Validação analítica

Os métodos desenvolvidos para a análise dos enantiômeros do metilfenidato em plasma humano foram validados de acordo com as recomendações da ANVISA (2012) para a validação de métodos bioanalíticos, incluindo os testes para seletividade, especificidade, linearidade, precisão e exatidão. As amostras de controle de qualidade (CQ) foram usadas para validar e monitorar o desempenho do método bioanalítico. A amostra de controle de qualidade de alta concentração (CQA) foi calculada na concentração entre 75 (setenta e cinco) e 85% (oitenta e cinco por cento) da maior concentração da curva de calibração. A amostra de controle de qualidade de baixa concentração (CQB) tinha concentração até três vezes o limite inferior de quantificação do método (LIQ). A amostra de controle de qualidade de média concentração (CQM) tinha concentração próxima à média entre os limites inferior e superior de quantificação.

A especificidade foi determinada por extratos de plasma livre de analito e de extratos de plasma adicionados de metilfenidato padrão. A linearidade foi avaliada por análise de regressão linear simples obtida no intervalo de 1,25 a 25 µg de cada isômero por mL de plasma. As curvas de calibração dos isômeros d-metilfenidato (D-MFD) e l-metilfenidato (L- MFD) foram construídas e avaliadas em triplicata, sendo avaliada também a amostra do plasma livre de analito (branco).

A precisão e exatidão intraensaio foi realizada usando-se cinco alíquotas de cada amostra de controles de qualidade de concentrações baixa, média e alta, através de uma única curva de calibração para cada isômero do MFD. Para a avaliação da precisão e exatidão interensaio foram analisadas cinco alíquotas de cada amostra de controles de qualidade para cada isômero durante três ensaios consecutivos. Para determinação dos Controles de Qualidade Baixo, Médio e Alto, com concentrações de 2,5; 10 e 20 µg de cada isômero por mililitro de plasma, respectivamente, foram adicionados 25 µl de solução de racêmico metilfenidato nas concentrações de 100, 400 e 800 µg/mL de metanol a 500 µl de plasma.

A recuperação das amostras foi avaliada através dos controles de qualidade de concentrações baixa (CQB), média (CQM) e alta (CQA), dividindo-se o extraído pelo adicionado e multiplicando-se por 100 (CASSIANO et al., 2009). O limite de quantificação (LQ) foi obtido pela análise das amostras com concentrações de 1,25 µg de cada isômero por mL de plasma, adicionando-se 25 µl da solução de 50 µg de racemato de metilfenidato por mL de metanol a 500 µl de plasma.

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Desenvolvimento do método

O tratamento das amostras de plasma por extração líquido-líquido, utilizando-se o ciclohexano foi realizado em torno de 1 hora e o procedimento foi baseado em Teicher (2006) e Tuerck (2007). Como o analito tem natureza polar, o método cromatográfico em fase reversa, mostrou-se adequado.

A ordem de eluição para separação enantiomérica foi descrita com base na literatura (ZHU et al., 2011). Os tempos de retenção foram de 7,0 e 8,1 minutos para o L-MFD e D- MFD, respectivamente, onde o primeiro pico refere-se L-MFD e o segundo pico ao D-MFD (Fig. 2), tendo adequada separação de linha de base dos picos de interesse.

A fase estacionária mostrou-se eficiente para a separação dos enantiômeros, sendo que variações na fase móvel foram testadas, sendo que a mistura metanol / acetato de amônio 92:08, v/v ; 20 mM pH 4,1 proporcionou melhor resolução dos picos e menor tempo de retenção. O fluxo foi de 1 mL/min, com o espectro UV em 215 nm (FIGURA 2).

FIGURA 2. Separação enantiomérica por UPLC do racemato de metilfenidato. Coluna CHIROBIOTIC V2 (5, 150x 4,6mm). Fase móvel: metanol / acetato de amônio (92:08, v/v ; 20 mM pH 4,1). Fluxo: 1mL/min; volume de injeção: 25 L. Comprimento de onda de 215 nm.. Concentração MFD racêmico: 200g/mL.

FIGURA 3. Espectro UV 215 nm de amostra de plasma contendo 10g/mL de racemato MFD.

4.2 Linearidade

As curvas de calibração foram construídas correlacionando-se a área e a concentração, utilizando seis concentrações que variaram de 1,25-25,0 µg/mL de plasma para o L-MFD e D- MFD. A linearidade foi satisfatória para ambos os enantiômeros (FIGURA 4). A recuperação do método foi de 80 % para o L-MFD e 75 % para o D-MFD.

