UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS A PRODUTOS PARA A SAÚDE
PATRÍCIA PEREIRA FARIAS
MODELAGEM COMPARATIVA, DOCAGEM MOLECULAR E RELAÇÃO ESTRUTURA-ATIVIDADE DE DERIVADOS NITROIMIDAZÓLICOS COMO POTENCIAIS INIBIDORES DA ENZIMA NITRORREDUTASE DE TRYPANOSOMA
CRUZI
NITERÓI 2017
MODELAGEM COMPARATIVA, DOCAGEM MOLECULAR E RELAÇÃO ESTRUTURA-ATIVIDADE DE DERIVADOS NITROIMIDAZÓLICOS COMO POTENCIAIS INIBIDORES
DA ENZIMA NITRORREDUTASE DE TRYPANOSOMA CRUZI
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências
Aplicadas a Produtos para Saúde (PPG-CAPS) da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para a obtenção do Grau de Mestre. Área de Concentração: Desenvolvimento de Produtos para Saúde.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª MONIQUE ARAÚJO DE BRITO Co-orientador: Prof. Dr. CAMILO HENRIQUE DA SILVA LIMA
Niterói 2017
F 224 Farias, Patrícia Pereira
Modelagem comparativa, docagem molecular e relação estrutura –ati- vidade de derivados nitroimidazólicos como potenciais inibidores da enzima nitrorredutase de Trypanosoma cruzi /Patrícia Pereira Farias; Orientadores: Monique Araújo de Brito e Camilo Henrique da Silva Lima. - Niterói, 2017.
147 f.: il.
Dissertação (Mestrado em Ciências Aplicadas em Produtos de Saúde) – Universidade Federal Fluminense, 2017.
1.Tecnologia farmacêutica 2. Trypanosoma cruzi 3. Metronidazol 4. Desenho de drogas I. Brito, Monique Araújo de, orient. II. Lima, Camilo Henrique da Silva, orient. III. Título.
À Deus, pela determinação e força nesta trajetória. Dedico-lhe esta conquista como gratidão.
A Deus, por toda a determinação e força que me permitiram concluir uma importante etapa de desenvolvimento pessoal nesta vida.
À minha orientadora, Prof.ª Dr.ª Monique Araújo de Brito, por toda atenção e disponibilidade, pela confiança, por todos os conhecimentos compartilhados, livros e artigos emprestados e palavras de amizade. Obrigada pelo acolhimento e incentivo acadêmico durante a minha fase de transição. Uma verdadeira professora!
Ao meu co-orientador, Dr. Camilo H. da Silva Lima, por toda a disposição, pela orientação, pelos esclarecimentos na redação da dissertação e dos trabalhos científicos e pela paciência. Obrigada por me auxiliar nessa trajetória. Foi uma pessoa essencial para que esse trabalho pudesse ser realizado.
Aos amigos da Pós-Graduação, em especial, à Monique Luiza Aguiar dos Santos, pela amizade, ajuda, dicas e companheirismo.
À minha família pelo amor e cuidado.
À minha querida mãe, Maria do Socorro, pelo seu amor, carinho e proteção. Ao meu querido irmão, Marcelo, meu melhor amigo e companheiro.
Ao Filipe Freitas, meu companheiro de aventuras. Obrigada pelo amor, pela amizade, por ser meu Buda, psicólogo e pelo apoio em todos os momentos. Certamente, você foi um grande incentivador para o término desse trabalho.
Ao meu amigo Dolly, por tornar meus dias mais leves e engraçados. À coordenação do PPG-CAPS, por todo o suporte.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pelos recursos financeiros fornecidos.
As doenças parasitárias são um grave problema de saúde pública em diversos países e estão distribuídas, principalmente, em áreas endêmicas em países da África, Ásia, América Central e do Sul. Entre estas doenças estão a doença de Chagas e a doença do Sono, reconhecidas como negligenciadas. Há uma necessidade de tratamentos mais eficientes para essas doenças devido a toxicidade, baixa eficácia e segurança dos fármacos existentes, além da dificuldade de administração e evolução de resistência. O grupo de pesquisa da Dra. Núbia Boechat (Farmanguinhos/FIOCRUZ), vem realizando estudos com análogos nitroimidazólicos sintetizados considerando o megazol como protótipo, molécula ativa contra Trypanosoma cruzi, porém com efeitos mutagênicos e genotóxicos. Estes derivados apresentaram atividade contra o T. cruzi, com menor efeito genotóxico quando comparados com o megazol. Através deste trabalho, a relação estrutura-atividade dos derivados nitroimidazólicos (40a, 40b e 41a-41h) foi realizada e através dos descritores eletrônicos HOMO e LUMO, observou-se que grupos volumosos e com caráter retirador de elétrons do anel nitroimidazólico apresentam relação direta com a atividade. A avaliação do perfil toxicológico in silico confirmou que o composto 41a, mais ativo da série, não apresentou citotoxicidade em células sanguíneas humanas in vitro. O modelo da enzima nitrorredutase de T. cruzi, construído por modelagem comparativa, pode ser utilizado nos estudos de docagem molecular, os quais sugeriram que o tamanho da molécula, a possibilidade de interação com os resíduos His503 e Tyr545 e interações hidrofóbicas do tipo π-π com o cofator FMN podem contribuir para a atividade de derivados nitroimidazólicos no sítio ativo da enzima nitrorredutase. Através dos estudos de docagem molecular, sete novos derivados otimizados foram propostos (PR01 a PR07), dentre os quais o PR03, considerado como melhor ligante planejado, apresentou interações no sítio ativo similares às observadas para o protótipo 41a. Desta forma, os resultados obtidos neste trabalho podem ser úteis a novas pesquisas e podem contribuir para o desenvolvimento de novos protótipos contra o T. cruzi.
Palavras-chave: Trypanosoma cruzi. Nitrorredutase. Nitroimidazol. Modelagem Molecular. Docagem Molecular.
Parasitic diseases are a major public health problem in many countries, and they are distributed primarily in endemic areas in Africa, Asia, Central and South America. Among them, there are Chagas disease and African trypanosomiasis, known as neglected. There is a need for better treatments for these diseases due to toxicity, low efficacy and safety of the existing drugs, besides the difficulty of administration and evolution of resistance. The research group of Dr. Núbia Boechat (Farmanguinhos/FIOCRUZ), has been conducting studies with nitroimidazole analogs synthesized through the prototype megazol (active molecule against trypanosoma, but with mutagenic and genotoxic effects). In this work, the structure activity relationship of the nitroimidazole derivatives (40a, 40b and 41a-41h) was performed and it was observed through the electronic descriptors HOMO and LUMO that groups with electron withdrawing character display relation with activity. In silico toxicological studies confirmed that the most active compound 41a did not show cytotoxicity in human blood cells in vitro. T. cruzi type I nitroreductase constructed by comparative modeling, can be used in molecular docking studies, which suggested that the size of the molecule, the possibility of interaction with the residues His503 and Tyr545, and hydrophobic interactions of the π- Π with the FMN cofactor may contribute to the activity of nitroimidazole derivatives in the active site of the nitroreductase. From molecular docking studies, seven new optimized derivatives were proposed (PR01 to PR07), among them PR03 was considered as the best planned molecule, it displayed similar active site interactions to those observed for prototype 41a. Thus, the results obtained in this work may be useful to new research and may contribute to the development of new prototypes against T. cruzi.
Key words: Trypanosoma cruzi. Nitroreductase. Nitroimidazole. Molecular Modeling. Molecular Docking.
