Validação da metodologia analítica por cromatografia líquida de alta

A validação da metodologia analítica para o sistema nanoemulsionado contendo BNZ seguiu os parâmetros estabelecidos pelo ―Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos contidos na Resolução – RE n.899, de 29 de Maio de 2003 – Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), (BRASIL, 2003) e pelo ―International Conference on

Harmonisation (ICH, 1996). Os parâmetros analíticos investigados foram a seletividade,

linearidade, limite de detecção e limite de quantificação, precisão, exatidão e robustez para metodologia analítica não descrita em farmacopeias ou formulários oficiais devidamente reconhecidos pela ANVISA. A validação foi conduzida utilizando a técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) em equipamento Surveyor Plus - Thermo Scientific em UV- VIS equipado com sistema de bomba e detector fotodiiodos Surveyor Plus. Estas análises foram conduzidas na temperatura de 25 ºC na faixa de comprimento de onda de 200 a 400 nm, utilizando detector de 190 a 800 nm, possuindo lâmpadas de deutério e tungstênio.

4.2.14.1. Precisão

O teste de precisão permite avaliar os critérios de repetibilidade, precisão intermediária e de reprodutibilidade (ICH, 1996; BRASIL, 2003). Neste estudo, a precisão foi avaliada quanto à precisão intra-corrida (repetibilidade) e a precisão inter-corridas (precisão intermediária). Para a repetibilidade o teste foi realizado no mesmo dia e nas mesmas condições de análise, sendo a análise conduzida em cinco concentrações determinadas a 100% da concentração teste. Para a precisão intermediária, foram testadas réplicas da concentração teste em dias diferentes e com analistas diferentes em intervalos de 48 horas. Em todos os ensaios foram investigados cinco níveis de concentração em triplicata, sendo duas baixas (1,5 μg mL-1

e 3,0 μg mL-1) uma intermediária (5 μg mL-1) e duas elevadas (6,5 μg mL-1 e 8,5 μg mL-1).

4.2.14.2. Exatidão

A exatidão do método foi avaliada pela adição e recuperação de padrão em cinco níveis de concentração e em triplicata. Em 1000 mg de nanoemulsão foi adicionado e misturado 500 g de BNZ, após a dissolução a amostra foi filtrada e o volume completado em balão volumétrico de 50 mL com fase móvel acetonitrila:água (35:65). Diferentes alíquotas desta solução foram transferidas para balão volumétrico de 10 mL e o volume completado com fase móvel acetonitrila:água (35:65) a fim de obter diferentes concentrações (1,5 μg mL-

1

; 3 μg mL-1; 5 μg mL-1; 6,5 μg mL-1; 8,5 μg mL-1). A exatidão foi expressa pela relação entre a concentração média determinada experimentalmente e a concentração teórica correspondente conforme a relação: concentração média experimental/concentração teórica.

4.2.14.3. Limite de detecção e Limite de quantificação

O limite de detecção é a menor quantidade do analito presente na amostra que pode ser detectado, porém, não necessariamente quantificado sob as condições experimentais de análise estabelecidas (BRASIL, 2003). Assim, o limite de detecção foi determinado com base na relação de 3 vezes o ruído da linha de base através da equação:

Onde, DPa é o desvio padrão do intercepto com o eixo Y, determinado por três curvas de

calibração contendo concentrações do fármaco próximas ao suposto limite de quantificação e IC é a inclinação da curva de calibração.

O limite de quantificação é a menor quantidade do analito em uma amostra que pode ser determinada com precisão e exatidão aceitáveis sob as condições experimentais estabelecidas. Este parâmetro é comumente utilizado em ensaios quantitativos de impurezas, produtos de degradação em fármacos e produtos de degradação em formas farmacêuticas.

A determinação do limite de quantificação é feito através da análise de soluções contendo concentrações decrescentes do fármaco até o menor nível determinável com precisão e exatidão aceitáveis. A expressão deste parâmetro pode ser dada pela equação:

Equação 10 4.2.14.4. Robustez

A robustez foi investigada avaliando a influência de pequenas variações deliberadas na metodologia. As variáveis incluíram a proporção de solvente orgânico na fase móvel durante a corrida das amostras (33:67, 35:65 e 37:63, acetonitrila:água), taxa de fluxo (± 10%) e o fabricante do solvente orgânico (acetonitrila) O ensaio foi realizado para cinco níveis de concentração (1,5 μg mL-1; 3 μg mL-1; 5 μg mL-1; 6,5 μg mL-1; 8,5 μg mL-1) para cada uma das variáveis e os resultados foram analisados pela análise de variância - ANOVA (nível significância, p < 0,05).

4.2.14.5. Preparo da solução padrão, padrão interno e amostras

Para a validação do método analítico, foram preparadas duas soluções estoque: uma contendo BNZ e outra com 4-aminoacetofenona utilizado como padrão interno, as quais foram diluídas em fase móvel acetonitrila:água (35:65) na concentração de 500 μg mL-1.

O padrão interno foi adicionado na mesma quantidade para todas as amostras, numa concentração de 1,25 g mL-1. Através da razão das áreas do fármaco/área padrão interno (concentração constante) obtém-se a concentração da substância na amostra. Posteriormente, uma alíquota destas soluções foi transferidas para balão volumétrico de 10 mL e diluída na fase móvel. A análise desta solução foi realizada em sistema cromatográfico na faixa entre

200 a 400 nm para identificar o comprimento de onda de máxima absorção para o fármaco e do padrão interno no sistema solvente escolhido e o tempo de retenção dos mesmos. Para o preparo das amostras contendo nanoemulsão ou componentes da nanoemulsão, após a dispersão dos componentes em metanol, a solução foi filtrada e o volume completado com acetonitrila. Alíquotas adequadas deste filtrado foram transferidas e o volume completado com fase móvel acetonitrila:água (50:50).

4.2.14.6. Especificidade e seletividade

Este parâmetro foi avaliado para assegurar a resolução e separação completa do pico do BNZ, além de comparar a área sob a curva e o tempo de retenção da solução contendo diferentes componentes (fosfatidilcolina de soja, oleato de sódio, Mygliol 812® e 2- metilpirrolidona). As amostras foram preparadas em triplicata e analisadas utilizando o mesmo procedimento experimental.

4.2.14.7. Construção da curva padrão

Duas soluções estoque, uma contendo BNZ e outra com 4-aminoacetofenona (utilizado como padrão interno), foram diluídas em fase móvel acetonitrila:água (35:65) na concentração de 500 μg mL-1. Diferentes alíquotas dessa solução foram transferidas para balão volumétrico de 10 mL e diluídas com fase móvel acetonitrila:água (35:65) a fim de obter soluções com concentração na faixa de 0,5 a 10 μg mL-1. As amostras foram filtradas em membranas 0,22 m e injetadas no CLAE - DAD em quintuplicata (n = 5). A absorbância foi medida no comprimento de onda de 315 nm.

4.2.14.8. Linearidade e intervalo

A linearidade foi avaliada na faixa de concentração entre 0,5 e 10 μg mL-1 usando o coeficiente de correlação a partir da curva analítica do BNZ em sete níveis de concentração. Cada ponto foi analisado três vezes. A área do pico (reposta) foi determinada contra a concentração de BNZ e plotada pela regressão linear pelo método dos mínimos quadrados para determinar a inclinação, o intercepto e o desvio padrão do intercepto (DPA). Os dados ainda foram submetidos à análise de variância (ANOVA).