Para refinamento da estrutura 3D de TcNTR, foram utilizados dois protocolos: (a) otimização por gradiente conjugado seguido por refinamento por dinâmica molecular com simulated annealing (AS) e (b) otimização por steepest descent (descida mais íngreme) e gradiente conjugado seguido de refinamento por dinâmica molecular em meio aquoso.
5.7.1 OTIMIZAÇÃO POR GRADIENTE CONJUGADO E REFINAMENTO POR DINÂMICA MOLECULAR COM SIMULATED ANNEALING
As etapas de otimização por gradiente conjugado foram realizadas considerando cinco minimizações sucessivas de até 200 passos cada. Esta etapa é seguida por um aquecimento rápido
do sistema constituído por 4 fs de dinâmica molecular a 150, 250, 400, 700 e 1.000 K. O estágio de aquecimento é seguido pela fase de otimização principal que consiste em um resfriamento gradual de 4 fs em 1.000, 800, 600, 500, 400 e 300 K.
5.7.2 OTIMIZAÇÃO POR STEEPEST DESCENT (DESCIDA MAIS ÍNGREME) E GRADIENTE CONJUGADO E REFINAMENTO POR DINÂMICA MOLECULAR EM MEIO AQUOSO
As etapas de otimização e refinamento da estrutura do modelo de TcNTR, foram realizadas utilizando o pacote de programas GROMACS 4.5 (Lindahl et al., 2001) e o campo de força AMBER03, seguindo os parâmetros metodológicos de restrições de posições de Lima (2015).
Primeiramente, os arquivos de topologia (.itp) e coordenadas (.pdb) foram criados para os ligantes (NFZ e FMN) através do programa ACPYPE - AnteChamber PYthon Parcer InterfacE (Sousa Da Silva e Vranken, 2012).
Os átomos de hidrogênio foram adicionados na estrutura tridimensional utilizando o programa Pymol v. 1.7.2.1 (The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.7.2.1, Schrödinger, LLC). A correção de parâmetros de topologia não determinados pelo ACPYPE foi realizada através do programa MKTOP (Ribeiro et al., 2008). As cargas atômicas parciais foram calculadas utilizando o método CHELPG, disponível no servidor Resp Esp charge Derive (R.E.D. server) (Dupradeau et al., 2010; Vanquelef et al., 2011).
O complexo proteína-cofator-ligante foi inserido em uma caixa periódica triclínica e solvatado com moléculas de água do tipo TIP4P (Hawe e Popelier, 2010), sendo neutralizado com 29 íons cloro.
A etapa de otimização foi realizada utilizando o algoritmo steepest descent com restrição de posição para o ligante e o cofator, com critério de convergência de 1.000,00 kJ.mol-1nm-1, seguido por minimização sem restrição de posição. A seguinte etapa de otimização foi realizada utilizando gradiente conjugado com restrição de posição para ligante e cofator, com critério de convergência de 1.000,00 kJ.mol-1nm-1 e número máximo de etapas de 15000, seguido por gradiente conjugado sem restrição de posição.
Na etapa de refinamento dos complexos minimizados, o sistema foi submetido, primeiramente, a uma simulação de DM, considerando o número de partículas, volume e temperatura de 300K (ensemble NVT). Em seguida, o sistema foi considerado isotérmico-isobárico (temperatura e pressão constantes ou ensemble NPT). As simulações NVT e NPT foram realizadas a temperatura de 300 K e pressão de 1 bar, restringindo as posições do cofator, ligante e a proteína entre os resíduos Met81-His294 (alça A) e Ser379-Phe624 (alça B), enquanto as moléculas de água não foram restritas.
O termostato V-rescale (Bussi et al., 2007) foi utilizado no controle da temperatura, enquanto a pressão foi controlada utilizando o barostato Parrinello-Rahman (Parrinello e Rahman, 1981). As ligações que envolvem átomos de hidrogênio no complexo foram restringidas usando o algoritmo LINCS - Linear Constraint Solver (Hess et al., 1997).