1 INTRODUÇÃO, p. 19 2 JUSTIFICATIVA, p. 21 3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA, p. 22 3.1 DOENÇA DE CHAGAS, p. 22 3.1.1 EPIDEMIOLOGIA, p. 23
3.1.2 CICLO DO TRYPANOSOMA CRUZI, p. 24 3.1.3 FASES CLÍNICAS, p. 26
3.1.4 TRATAMENTO, p. 27 3.2 NITROIMIDAZÓIS, p. 28 3.3 NITRORREDUTASES, p. 29
3.4 MODELAGEM MOLECULAR, p. 32
3.4.1 MÉTODO DE MECÂNICA QUÂNTICA, p. 33 3.4.2 MÉTODO DE MECÂNICA MOLECULAR, p.34 3.4.3 ANÁLISE CONFORMACIONAL, p. 34
3.5 MODELAGEM MOLECULAR DE PROTEÍNAS, p. 35 3.5.1 MODELAGEM COMPARATIVA, p. 35
3.5.2 PREDIÇÃO DE ENOVELAMENTO DE PROTEÍNAS, p. 36 3.6 VALIDAÇÃO, p. 37 3.7 DOCAGEM MOLECULAR, p. 38 3.7.1 FUNÇÕES DE BUSCA, p. 38 3.7.2 FUNÇÕES DE PONTUAÇÃO, p. 39 3.7.3 PROGRAMA AUTODOCK, p. 40 3.8 DINÂMICA MOLECULAR, p. 41 4 OBJETIVO GERAL, p. 43 4.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS, p. 43 5 MÉTODOS, p. 44
5.1 SELEÇÃO DOS COMPOSTOS E DADOS DE ATIVIDADE BIOLÓGICA, p. 44
5.2 CONSTRUÇÃO 3D DOS INIBIDORES, OTIMIZAÇÃO GEOMÉTRICA E ESTUDO DOS PERFIS CONFORMACIONAIS, p. 46
5.3 CÁLCULOS DOS DESCRITORES ESTRUTURAIS, ELETRÔNICOS E FÍSICO-QUÍMICOS, p. 46
5.5 ANÁLISE DA RELAÇÃO ESTRUTURA ATIVIDADE, p. 47
5.6 CONSTRUÇÃO DO MODELO 3D DA NITRORREDUTASE TIPO I DE TRYPANOSOMA CRUZI, p. 47
5.6.1 CONSTRUÇÃO DA ESTRUTURA 3D POR MODELAGEM COMPARATIVA, p. 48 5.6.2 CONSTRUÇÃO DA ESTRUTURA 3D POR THREADING, p. 48
5.7 OTIMIZAÇÃO E REFINAMENTO DO MODELO DE NITRORREDUTASE TIPO I DE TRYPANOSOMACRUZI, p. 48
5.7.1 OTIMIZAÇÃO POR GRADIENTE CONJUGADO E REFINAMENTO POR DINÂMICA MOLECULAR COM SIMULATED ANNEALING, p. 48
5.7.2 OTIMIZAÇÃO POR STEEPEST DESCENT (DESCIDA MAIS ÍNGREME) E GRADIENTE CONJUGADO E REFINAMENTO POR DINÂMICA MOLECULAR EM MEIO AQUOSO, p. 49
5.8 AVALIAÇÃO DOS MODELOS CONSTRUÍDOS, p. 50 5.9 DOCAGEM MOLECULAR, p. 50
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO, p. 52
6.1 DESCRITORES ESTRUTURAIS, FÍSICO-QUÍMICOS E ELETRÔNICOS, p. 52 6.2 ESTUDO DOS PERFIS DE DRUG-LIKENESS E DRUG-SCORE, p. 56
6.3 ESTUDO TOXICOLÓGICO INSILICO, p. 57
6.4 ANÁLISE DA RELAÇÃO ESTRUTURA-ATIVIDADE (SAR), p. 59
6.5 CONSTRUÇÃO DO MODELO 3D DA NITRORREDUTASE TIPO I DE TRYPANOSOMA CRUZI, p. 59
6.5.1 MODELAGEM COMPARATIVA, p. 59 6.5.1.1 Seleção de proteínas de referência, p. 59
6.5.1.2 Alinhamento das sequências - modelo de nitrorredutase tipo I de Trypanosoma brucei, p. 64 6.5.1.3 Construção do modelo de nitrorredutase tipo I de Trypanosoma brucei, p. 66
6.5.1.4 Construção do modelo de nitrorredutase tipo I de Trypanosoma cruzi, p. 68
6.5.2 CONSTRUÇÃO DO MODELO DE NITRORREDUTASE TIPO I DE TRYPANOSOMA CRUZI – MODELAGEM COMPARATIVA E AB INITIO, p. 72
6.5.3 CONSTRUÇÃO DO MODELO DE NITRORREDUTASE TIPO I DE TRYPANOSOMA CRUZI – I-TASSER, p. 74
TRYPANOSOMACRUZI, p. 77
6.7 AVALIAÇÃO DO SÍTIO ATIVO E VALIDAÇÃO DO MODELO DE NITRORREDUTASE TIPO I DE TRYPANOSOMACRUZI, p. 80
6.8 ESTUDO DE DOCAGEM MOLECULAR DOS DERIVADOS 41A, 41E, 41F, 41D E 41H, p. 82 6.9 PROPOSIÇÃO DE NOVOS DERIVADOS, p. 88
6.9.1 DESCRITORES ESTRUTURAIS, FÍSICO-QUÍMICOS E ELETRÔNICOS, p. 89 6.9.2 ESTUDO DO PERFIL DE DRUG-LIKENESS, p. 91
6.9.3 ESTUDO TOXICOLÓGICO IN SILICO, p. 92
6.9.4 ESTUDO DE DOCAGEM MOLECULAR DAS MOLÉCULAS PROPOSTAS (PR01 A PR07), p. 93 7 CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS, p. 101
2006-2009 (Adaptado do Relatório OMS, 2010), f. 23 Fig. 2 Ciclo de vida do T. cruzi (Fonte: Bern, 2011), f. 25
Fig. 3 Estruturas químicas dos fármacos nifurtimox e benzonidazol utilizados no tratamento contra a doença de Chagas ( De Carvalho et al., 2014), f. 27 Fig. 4 Estrutura química do megazol (De Carvalho et al., 2014), f. 29
Fig. 5 Estrutura 3D da enzima nitrorredutase tipo I de Escherichia coli (PDB: 1YKI) (Race et al., 2005), f. 30
Fig. 6 Mecanismo de ação das NTRI e NTRII (Adaptado de Oliveira, 2013), f. 32
Fig. 7 Representação da grade calculada pelo programa Autogrid, f. 51 Fig. 8 Alinhamento entre a sequência primária de T. cruzi e a sequência da
proteína molde (nitrorredutase de Thermus thermophilus), f. 61
Fig. 9 Alinhamento entre as sequências primárias de T. cruzi e T. brucei, f. 63 Fig. 10 Alinhamento entre as sequências das proteínas 2B67 e 1YKI (Moldes) e
da sequência de TbNTR (Alvo), f. 65
Fig. 11 Estrutura 3D da enzima TbNTR, construída por modelagem comparativa, f. 66
Fig. 12 BLAST: Busca de proteínas-molde para a sequência primária de TbNTR, f. 67
Fig. 13 Estrutura 3D da enzima TcNTR construída por modelagem comparativa (A). Inserção do cofator FMN na interface do dímero (B), f. 70
Fig. 14 BLAST: Busca de proteínas-molde para a sequência primária de TcNTR, f. 71
Fig. 15 Estrutura 3D da enzima TcNTR, construída por modelagem comparativa através do servidor Swiss-Model (A). Inserção do cofator FMN (Átomo de Carbono = amarelo) (B), f. 73
Fig. 16 Alinhamento entre as sequências de T. cruzi e Anabaena variabilis (PDB: 3eo7). As regiões alinhadas com alto grau de identidade estão destacadas em laranja e com baixo grau em azul, f. 74
Fig. 17 Estrutura 3D da enzima TcNTR, construída por modelagem comparativa através do servidor I-TASSER (A). Inserção do cofator FMN (B), f. 76
modelagem comparativa, após refinamento através do protocolo 1 (B). Estrutura 3D da enzima TcNTR, construída por modelagem comparativa, após refinamento através do protocolo 2 (C), f. 78
Fig. 19 Estrutura 3D da enzima TcNTR, construída por modelagem comparativa, após otimização e refinamento através do protocolo 2 (A). Inserção do cofator e do ligante nitrofurazona na cavidade do sítio ativo (B), f. 81 Fig. 20 Cluster mais populoso obtido na validação do protocolo de docagem
molecular (A). Sobreposição entre a estrutura obtida por redocagem (Átomo de Carbono = amarelo) e co-cristalizada (Átomo de Carbono = branco) no complexo 1YKI (Race et al., 2005) (B), f. 82
Fig. 21 Interações intermoleculares (linhas pretas) realizadas pelo ligante 41a nas simulações de docagem molecular (A). Inserção do ligante 41a (Átomo de Carbono = rosa), na cavidade do sítio ativo (B), f. 83
Fig. 22 Interações intermoleculares (linhas pretas) realizadas pelo ligante 41e nas simulações de docagem molecular (A). Inserção do ligante 41e (Átomo de Carbono = rosa), na cavidade do sítio ativo (B), f. 84
Fig. 23 Interações intermoleculares (linhas pretas) realizadas pelo ligante 41f nas simulações de docagem molecular (A). Inserção do ligante 41f (Átomo de Carbono = rosa), na cavidade do sítio ativo (B), f. 85
Fig. 24 Interações intermoleculares (linhas pretas) realizadas pelo ligante 41d nas simulações de docagem molecular (A). Inserção do ligante 41d (Átomo de Carbono = rosa), na cavidade do sítio ativo (B), f. 86
Fig. 25 Interações intermoleculares (linhas pretas) realizadas pelo ligante 41h nas simulações de docagem molecular (A). Inserção do ligante 41h (Átomo de Carbono = rosa), na cavidade do sítio ativo (B), f. 87
Fig. 26 Modificações estruturais propostas para o composto 41a, f. 89 Fig. 27 Interações intermoleculares (linhas pretas) realizadas para a proposta
PR01 nas simulações de docagem molecular (A). Inserção do ligante PR01 (Átomo de Carbono = rosa), na cavidade do sítio ativo (B), f. 93 Fig. 28 Interações intermoleculares (linhas pretas) realizadas para a proposta
PR03 nas simulações de docagem molecular (A). Inserção do ligante PR03 (Átomo de Carbono = rosa), na cavidade do sítio ativo (B), f. 95 Fig. 30 Interações intermoleculares (linhas pretas) realizadas para a proposta