4.3 Validação

O limite de quantificação estabelecido foi de 1,25 µg de cada isômero/mL de plasma, cujos dados de precisão e exatidão foram estabelecidos através de dados do Coeficiente de Variação (CV%) para a precisão, os quais foram de 9,1 e 11,9 para o L-MFD e D-MFD, respectivamente e Erro Padrão Relativo (EPR) para exatidão, os quais foram de 8,2 e - 1,7 para o L-MFD e D-MFD, respectivamente. Os resultados estão dentro dos estabelecidos na resolução que é de ± 20 % (TABELA 11).

FIGURA 4. Curvas de Calibração dos picos de área x concentração para L-MFD (A) e D-MFD (B).

TABELA 11. Resultados de Precisão e Exatidão para o Limite de Quantificação Limite de Quantificação = 1,25 µg de cada isômero/mL de plasma

L-MFD D-MFD

Precisão (CV %) 9,1 11,9

Exatidão (EPR) 8,2 -1,7

CV% = (desvio padrão/média) * 100; EPR = [(Conc. experimental – Conc. real)/ Conc. Real] x 100

A precisão e a exatidão intra-ensaio e inter-ensaio foram avaliadas em um único dia ou em três dias consecutivos, respectivamente, utilizando-se os controles de qualidade (CQA – concentração de 20 µg cada isômero por mL plasma, CQM - concentração de 10 µg cada isômero por mL plasma, CQB - concentração de 2,5 µg cada isômero por mL plasma). A precisão foi avaliada com base nos valores de Coeficientes de Variação (CV%) e a exatidão com base no Erro Padrão Relativo (EPR) e os valores encontrados estão abaixo de ± 15 %, logo o método foi considerado preciso e exato (TABELA 12).

TABELA 12. Parâmetros de validação o método enantiomérico de metilfenidato em plasma

Intra-ensaio (N=5)

L-MFD D-MFD L-MFD D-MFD

Precisão (CV%) Exatidão (EPR)

CQB 6,6 6,4 -7,92 3,12

CQM 4,2 5,7 -2,1 0,1

CQA 4,7 5,5 -11,7 -4,6

Inter-ensaio (N=15)

L-MFD D-MFD L-MFD D-MFD

Precisão (CV%) Exatidão (EPR)

CQB 11 12,9 -8,5 -1,7

CQM 12,9 14,5 -6,4 5,5

CQA 3,9 7,6 -10,9 -7,7

CQB (Controle Qualidade Baixo – 2,5 µg/mL); CQM (Controle Qualidade Médio – 10 µg/mL); CQA (Controle de Qualidade Alto – 20 µg/mL); EPR = [(Conc. experimental – Conc. real)/ Conc. Real] x 100; CV% = (desvio padrão/média)*100

O método para a separação enantiomérica do metilfenidato será de extrema importância em estudos farmacocinéticos posteriores para a compreensão do papel (toxicidade ou efeito terapêutico) de cada um dos isômeros. Também será a base para o método mais sensível em que utilizará um detector de espectrometria de massas o qual terá a capacidade de quantificar concentrações menores dos isômeros do metilfenidato e permitirá a sua utilização na monitorização terapêutica dos pacientes com TDAH. No entanto, pode ser uma alternativa na avaliação dos casos de intoxicações (MARKOWITZ et al., 1999; JANSEN et al., 2013), dopagem ou mesmo do seu uso abusivo devido nesses casos as concentrações plasmáticas são mais elevadas (POKULLA et al., 2014; BEYER et al., 2014).

5. CONSIDERAÇÕES FINAIS

O método quiral utilizando-se a cromatografia líquida de ultra eficiência por detecção UV (UPLC-UV) para a separação e determinação quantitativa dos enantiômeros do metilfenidato em plasma humano mostrou-se rápido, adequado, exato e preciso. Pode ser utilizado como uma alternativa como método bioanalítico em toxicologia clínica e forense uma vez que possui uma sensibilidade específica, com limite de quantificação de 1,25 µg cada isômero por mL plasma.

A metodologia validada por UPLC-UV pode ser adaptada a HPLC - Espectrometria de massa (LC-MS), a fim de que tenha maior eficiência na determinação quantitativa de isômeros do metilfenidato com a finalidade de monitorização terapêutica.

CONCLUSÃO

O metilfenidato é um fármaco que deve ter um monitoramento terapêutico estrito em pacientes com TDAH, por profissional de saúde qualificado como farmacêutico. A variabilidade na resposta terapêutica e nas reações adversas mostrou ser influenciada por fatores sociais, clínicos e genéticos que devem ser melhores avaliados em futuras pesquisas, principalmente quanto ao impacto em médio e longo prazo na segurança e qualidade de vida de crianças e adolescentes com TDAH.

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