O algoritmo PME - Particle-Mesh Ewald (Darden et al., 1993; Essmann et al., 1995) foi utilizado para tratar as interações eletrostáticas à longa distância, com raio de corte aplicado para as interações de van der Waals e de Coulomb de 1nm.
Após a etapa de NVT e NPT do sistema, realizou-se uma simulação de DM durante 7 ns, considerando o ensemble NPT, mantendo a restrição somente para o cofator e o ligante, usando tempo de integração de 5 fs e um raio de corte para as interações a longa distância de 10 Å. Finalmente, 20ns sem restrição de posição.
5.8 AVALIAÇÃODOSMODELOSCONSTRUÍDOS
A avaliação dos modelos 3D de TcNTR construídos antes e depois da etapa de otimização e refinamento foi realizada no servidor SAVES-Structural Analysis and Verification Server, 2016 (SAVES, 2016), utilizando os programas Procheck (Laskowski et al., 1993), Verify-3D (Eisenberg et al., 1992) e Errat (Colovos e Yeates, 1993).
A ferramenta Procheck gera o gráfico de Ramachandran que determina a qualidade da proteína, apontando a existência de impedimentos estereoquímicos na cadeia principal dos aminoácidos (Laskowski et al., 1993).
O algoritmo Errat é usado para avaliar o progresso do refinamento pela análise da frequência de interações entre átomos não ligados em comparação com a estruturas 3D de alta resolução (Colovos e Yeates, 1993). No caso do Verify-3D, a compatibilidade entre a sequência de aminoácidos e a estrutura terciária é avaliada (Eisenberg et al., 1992).
5.9 DOCAGEMMOLECULAR
Os estudos de docagem molecular foram realizados utilizando o programa Autodock 4.2 (Morris et al., 1998) e o modelo de TcNTR otimizado por steepest descent e gradiente conjugado seguido de refinamento por dinâmica molecular em meio aquoso.
Para validação do protocolo de docagem molecular foi utilizado o método de redocagem do ligante nitrofurazona (NFZ) no sítio ativo de ligação do modelo 3D de TCNTR. A redocagem consiste na habilidade do programa em predizer o modo de ligação presente no complexo (Leach,
2001). A metodologia de redocagem é considerada bem sucedida quando a melhor solução obtida pelo programa possui um desvio da raiz média quadrática (RMSD) menor do que 2Å em relação à pose observada na estrutura de partida (Feher, 2006).
A preparação do ligante NFZ e da macromolécula TcNTR, obtida durante a construção da estrutura 3D foram realizadas pela interface gráfica do Autodock Tools (Morris et al., 1998). Para o ligante e o cofator foram calculadas as cargas Gasteiger e as ligações rotacionáveis foram definidas automaticamente. Já para a macromolécula, as moléculas de água foram retiradas, os hidrogênios polares foram adicionados e as cargas Kollman foram calculadas.
Para o processo de docagem molecular, foi utilizado o número de corridas de valor 50, o tamanho da população inicial de 150 e algoritmo genético. A dimensão da grade de energia foi de 54 X 40 X 58 pontos com discretização de 0,375 Å, estando a grade centralizada no átomo N5 do cofator FMN (coordenadas: x=65,29, y=32,32 e z=50,76 Å) (Figura 7). Assim, todos os ligantes podem se acomodar no sítio da enzima.
Figura 7: Representação da grade calculada pelo programa Autogrid.
As melhores soluções dos complexos obtidos por docagem molecular foram analisadas de acordo com as interações intermoleculares, como ligação de hidrogênio, eletrostáticas, van der Waals, hidrofóbicas entre a enzima, cofator e o ligante, considerando uma distância de até 7Å. As figuras foram geradas no programa DSV-Discovery Studio Visualizer (Accelrys, Inc.).