PR04 nas simulações de docagem molecular (A). Inserção do ligante PR04 (Átomo de Carbono = rosa), na cavidade do sítio ativo (B), f. 96 Fig. 31 Interações intermoleculares (linhas pretas) realizadas para a proposta
PR05 nas simulações de docagem molecular (A). Inserção do ligante PR05 (Átomo de Carbono = rosa), na cavidade do sítio ativo (B), f. 97 Fig. 32 Interações intermoleculares (linhas pretas) realizadas para a proposta
PR06 nas simulações de docagem molecular (A). Inserção do ligante PR06 (Átomo de Carbono = rosa), na cavidade do sítio ativo (B), f. 89 Fig. 33 Interações intermoleculares (linhas pretas) realizadas para a proposta
PR07 nas simulações de docagem molecular (A). Inserção do ligante PR07 (Átomo de Carbono = rosa), na cavidade do sítio ativo (B), f. 99
benzonidazol (3) e megazol (1) sobre as formas tripomastigostas sanguíneas de T. cruzi na cepa Y (Quaresma, 2015), f. 44
TABELA 2 - Descritores eletrônicos, estruturais e físico-químicos dos derivados nitroimidazólicos, do Megazol (1) e do Benzonidazol (3), após análise conformacional e otimização do confôrmero de menor energia, f. 53 TABELA 3 - Representações gráficas dos orbitais moleculares HOMO e LUMO
para os compostos 40a e 40b, f. 54
TABELA 4 - Representações gráficas dos orbitais moleculares HOMO e LUMO para os compostos 41a, 41f e 41h, f. 55
TABELA 5 - Parâmetros Drug-likeness e Drugscore in silico dos derivados nitroimidazólicos, do megazol e do benzonidazol, f. 56
TABELA 6 - Parâmetros de toxicidade, genotoxicidade e teste de AMES in silico dos derivados nitroimidazólicos, do Megazol e do Benzonidazol, f. 58 TABELA 7 - Parâmetros obtidos pelo gráfico de Ramachandran para o modelo de
TbNTR construído por modelagem comparativa, f. 68
TABELA 8 - Parâmetros obtidos pelo gráfico de Ramachandran para o modelo de TcNTR construído por modelagem comparativa, f. 72
TABELA 9 - Parâmetros obtidos pelo gráfico de Ramachandran para o modelo de TcNTR construído por modelagem comparativa, através do servidor Swiss-Model, f. 73
TABELA 10 - Parâmetros obtidos pelos servidores Errat e Verify-3D para os cinco modelos de TcNTR construídos pelo servidor I-Tasser, f. 75
TABELA 11 - Parâmetros obtidos pelo gráfico de Ramachandran para o modelo de TcNTR construído através do servidor I-TASSER, f. 76
TABELA 12 - Parâmetros obtidos pelo gráfico de Ramachandran, Errat e Verify 3D para o modelo 3D sem otimização e refinamento e otimizado e refinado pelos protocolos 1 e 2, f. 79
análise conformacional e otimização do confôrmero de menor energia, f. 90
TABELA 14 - Parâmetros Drug-likeness in silico das moléculas propostas (PR01 a PR07), f. 91
TABELA 15 - Parâmetros de toxicidade, genotoxicidade e teste de AMES in silico das moléculas propostas (PR01 a PR07), f. 92
ALH Aceptor de ligação de hidrogênio
cLogP Log na base 10 do coeficiente de partição
octanol/água
cLogS Log na base 10 da solubilidade calculado
DLH DSV
Doador de ligação de hidrogênio Discovery Studio Visualizer (Programa)
EHOMO Energia do orbital molecular de mais alta
energia ocupado HOMO (Ver HOMO)
ELUMO Energia do orbital molecular de mais baixa
energia desocupado LUMO (Ver LUMO)
HOMO Orbital molecular de mais alta energia
ocupado (HOMO) IC50
LUMO
MMFF
Concentração capaz de inibir 50% da
atividade (Inhibition Concentration at 50%) Orbital molecular de mais baixa energia desocupado (LUMO)
Merck Molecular Force Field (campo de força)
MPE map Mapa de potencial eletrostático molecular
PDB Banco de Dados de Proteína (Protein Data
Bank)
pIC50 Log na base 10 negativo do IC50
MM Massa molecular
PSA Área de superfície polar (polar surface
area)
RMN Ressonância magnética nuclear
RMSD Desvio médio quadrático das posições
A Ala Resíduo de alanina
C Cys Resíduo de cisteína
D Asp Resíduo de ácido aspártico E
F
Glu Phe
Resíduo de ácido glutâmico Resíduo de fenilalanina
G Gly Resíduo de glicina
H His Resíduo de histidina
I Ile Resíduo de isoleucina
K Lis Resíduo de lisina
L M Leu Met Resíduo de leucina Resíduo de metionina N P Asn Pro Resíduo de asparagina Resíduo de prolina Q Gln Resíduo de glutamina R S Arg Ser Resíduos de arginina Resíduo de serina T V W Thr Val Trp Resíduo de treonina Resíduo de valina Resíduo de triptofano
1 INTRODUÇÃO
As doenças parasitárias são um grave problema de saúde pública em diversos países e estão distribuídas, principalmente, em áreas endêmicas da África, Ásia, América Central e do Sul (WHO, 2015).
Entre estas doenças estão a doença de Chagas (tripanossomíase americana), a doença do sono (tripanossomíase africana), a malária, a leishmaniose visceral, a filariose linfática, a dengue e a esquistossomose, que são uma das principais causas de morbidade, mortalidade e incapacidade de pessoas em todo o mundo e representam uma necessidade médica importante (DNDi, 2015).
A doença de Chagas é causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi. O principal vetor envolvido na transmissão do parasita a seres humanos é o triatomíneo, popularmente conhecido como barbeiro (WHO, 2015; DNDi, 2015). Outras formas de transmissão são por transfusão de sangue, transplante de órgãos, via oral e congênita (DNDi, 2015).
A despeito da imposição dos programas de saúde pública e o controle de vetores ter diminuído a incidência de novas infecções, esta doença continua sendo endêmica em 21 países da América Latina (WHO, 2015).
Não há vacina para a prevenção da doença e o controle do vetor permanece sendo o método mais efetivo de prevenção da transmissão na América Latina (WHO, 2015).
Atualmente, no mundo, os fármacos comercialmente disponíveis para o tratamento da doença de Chagas são os nitro-heterociclos nifurtimox (1) e benzonidazol (2) que possuem eficiência comprovada apenas contra a forma extracelular do parasita, durante a fase aguda e na fase crônica inicial da infecção, fato que se caracteriza como um problema, pois a maioria dos casos somente é diagnosticada na fase crônica (De Carvalho et al., 2014). No Brasil, apenas o benzonidazol é aprovado pela ANVISA (Pereira & Navarro, 2013).
Outros complicadores são o alto custo, tratamento de longa duração, resistência e efeitos tóxicos (De Carvalho et al., 2014; Nwaka & Hudson, 2006). Além disso, causam efeitos adversos importantes, como anorexia, perda de peso, vômitos, náusea e diarreia (DNDi, 2015). Desta forma, há uma necessidade de melhores tratamentos para essas doenças.
Os nitroimidazóis têm sido objeto de interesse para a química medicinal devido ao amplo espectro de propriedades farmacológicas, principalmente, em relação à atividade contra a doença de chagas e doença do sono (Olender et al., 2009; Li et al., 2012; Patterson e Wyllie, 2014). Estudos indicam que o grupamento nitro do anel imidazólico é importante alvo para ação de enzimas nitrorredutases dos parasitas (De Carvalho et al., 2014).
Diante das questões expostas, o planejamento e a pesquisa de novos agentes com atividade tripanocida é importante e pode ser realizada através da utilização da modelagem molecular. A
modelagem molecular consiste em um conjunto de técnicas para a investigação das estruturas e das propriedades moleculares pelo uso de química computacional, através do uso das écnicas de visualização gráfica, construção, edição e análise de sistemas moleculares (Sant’Anna, 2002; Cohen et al., 1990).
