar BA, ao baixo número de MA induzidas e ao reparo eficiente de MA e CPDs remanescentes.