2 JUSTIFICATIVA
O tratamento atual contra a doença de Chagas emprega dois fármacos, nifurtimox e benzonidazol e, nenhum destes agentes é ideal, pois atuam apenas na fase aguda da doença e apresentam efeitos adversos, além de apresentarem desvantagens como alto custo e tratamento de longa duração. Nessa perspectiva, novos fármacos são necessários.
Dois fatores importantes que ratificam as pesquisas por novos fármacos contra a doença de Chagas são: (a) poucas informações disponíveis decorrentes de pouco investimento do setor privado em relação à descoberta de novos agentes contra doenças negligenciadas, como a Doença de Chagas; (b) necessidade de propor novos agentes com menos efeitos adversos.
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3.1 DOENÇA DE CHAGAS
A doença de Chagas, também conhecida como tripanossomíase americana, é causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi. O principal vetor envolvido na transmissão do parasita a seres humanos é o triatomíneo, popularmente conhecido como barbeiro (WHO, 2015; DNDi, 2015). Outras formas de transmissão são por transfusão de sangue, transplante de órgãos, via oral e congênita (DNDi, 2015; Coura, 2015). A transmissão da doença ocorre, principalmente, via o vetor (80 a 90%), por transfusão de sangue (5 a 20%) e congênita (0,5 a 8%) (Coura & De Castro, 2002).
Na natureza, existem mais de 100 espécies de mamíferos que são reservatórios de T. cruzi, como morcegos, roedores, carnívoros, tatus, coelhos e lebres. No entanto, a infecção pelo T. cruzi em triatomíneos, animais e seres humanos só foi demonstrada por Carlos Chagas, em 1909, durante a descoberta da doença (Coura, 2015).
Inicialmente, a infecção por T. cruzi era de característica enzoótica (infecção ou doença que é transmitida entre animais selvagens). A partir da ação predatória dos seres humanos contra o meio ambiente, como o desmatamento de florestas e, consequentemente, a remoção de animais selvagens, esta infecção adquiriu característica de uma antropozoonose.
Nos últimos anos, a doença de Chagas vem apresentando maior atenção na América do Norte e Europa, devido às imigrações internacionais de áreas endêmicas para áreas não endêmicas (Martins-Melo et al., 2014). É crescente o número de pacientes em países desenvolvidos não endêmicos, como: Austrália, Canadá, Japão, Espanha e Estados Unidos (DNDi, 2015).
A despeito da imposição de programas de Saúde Pública (e.g., controle de vetores) ter diminuído a incidência de novas infecções, esta doença continua sendo endêmica em 21 países da América Latina. A doença de Chagas causa mais mortes nesta região do que qualquer outra doença parasitária (WHO, 2015; DNDi, 2015).
Há uma necessidade de melhores tratamentos para essas doenças devido à alta toxicidade e à baixa eficácia e segurança dos fármacos existentes, além da dificuldade de administração e evolução de resistência (DNDi, 2015; Nwaka & Hudson, 2006). Além disso, não há vacina para a prevenção contra essa doença e o controle do vetor permanece sendo o método mais efetivo de prevenção da transmissão na América Latina (WHO, 2015).
No Brasil, atualmente somente o fármaco benzonidazol é usado e sua eficácia é observada apenas durante a fase aguda da doença. Porém, não há fármacos mais efetivos para o tratamento da fase crônica (Pereira & Navarro, 2013).
3.1.1 EPIDEMIOLOGIA
A incidência anual da doença de Chagas, no mundo, é de 28.000 casos, com cerca de 12.000 mortes por ano. Estima-se que esta doença afeta, aproximadamente, 6 a 8 milhões de pessoas em todo o mundo, principalmente, na América Latina (WHO, 2015; PAHO, 2015). Estima-se que 65 milhões de pessoas vivem em áreas de exposição e estão sob o risco de contrair essa doença nas Américas (PAHO, 2015).
As áreas endêmicas de 21 países latino-americanos incluem: Argentina, Belize, Bolívia, Brasil, Chile, Colômbia, Costa Rica, El Salvador, Equador, Guiana (Britânica), Guiana Francesa, Guatemala, Honduras, México, Nicarágua, Panamá, Paraguai, Peru, Suriname, Uruguai e Venezuela (Relatório OMS, 2010) (Figura 1).
Figura 1. Distribuição de casos de infecção por Trypanosoma cruzi, no mundo, no período de 2006 a 2009 (Adaptado do Relatório OMS, 2010).
No Brasil, apesar da redução da transmissão da doença pelo vetor e por transfusão sanguínea e, consequentemente, a redução da mortalidade, estima-se que ainda existam, aproximadamente, de 2 a 3 milhões de pessoas infectadas, com cerca de 6000 mortes por ano (Martins-Melo et al., 2014).
Porém, o número de pessoas infectadas pode ser maior devido ao fato de muitos dos indivíduos serem assintomáticos, possivelmente, devido à baixa inoculação e/ou resposta imune humoral (Coura & Borges-Pereira, 2010; Pereira & Navarro, 2013).
No Brasil, devido à transmissão vetorial domiciliar ocorrida no passado e hoje interrompida, predominam os casos crônicos. As regiões originalmente de risco para a transmissão vetorial são os estados de Alagoas, Bahia, Ceará, Distrito Federal, Goiás, Maranhão, Minas Gerais, Mato Grosso do Sul, Mato Grosso, Paraíba, Pernambuco, Piauí, Paraná, Rio Grande do Norte, Rio Grande do Sul, Sergipe, São Paulo e Tocantins, onde a vigilância epidemiológica visa detectar a presença e prevenir a formação de colônias domiciliares (WHO, 2015).
No entanto, nos últimos anos, a ocorrência de doença de Chagas aguda tem sido observada em diferentes estados, em especial na região da Amazônia Legal, principalmente, em decorrência da transmissão oral (WHO, 2015). A região da Amazônia Legal abrange os estados do Acre, Amapá, Amazonas, Roraima, Rondônia, Pará, parte do Tocantins, Maranhão e Mato Grosso, locais onde a vigilância epidemiológica é centrada na detecção precoce de casos agudos e surtos (WHO, 2015).
3.1.2 CICLO REPLICATIVO DO TRYPANOSOMA CRUZI
O ciclo replicativo do T. cruzi envolve a passagem obrigatória desse parasita por animais vertebrados (mamíferos, incluindo seres humanos) e invertebrados (triatomíneos hematófagos), nos quais sofrem morfogênese, apresentando diferentes formas evolutivas (Coura e De Castro, 2002) (Figura 2).
Figura 2. Ciclo replicativo do Trypanosoma cruzi (Adaptado de Bern, 2011).
No trato digestivo dos triatomíneos (inseto barbeiro), o T. cruzi sofre transformações sucessivas das formas tripomastigotas para esferomastigotas e epimastigotas (Figura 2A), até se diferenciar na forma infecciosa de tripomastigotas metacíclicos (Figura 2B), que são eliminados por meio das fezes e urina dos vetores (Coura & De Castro, 2002; Coura & Borges-Pereira, 2012). Este processo envolve uma série de mecanismos bioquímicos e imunológicos, em que enzimas, hemolisinas, aglutininas e outros agentes antimicrobacterianos ainda não foram devidamente investigados (Coura & Borges-Pereira, 2012).
As formas tripomastigotas metacíclicas, após a invasão das células hospedeiras de vertebrados, sofrem diferenciação em amastigotas (Figura 2C) para criar pseudocistos que levam à ruptura e dão origem a uma reação inflamatória que gera uma fibrose (Coura & Borges-Pereira, 2012). Com a ruptura dos pseudocistos, novas formas tripomastigotas (responsáveis pela disseminação da infecção) (Figura 2D) são liberadas, circulam no organismo e invadem novas células, repetindo-se o ciclo de replicativo (Coura & Borges-Pereira, 2012). O hospedeiro mamífero infectado pode infectar outros triatomíneos (Coura & Borges-Pereira, 2012; Bern, 2011; Coura & De Castro, 2002).
3.1.3 FASES CLÍNICAS
Na doença de Chagas observam-se duas fases clínicas: uma aguda, que pode ou não ser identificada, que pode evoluir ou não para uma fase crônica, caso não seja tratada com medicação específica (WHO, 2015). Após a infecção e um período de incubação, a fase aguda da doença de Chagas começa e, na ausência de tratamento específico, os sintomas podem persistir por, aproximadamente, dois meses, com uma taxa de mortalidade de 2 a 8%, especialmente, entre crianças (DNDi, 2015; Coura & De Castro, 2002).
Essa fase inicial ou aguda, com parasitemia vista em exames de sangue diretos, na maioria dos casos, é assintomática (Coura & Borges-Pereira, 2010). Nos casos sintomáticos, podem ocorrer febre, adenopatia generalizada, edema, hepatoesplenomegalia, miocardite e meningoencefalite (DNDi, 2015; Coura & Borges-Pereira, 2010), que muitas vezes desaparece, espontaneamente, em quatro a seis semanas (DNDi, 2015).
Os parasitas depositados sobre a pele ferida ou sobre a mucosa estimulam uma reação inflamatória com uma resposta linforeticular (Coura & Borges-Pereira, 2010). Os tripomastigotas circulantes, absorvidos por macrófagos, são transportados para diversos órgãos e sistemas, como fígado, baço, gânglios linfáticos, músculo cardíaco e esquelético, formando ninhos de amastigotas. Com o desmembramento dos pseudocistos no miocárdio, ocorre miocardite aguda (Coura e Borges-Pereira, 2010). Dentro de dias a duas semanas, podem ser detectados no soro a presença de complexos imunes, além de necrose nos focos inflamatórios. A inflamação grave é acompanhada de necrose de células parasitadas e não parasitadas, especialmente, no coração. Foram relatados também, agregação plaquetária, degranulação de eosinófilos, edema, trombose, estagnação do sangue e isquemia (Coura & De Castro, 2002).
A reação inflamatória leva a destruição de células dos músculos e neurônios, e é mantida pela presença de T. cruzi (ou fragmentos e DNA do parasita), com uma reação de hipersensibilidade tardia, promovendo dilatação da microcirculação e fibrose, induzindo assim, a cardiopatia crônica, arritmias, megaesôfago e megacólon (Coura & Borges-Pereira, 2010).
Após a infecção aguda, o paciente apresenta forte evidência de imunidade, mas tem uma tendência para permanecer infectado (Coura & De Castro, 2002).
A fase crônica apresenta duas fases: uma indeterminada ou assintomática e uma fase sintomática (Coura e Borges-Pereira, 2010; Coura & De Castro, 2002).
Na fase indeterminada, que pode durar cerca de 10 anos, os pacientes podem transmitir o parasita apesar de não apresentarem sinais da doença. (DNDi, 2015). Nesta fase, cerca de 40% ou 50-90% dos indivíduos infectados permanecem com exames radiológicos normais, completamente
assintomáticos e eletrocardiogramas sem anormalidades (Coura & Borges-Pereira, 2010). Entretanto, esse quadro pode evoluir para uma forma cardíaca ou digestiva ou, até mesmo, uma associação de formas cardíacas e digestivas (Coura & Borges-Pereira, 2010; Coura & De Castro, 2002).
A fase sintomática ocorre em 10% a 30% dos pacientes infectados e, na maioria das vezes, acomete coração ou trato gastrintestinal. A doença de Chagas é uma das principais causas de cardiomiopatia infecciosa em todo o mundo (DNDi, 2015).
A forma cardíaca crônica é a manifestação clínica mais significativa da doença de Chagas, devido à frequência e gravidade, ocorrendo, geralmente, entre a segunda e a quarta décadas de vida, 5 a 15 anos após a infecção inicial. Os sinais e sintomas de cardiomiopatia chagásica crônica são devido à arritmia, insuficiência cardíaca, bloqueio atrioventricular e tromboembolismo (Coura & Borges-Pereira, 2010).
3.1.4 TRATAMENTO
Atualmente, os fármacos comercialmente disponíveis para o tratamento contra a doença de Chagas são os nitro-heterociclos nifurtimox (1) e benzonidazol (2) (Figura 3), que possuem eficiência comprovada apenas contra a forma extracelular do parasita, durante a fase aguda e na fase crônica recente da infecção, fato caracterizado como um problema, pois a maioria dos casos somente é diagnosticada na fase crônica (De Carvalho et al., 2014).
Outros complicadores do tratamento são custo elevado, longa duração, resistência e toxicidade (De Carvalho et al., 2014). Além disso, podem causar diversos efeitos adversos importantes, como anorexia, perda de peso, vômito, náusea e diarreia. Desta forma, faz-se necessário uma apresentação acessível financeiramente, segura e eficaz para tratar pacientes no início da infecção (DNDi, 2015).
Figura 3. Estruturas químicas dos fármacos nifurtimox e benzonidazol utilizados no tratamento contra a doença de Chagas. Em destaque o anel nitrofurano do fármaco nifurtimox e anel nitroimidazol do fármaco benzonidazol.
O nifurtimox é um nitrofurano, cujo mecanismo de ação parece envolver a produção de um radical nitroânion que, na presença de oxigênio molecular, reduz a capacidade do parasita metabolizar os radicais livres que atuam sobre ele (Campo & Moreno, 1986).
Esse fármaco foi empregado em toda a América Latina como tratamento de primeira linha contra a doença de Chagas na fase aguda. No entanto, devido aos efeitos adversos no trato gastrointestinal e sistema nervoso central (SNC), baixa eficácia e efeitos genotóxicos, seu uso foi descontinuado no Brasil, Argentina, Chile e Uruguai (Wilkinson et al., 2011).
O benzonidazol, um nitroimidazol, não induz um nível significativo de consumo de oxigênio e produção de radicais livres. Uma das propostas de mecanismo de ação é que ele sofre redução pela enzima nitrorredutase tipo I (NTR-I), gerando um intermediário nitroso, atuando através da ligação dos seus metabólitos ao ácido desoxirribonucléico (DNA) do parasita, e aos seus lipídios e proteínas (Coura e Borges-Pereira, 2012).
Como não há vacina para a prevenção contra a doença de Chagas, o benzonidazol é, atualmente, o fármaco de escolha para a fase inicial dessa doença (WHO, 2015). E, embora seja considerado um tratamento mais seguro do que o nifurtimox, é igualmente genotóxico e pode causar uma variedade de efeitos adversos que vão desde dermatite até agranulocitose (Wilkinson et al., 2011). Assim, há uma necessidade de melhores tratamentos para essa doença (DNDi, 2015; Nwaka & Hudson, 2006).
3.2 NITROIMIDAZÓIS
Os derivados nitroimidazóis têm sido objeto de muito interesse na Química Medicinal ao longo dos anos, devido ao amplo espectro de atividades farmacológicas. São comumente utilizados como agentes terapêuticos antibacteriano, antifúngico e antiprotozoário (Olender et al., 2009; Li et al., 2012; Patterson & Wyllie, 2014).
Estudos recentes estão sendo realizados para investigar o uso de nitroimidazóis no tratamento do câncer, como modificadores químicos, devido à sua afinidade para tumores hipóxicos
e podendo atuar como marcadores de regiões hipóxicas em tumores sólidos (Ragnum et al., 2015;
Dhani et al., 2015; Lu et al., 2013).
Um importante nitroimidazol é o benzonidazol, fármaco utilizado para o tratamento da doença de Chagas. Outro importante nitroimidazol é o megazol (3), que apresenta atividade contra T. cruzi, sendo mais ativo do que nifurtimox e benzonidazol, porém não é clinicamente utilizado
devido aos seus efeitos mutagênicos e genotóxicos. O megazol também apresenta atividade inibitória contra Trypanosoma brucei (De Carvalho et al., 2014).
Estudos indicam que o grupamento nitro do anel imidazol, presente no benzonidazol e no megazol, é importante alvo para ação de enzimas nitrorredutases dos parasitas (De Carvalho et al., 2014). O mecanismo de ação do megazol estaria relacionado com a inibição da síntese de DNA em amastigotas de T. cruzi e também parece interferir no metabolismo do oxigênio no parasita (Mello et al., 2013).
Desta forma, o megazol se apresenta como um bom protótipo para novos análogos, nos quais poderiam ser mantidas as atividades contra os tripanossomas (De Carvalho et al., 2014).
Figura 4. Estrutura química do megazol. Em destaque, o anel nitroimidazol que pode sofrer ação das enzimas nitrorredutases.
3.3 NITRORREDUTASES
As nitrorredutases (NTR) compreendem uma família de enzimas que reduzem uma ampla gama de compostos nitroaromáticos. Essas enzimas podem ser encontradas em bactérias e, em menor escala, em fungos, protozoários e mamíferos (Hall & Wilkinson, 2012). Utilizam flavina mononucleotideo (FMN) ou flavina adenina dinucleotídeo (FAD) como grupo prostético e nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD(P)H) como agente redutor, fonte de elétrons, para metabolizar nitrocompostos (Hall & Wilkinson, 2012; De Carvalho et al., 2014; Oliveira, 2013).
Devido à capacidade de metabolização e ativação de nitrocompostos, as NTRs foram identificadas como alvos para a erradicação de vários patógenos pelo uso de antibióticos nitrofuranos (e.g., nifurtimox) e nitroimidazois (e.g., benzonidazol) (Cortial et al., 2010).
Ao longo dos anos, houve um grande interesse por esta proteína em decorrência das aplicações em biorremediação, biocatálise e biomedicina, especialmente, na ativação de pró-fármacos em tratamentos quimioterápicos contra o câncer (Roldán et al., 2008).
metabolismo de fármacos nitroheterocíclico em T. cruzi e T. brucei. Células de parasitas com níveis reduzidos de nitrorredutase tipo I apresentam resistência a vários agentes nitroheterocíclicos, incluindo benzonidazol (Hall &Wilkinson, 2012).
As NTRs são proteínas homodiméricas, com subunidades constituídas por hélice-α e folhas-β, que se unem, formando uma cavidade hidrofóbica, onde está localizado o grupo prostético e o sítio ativo da enzima (Kobori et al., 1999; Koike et al., 1998; Oliveira, 2013; Race et al., 2005). Na Figura 5, é apresentada a estrutura 3D da enzima nitrorredutase tipo I (Koike et al., 1998; Oliveira, 2013).
Figura 5. Estrutura 3D da enzima nitrorredutase tipo I de Escherichia coli (PDB: 1YKI). Em destaque, as hélices-α (vermelho), as folhas- β (azul) e cofator flavina mononucleotídeo (FMN) (modelo bastão; átomos de carbono em cinza; átomos de oxigênio em vermelho; átomos de nitrogênio em azul) na interface do homodímero. Programa utilizado: DSV-Discovery Studio Visualizer (Accelrys, Inc.).
O grupo prostético FMN está ligado na interface do dímero e interage com resíduos de ambos os monômeros, formando ligação de hidrogênio com uma subunidade e contato hidrofóbico com ambos. Este conjunto de interações com o FMN é bem conservado em todas as nitrorredutases e envolve resíduos idênticos ou similares (Koike et al., 1998; Oliveira, 2013; Parkinson et al., 2000; Race et al., 2005).
Primeiramente, o NADH substrato deve entrar, ser oxidado e deixar NAD +. A transferência de hidreto deve proceder via FMN. Estudos anteriores demonstraram que o átomo N5 do cofator FMN é candidato para receber o hidreto de NAD(P)H (Parkinson et al., 2000; Race et al., 2005).
As nitrorredutases são classificadas em duas classes, tipo I ou insensíveis ao oxigênio (NTRI) e tipo II ou sensíveis ao oxigênio (NTRII) (Kobori et al., 1999; Hall & Wilkinson, 2012).
As NTRs reduzem o grupo nitro pela transferência de 2 elétrons do NADH para o substrato alvo, formando um intermediário nitroso e, em seguida, promovem uma segunda redução para gerar uma hidroxilamina. Este derivado pode interagir diretamente com macromoléculas biológicas, levando a danos celulares, ou submetido a mais reações até gerar agentes citotóxicos (Kobori et al., 1999; Hall &Wilkinson, 2012; De Carvalho et al., 2014).
As NTRII promovem a redução do grupo nitro, via um mecanismo de um elétron, levando à formação de um nitroânion radical. Na presença de oxigênio, esta espécie é rapidamente reoxidada ao composto nitro, com a concomitante produção de ânion superóxido, que pode causar danos oxidativos às células. A maioria dos pró-fármacos podem sofrer ativação por nitrorredutases tipos I e II (Kobori et al., 1999). O nifurtimox e o benzonidazol são pró-fármacos que sofrem ativação por nitrorredutases. O nifurtimox pode ser reduzido em condições anaeróbias e aeróbias. O benzonidazol sofre redução apenas em condições anaeróbias (Patterson & Wyllie, 2014) (Figura 6).
Estudos demonstraram que esta enzima desempenha um papel fundamental no metabolismo nitroheterocíclico de fármacos em T. cruzi. Células com níveis reduzidos de NTRI apresentam resistência a vários agentes nitroheterocíclicos, incluindo benzonidazol (Hall & Wilkinson, 2012).
Figura 6. Mecanismo de ação das nitrorredutases tipo I (NTRI) e tipo II (NTRII) em um exemplo de composto nitroaromático (1). As NTRI podem transferir dois elétrons de NAD(P)H para formar um intermediário nitroso (2) e hidroxilamina (3) e finalmente, o grupo amino (4). As NTRII transferem um elétron ao grupo nitro, formando um nitroânion (5) que, em presença de oxigênio, gera o ânion superóxido e regenera o grupo nitro em um ciclo redox (Adaptado de Oliveira, 2013).
A sequência de reações envolvidadas na redução do grupo nitro a aminas produz intermediários altamente reativos. Os grupos nitroso e hidroxilamino são eletrófilos que podem interagir com biomoléculas e causam efeitos tóxicos, carcinogênicos e mutagênicos (Oliveira, 2013).
3.4 MODELAGEM MOLECULAR
A modelagem molecular é um conjunto de técnicas para investigação das estruturas e das propriedades moleculares por química computacional, incluindo a construção, edição, visualização, análise de sistemas moleculares que podem ser fundamentais no planejamento de compostos bioativos (Sant’Anna, 2002; Cohen et al., 1990; Eliezer et al., 1997).
Ao longo de décadas, a descoberta de novos compostos bioativos era proveniente da descoberta de produtos naturais ou por síntese. Em seguida, as estratégias se baseavam em tentativa e erro, por modificações estruturais de moléculas, a fim de se obter substâncias com melhor perfil de atividade (Leland & Joshua, 2003).
Na modelagem molecular podem ser utilizadas duas estratégias. A primeira consiste na análise das propriedades tridimensionais do receptor. E a segunda, é baseada na análise comparativa das propriedades estruturais de moléculas conhecidas (Sant’Anna, 2009).
Os métodos usados na modelagem molecular para análise de estruturas e propriedades de moléculas individuais compreendem os métodos de mecânica quântica e de mecânica molecular (Leach, 2001).
3.4.1 MÉTODOS DE MECÂNICA QUÂNTICA
Os métodos da mecânica quântica consideram a população eletrônica da molécula nos cálculos, sendo a energia obtida por equações da mecânica ondulatória, que remontam a equação de Schrödinger, considerando a natureza ondulatória dos elétrons no cálculo de energia total do sistema (Leach, 2001). Desta forma, é possível obter propriedades que dependam da distribuição eletrônica e, assim, investigar reações químicas em que ligações são quebradas e formadas (Leach, 2001).
Entretanto, cálculos de mecânica quântica consomem muito tempo porque levam em consideração todos os elétrons da molécula, que são descritos por múltiplas funções de base. Desta forma, podem não ser viáveis em determinados sistemas (Leach, 2001). Dois métodos principais possuem aplicação em química computacional para fornecer parâmetros quânticos: ab initio e semi-empírico.
O método ab initio é a principal abordagem para calcular propriedades eletrônicas, pois utiliza todos os elétrons da molécula. O tipo mais comum de cálculo ab initio é baseado no método de Hartree-Fock, no qual uma aproximação primária é aplicada às repulsões elétron-elétron, sem desprezar ou aproximar qualquer dos termos ou integrais empregados no operador Hamiltoniano. O método Hartree-Fock fornece informações mais precisas e rigorosas sobre o comportamento eletrônico, porém, apresenta como desvantagem o elevado tempo computacional para os cálculos em relação aos métodos semi-empíricos. Porém, uma alternativa ao método ab initio é a Teoria Funcional da Densidade (Density Functional Theory, DFT), em que a energia total é expressa em termos da densidade eletrônica total, em vez da função de onda. A vantagem da abordagem DFT é o menor custo computacional (Leach, 2001).
O método ab initio utiliza equações exatas, podendo ser aplicado a moléculas relativamente pequenas e, por ser mais exato, requer grande capacidade de memória e tempo de cálculo do computador (Leach, 2001). Esse modelo emprega um conjunto de funções de bases nos cálculos. Uma função de base mínima conteria exatamente o número de funções necessárias para acomodar todos os orbitais preenchidos de um átomo. Na prática, uma base mínima inclui todos os orbitais atômicos em uma camada (Leach, 2001).
O uso de bases quânticas contendo funções de polarização é indicado por um asterisco (*). Assim, 6-31G* refere-se à base quântica 6-31G com funções de polarização para átomos pesados
(isto é, não hidrogênio). Esses métodos utilizam conjuntos de bases quânticas nos cálculos (Leach, 2001). Dois asteriscos (e. g., 6-31G**) indicam a aplicação de funções de polarização (isto é, orbital p) para os átomos de hidrogênio e hélio. A base 6-31G** é particularmente útil onde ocorrem ligações hidrogênio (Leach, 2001).
Os métodos semi-empíricos consideram apenas os elétrons da camada de valência em seus cálculos, já que são os elétrons da camada de valência que estão envolvidos numa ligação química (Leach, 2001). Desta forma, os cálculos são mais simplificados e possibilitam a redução do tempo computacional (Cohen et al., 1990).
3.4.2 MÉTODO DE MECÂNICA MOLECULAR
A mecânica molecular é um dos métodos mais utilizados em modelagem molecular, devido à simplicidade e demanda de menor tempo computacional. Neste método, os elétrons são ignorados e o que é considerado é a posição relativa dos núcleos dos átomos que formam uma estrutura, determinada por uma função de interação, que tem origem das forças de atração e repulsão que operam na estrutura. A soma de todas as energias de forças atrativas e repulsivas entre os átomos na estrutura é dada pela energia potencial total de uma molécula, conhecida como campo de forças (Leach, 2001; Luciana et al., 2007).
Um campo de forças descreve diferentes classes de moléculas com razoável precisão. A confiabilidade nos cálculos de mecânica molecular é dependente de funções de energia potencial das contribuições estruturais como, comprimentos de ligação, ângulos de ligação, ângulos diedros e interações não ligadas e da qualidade dos parâmetros incorporados a estas funções (Halgren, 1996).
3.4.3 ANÁLISE CONFORMACIONAL
As propriedades físicas, químicas e biológicas de uma molécula dependem da estrutura tridimensional ou conformação que adota. Naturalmente, o arranjo dos átomos e da própria molécula não é fixo no espaço e resultam da rotação em torno de uma ou mais ligações simples. Desta forma, o estudo dos arranjos espaciais (conformações) energeticamente favoráveis de uma molécula, em que conformações de menor energia (mais estáveis) são encontradas em maior proporção, é chamada de análise conformacional (Leach, 2001; Sant’Anna, 2002; IUPAC, 1997).
As moléculas desenhadas de forma tridimensional não estão, necessariamente, na conformação mais estável. Desta forma, estas distorções são otimizadas pelo processo de minimização de energia, a fim de identificar as conformações preferenciais de uma molécula. Assim, interações não previsíveis, relacionadas à sobreposição de orbital molecular, distribuição de
densidade eletrônica ou interferências estéricas podem ser solucionadas por métodos computacionais (Leach, 2001).
A análise conformacional pode ser realizada utilizando métodos computacionais sistemáticos ou aleatórios. No método sistemático, a busca conformacional é baseada na análise combinatória de todos os possíveis ângulos de torção da molécula. A busca sistemática explora as conformações de menor energia, combinando sistematicamente todos os ângulos de torção relevantes da molécula (Leach, 2001).
No método aleatório, a investigação se dá através de movimentos aleatórios nas posições dos átomos. As estruturas geradas são aceitas ou não de acordo com janelas energéticas definidas pelo analista em diferentes etapas do algoritmo de busca conformacional. O método randômico de busca conformacional utiliza um gerador numérico randômico, que seleciona várias conformações a fim de obter uma descrição estatística do sistema. O método de Monte Carlo é um método randômico que pode ser usado para explorar o espaço conformacional (Leach, 2001).
3.5 MODELAGEMMOLECULARDEPROTEÍNAS
As estruturas tridimensionais de novos alvos moleculares são de grande importância para a compreensão dos detalhes estruturais do sítio ativo de proteínas e dos fenômenos biológicos no planejamento de fármacos. Os modelos virtuais são importantes e podem ser elaborados pela comparação de sua estrutura primária a uma ou mais estruturas resolvidas, disponíveis em um banco de dados, como o PDB. Experimentalmente, a estrutura de proteínas é obtida por técnicas de difração de raios X e de ressonância magnética nuclear (RMN). Os principais métodos teóricos de predição de estrutura 3D de proteínas são: Modelagem Comparativa; Predição de Enovelamento de Proteínas (threading) e Predição por Primeiros Princípios (ab initio) (Echenique, 2007; Šali & Blundell, 1993).
3.5.1 MODELAGEM COMPARATIVA
A modelagem comparativa é um método de construção de modelos tridimensionais de uma proteína, que se baseia no conceito de evolução molecular, ou seja, proteínas com sequências primárias semelhantes apresentam estruturas tridimensionais similares. Esta técnica baseia-se nos padrões estruturais conservados que são observados em proteínas com estruturas primárias similares, geralmente, membros da mesma família (Echenique, 2007). A construção da estrutura tridimensional de uma proteína alvo, a partir de sua estrutura primária de aminoácidos, depende do
reconhecimento da similaridade das estruturas, com base no alinhamento entre sua sequência e a sequência de uma ou mais proteínas, cujas estruturas tridimensionais são conhecidas experimentalmente (proteína-molde) (Rayan, 2009).
A partir de um ou mais moldes é possível gerar a estrutura 3D da proteína em estudo, resultando em um modelo inicial da estrutura que pode ser otimizado. A qualidade do modelo está relacionada com a quantidade de resíduos idênticos entre a proteína-molde e a proteína-modelo (Sant’Anna, 2002).
A modelagem comparativa é um método preciso para a construção do alvo molecular e é indicada quando há similaridade de sequências superior a 25-30% para a construção da estrutura tridimensional do alvo molecular (Cavasotto & Phatak, 2009; Rayan, 2009; Sali & Blundell, 1993).
Para a construção de um modelo por modelagem comparativa, as seguintes etapas são seguidas: identificação de uma ou mais estruturas de referência (molde), resolvidas experimentalmente; alinhamento da sequência alvo com as sequências das proteínas de referência; construção do modelo com base no alinhamento entre as sequências alvo e de referência (Cavasotto & Phatak, 2009; Sali & Blundell, 1993).
O programa Modeller (Šali & Blundell, 1993) é utilizado para a construção de proteínas por modelagem comparativa usando proteínas moldes disponíveis no PDB. A partir do alinhamento entre a sequência alvo e a sequência molde, é gerado um conjunto de restrições espaciais que são aplicadas a sequência a ser modelada. Estas restrições podem ocorrer, por exemplo, em distâncias, ângulos de ligação e ângulos diedros (Martí-Renom et al., 2000).
O servidor SWISS-MODEL também realiza a construção tridimensional de proteínas em um processo automatizado de modelagem comparativa entre uma proteína alvo e proteínas moldes e, além disso, utiliza predição ab initio para partes do modelo, como inserções e deleções (Guex e Peitsch, 1997). Utiliza a metodologia de corpos rígidos para a construção de modelos. Desta forma, o modelo de proteína é construído por partes. Baseia-se nas regiões estruturalmente conservadas das proteínas homólogas para realizar as transferências de coordenadas das proteínas moldes para a construção da proteína de interesse (Goldsmith‐Fischman & Honig, 2003).
3.5.2 PREDIÇÃO DE ENOVELAMENTO DE PROTEÍNAS
O método de Predição de Enovelamento de Proteínas (threading) tenta ajustar a estrutura da proteína de interesse aos tipos de enovelamentos de proteínas conhecidas, ou seja, registradas e depositados em bibliotecas de enovelamentos. É utilizado para aquelas sequências de proteínas que não possuem proteína homóloga no banco de dados ou que apresentem identidade baixa (Ambrish et al., 2010; Zhang, 2008).
O servidor I-Tasser gera modelos tridimensionais de proteínas por alinhamento de múltiplos fragmentos, agrupamento e refinamento (Ambrish et al., 2010; Zhang, 2008). No alinhamento de múltiplos fragmentos ocorre uma busca em um banco de dados de estruturas de proteínas e, a partir disso, os pequenos fragmentos de estrutura tridimensional conhecida são alinhados com a sequência de interesse (Ambrish et al., 2010; Zhang, 2008). No agrupamento, os fragmentos gerados no alinhamento são reunidos e organizados em uma estrutura tridimensional, por simulações de Monte Carlo, a fim de se obter um modelo otimizado (Ambrish et al., 2010; Zhang, 2008). A etapa de refinamento possui a finalidade de eliminar os impedimentos estéricos. Desta forma, são selecionados os cinco principais confôrmeros gerados na fase de agrupamento e um novo agrupamento é realizado. Neste novo agrupamento, as cadeias laterais são adicionadas e um novo passo de refinamento é realizado (Yang et al., 2015; Roy & Zhang, 2010; Zhang, 2008).
3.6 VALIDAÇÃO
A validação do modelo construído permite a avaliação e a identificação de possíveis erros durante o processo de construção. Alguns parâmetros podem ser avaliados, entre eles, a qualidade estereoquímica dos aminoácidos e a qualidade geral do enovelamento da proteína. Assim, a validação é importante para se obter o nível de qualidade e confiabilidade do modelo de proteína construído.
Diversos programas de validação estão disponíveis, como Procheck (Laskowski et al., 1993), Errat (Colovos & Yeates, 1993) e Verify-3D (Eisenberg et al., 1992).
O Prochek avalia parâmetros estereoquímicos, como comprimentos de ligação, ângulos de ligação e ângulos torcionais da cadeia principal, gerando o gráfico de Ramachandran (Anderson, 2003), que define os resíduos que se encontram nas regiões energeticamente mais favoráveis e desfavoráveis. O gráfico de Ramachandran apresenta uma correlação entre os ângulos torcionais φ (phi) e ψ (psi), que são os responsáveis por toda a variação conformacional da cadeia principal da estrutura proteica (Anderson, 2003). Considera-se como precisão para um modelo gerado, no mínimo, 90% dos ângulos φ e ψ da cadeia principal na região mais favorável do gráfico de Ramachandran (Anderson, 2003).
O servidor Verify-3D avalia se a estrutura tridimensional do modelo construído está correta. Avalia a compatibilidade entre a sequência de aminoácidos de uma proteína e o modelo de sua estrutura tridimensional, utilizando a determinação dos ambientes químicos de cada resíduo do modelo em relação a uma matriz de referência, construída a partir de uma análise estatística envolvendo estruturas de proteínas armazenadas no PDB (Eisenberg et al., 1992).
O programa Errat promove uma análise estatística de interações entre átomos não-ligados, em comparação com uma base de dados de estruturas de alta resolução e gera um valor de fator de qualidade global. Para estruturas de alta resolução, geralmente, produzem valores de cerca de 95%. Para resoluções mais baixas, (2,5 a 3A), o fator de qualidade média global é de cerca de 91% (Colovos & Yeates, 1993).
3.7 DOCAGEMMOLECULAR
A docagem molecular realiza a simulação dos modos de ligação (conformação e orientação) e estima as respectivas energias de interação entre duas moléculas como, ligante-proteína, proteína-proteína e proteína-DNA (Andricopulo et al., 2009). Existem diversos programas de docagem molecular, como AutoDock (Morris et al., 1998) e GOLD (Jones et al., 1997). As diversas soluções (poses) encontradas correspondem a diferentes conformações e orientações do ligante dentro de cavidades na proteína. As soluções com menores valores de energia de interação ou do conjunto mais populoso (cluster mais populoso) são classificadas como as melhores soluções (Douglas et al., 2004; Pyrkov et al., 2010).
O processo de reconhecimento molecular é um processo dinâmico e complexo, envolvendo um grande número de interações intermoleculares entre o ligante, a macromolécula receptora e o solvente. Devido à flexibilidade, os ligantes e a macromolécula sofrem mudanças conformacionais, o que implica no tratamento de um número elevado de graus de liberdade por parte dos algoritmos de docagem molecular. Isto pode levar a aumento do custo e tempo computacional (Leach, 2001).
Os programas de docagem têm dois tipos de funções: função de busca para a predição da orientação e conformação do ligante e função de pontuação para a classificação das poses de acordo com o modo de interação ligante-proteína (Leach, 2001).
3.7.1 FUNÇÕES DE BUSCA
Os programas de docagem molecular, em geral, tratam da flexibilidade do ligante, em relação aos graus de liberdade translacionais e rotacionais e aos graus de liberdade conformacionais (Douglas et al., 2004; Morris et al., 1998).
Os métodos de busca utilizados nos algoritmos de docagem molecular podem ser classificados em três: métodos sistemáticos, determinísticos e estocásticos.
A busca sistemática utiliza algoritmos que exploram os valores para cada grau de liberdade da molécula de forma combinatória durante a busca. A busca determinística é caracterizada pela produção da conformação final em dependência da estrutura inicial do ligante. Sendo assim, a conformação inicial determina os próximos passos para gerar uma nova conformação. Os métodos
de minimização de energia e as simulações por dinâmica molecular são exemplos de métodos determinísticos (Douglas et al., 2004; Leach, 2001).
A busca estocástica utiliza algoritmos que realizam mudanças aleatórias em um único ligante ou em uma população de ligantes para exploração dos graus de liberdade. A maior parte desses métodos não garante a convergência e requerem múltiplas execuções. Os algoritmos genéticos e o método de Monte-Carlo são exemplos de algoritmos estocásticos que estão disponíveis em programas como Autodock 4.0 (Morris et al., 1998) e GOLD (Jones et al., 1997).
3.7.2 FUNÇÕES DE PONTUAÇÃO
As funções de pontuação são utilizadas como estimativas da afinidade de interação entre ligante e macromolécula em cada pose obtida por docagem molecular. É através da função de pontuação que se diferencia o provável modo de ligação do ligante com o receptor alvo, dentre as diversas poses encontradas por determinado algoritmo.
As funções de pontuação utilizados nos algoritmos de docagem molecular podem ser classificadas em três: funções baseadas em campos de força, funções empíricas e funções baseadas em conhecimento prévio (Thomsen & Christensen, 2006; Zsoldos et al., 2006)
As funções de pontuação baseadas em campos de força utilizam a soma das energias de interação entre o ligante e a proteína e a energia interna do ligante. São derivadas dos campos de forças desenvolvidos para reproduzir as propriedades conformacionais, termodinâmicas e cinéticas de complexos ligante- proteína (Douglas et al., 2004; Moitessier et al., 2008).
As funções empíricas utilizam o princípio de que a energia livre de ligação pode ser decomposta pela soma de variáveis, como interações de ligações de hidrogênio, interações hidrofóbicas, entrópicas e outras (De Azevedo e Dias, 2008; Eldridge et al., 1997).
As funções baseadas em conhecimento são desenvolvidas utilizando-se potenciais de interação entre pares atômicos. Estas funções são desenvolvidas a partir de análises estatísticas de complexos cristalográficos. As funções baseadas em conhecimento tendem a capturar efeitos de ligação mais específicos. Porém, como estas funções dependem de estruturas experimentais, o uso destas funções torna-se mais restrito (Gohlke et al., 2000; Muegge, 2006; Velec et al., 2005). As funções de pontuação podem apresentar avaliações de afinidade não precisas, pois apresentam simplificações em relação às contribuições de solvatação e entropia (Moitessier et al., 2008).
3.7.3 PROGRAMA AUTODOCK
O AutoDock é um programa gratuito projetado para prever como moléculas pequenas, como substratos ou candidatos a fármacos, se ligam a um receptor de estrutura 3D conhecida. Ele também é utilizado para docagem molecular cega, em que a localização do sítio de ligação não é conhecida (Morris et al., 1998).
O algoritmo genético, utilizado em simulações de docagem molecular, é um método de amostragem baseado na teoria evolutiva da seleção natural, proposta por Darwin. A teoria de Darwin fundamenta-se no fato de que os indivíduos mais aptos apresentam mais chances de sobreviver e, assim, os indivíduos menos aptos são excluídos (Morris et al., 1998).
No processo de busca conformacional, uma população de indivíduos é gerada e, cada indivíduo, também chamado de solução, representa uma possível configuração do ligante em relação à macromolécula. Esta configuração do ligante representa um cromossomo, que é constituído por genes e que, por sua vez, representam os graus de liberdade translacional, orientacional e conformacional (Morris et al., 1998; Taylor et al., 2002).
Operadores genéticos como mutação, crossover e migração são utilizados no processo de busca conformacional. O operador de mutação promove mudanças aleatórias nos valores dos genes. O operador crossover promove trocas de um conjunto de genes de um cromossomo pai por outro. E o operador de migração promove a mudança de um gene de uma subpopulação para outra (Morris et al., 1998; Taylor et al., 2002).
A energia de interação do ligante em relação à macromolécula é avaliada e, desta forma, é atribuído uma determinada pontuação às soluções obtidas. Aquelas de melhor pontuação serão submetidas a processos de recombinação e mutação e, assim, gerar novas soluções (Morris et al., 1998).
Para os cálculos de energia de interação do ligante à macromolécula, o programa Autodock utiliza o Autogrid. Assim, a região do sítio ativo é selecionada no interior de uma grade tridimensional de pontos posicionados regularmente. Então, a afinidade atômica de cada átomo da molécula do ligante em relação a cada ponto de interação da macromolécula inserido nesta grade é calculada por um mapa de energia (Halperin et al., 2002; Huey et al., 2007; Morris et al., 1998).
Ao final do processo de docagem molecular, as soluções semelhantes são agrupadas em conjuntos de poses (clusters) e estes sãos ordenados de acordo com a energia de cada grupo. A diferença entre as conformações é medida pelo valor de RMSD (do inglês, Root Mean Square Deviation, ou seja, Desvio Quadrático Médio das Distâncias) (Morris et al., 1998).
