Validação do método

Uma vez otimizadas as condições cromatográficas para a separação dos filtros solares, o método foi validado mediante avaliação dos seguintes parâmetros: seletividade, faixa de trabalho, linearidade, precisão e exatidão.

Os limites de detecção e de quantificação não foram avaliados uma vez que os filtros solares se encontram em elevadas concentrações, na ordem de 1 - 10% (m/m), nos protetores solares.

A seletividade foi avaliada comparando-se os cromatogramas dos padrões analíticos com os das amostras dos diferentes fabricantes. Foram levados em consideração, para essa avaliação, a presença de picos nos tempos de retenção dos analitos e a pureza dos picos no início, meio e fim do pico. Nas Figuras 13 a 17 são apresentados os cromatogramas das amostras de FPS 30 e 50 para o fabricante A e FPS 30 para o fabricante B, assim como a amostra preparada em laboratório e seu respectivo placebo.

Figura 13: Cromatograma característico da separação dos 6 filtros solares por HPLC-DAD presentes

na amostra com FPS 30 (Fabricante A – Amostra 39). Fase estacionária: coluna ACE C18, 150 x 4,0 mm, 3 µm. Fase móvel: metanol:água:THF. Gradiente de eluição empregado está descrito na Tabela 13. Detecção em 310 nm. (1) BZ3 (tr = 3,0 min), (2) OCT (tr = 6,0 min), (3) AVO (tr = 9,0 min), (4) SAL (tr = 10,4 min), (5) EHT (tr = 13,5 min) e (6) TS (tr = 14,8 min). Detecção em 310 nm.

Figura 14: Cromatograma característico da separação dos 6 filtros solares por HPLC-DAD presentes

na amostra com FPS 50 (Fabricante A – Amostra 40). Fase estacionária: coluna ACE C18, 150 x 4,0 mm, 3 µm. Fase móvel: metanol:água:THF. Gradiente de eluição empregado está descrito na Tabela 13. Detecção em 310 nm. (1) BZ3 (tr = 2,9 min), (2) OCT (tr = 5,6 min), (3) AVO (tr = 8,4 min), (4) SAL (tr = 9,8 min), (5) EHT (tr = 13,6 min) e (6) TS (tr = 15,1 min). Detecção em 310 nm.

Figura 15: Cromatograma característico da separação dos 2 filtros solares por HPLC-DAD presentes

na amostra com FPS 30 (Fabricante B – Amostra 34). Fase estacionária: coluna ACE C18, 150 x 4,0 mm, 3 µm. Fase móvel: metanol:água:THF. Gradiente de eluição empregado está descrito na Tabela 13. Detecção em 310 nm. (1) OCT (tr = 5,5 min) e (2) AVO (tr = 8,2 min). Detecção em 310 nm.

Figura 16: Cromatograma característico da separação dos 3 filtros solares por HPLC-DAD presentes

na amostra preparada em laboratório (Amostra 43). Fase estacionária: coluna ACE C18, 150 x 4,0 mm, 3 µm. Fase móvel:metanol: água:THF. Gradiente de eluição empregado está descrito na Tabela 13. Detecção em 310 nm. (1) MTX (tr = 7,8 min), (2) AVO (tr = 8,3 min) e (3) EHT (tr = 13,3 min). Detecção em 310 nm.

É possível observar que para nenhuma das amostras analisadas ocorreu a co-eluição de concomitantes da matriz da amostra nos tempos de retenção dos filtros solares. Ainda, foi analisado o placebo (Amostra 44) pelo método estabelecido e também neste não foi verificada a presença de picos nos tempos de retenção dos compostos em estudo (Figura 17). A análise da pureza do pico permitiu confirmar que os espectros de cada respectivo filtro não sofriam alteração no inicio, meio e fim do pico cromatográfico. Esses resultados indicam a seletividade do método para a determinação de filtros solares nestas formulações.

Figura 17: Cromatograma característico do placebo (Amostra 44) analisado por HPLC-DAD. Fase

estacionária: coluna ACE C18, 150 x 4,0 mm, 3 µm. Fase móvel:metanol:água:THF. Gradiente de eluição empregado está descrito na Tabela 13. Detecção em 310 nm.

A matriz das amostras de protetores solares pode variar de fabricante para fabricante e a informação quanto às concentrações dos compostos não é disponível. Ainda, para avaliar a seletividade do método, foram avaliadas outras substâncias possivelmente presentes na composição dos protetores solares, como conservantes, antioxidantes e/ou vitaminas. Os compostos selecionados foram: metilparabeno, etilparabeno, propilparabeno, butilparabeno, tocoferol e fenoxietanol. Os cromatogramas para esses compostos estão sobrepostos na Figura 18, na qual se verificou que todos eluem em um tempo de aproximadamente 2 min, ou seja, não tem afinidade, nestas condições, pela fase estacionária. Esses resultados indicaram que todos esses compostos são mais polares do que os filtros solares em avaliação e não interferiram no método estabelecido.

Figura 18: Cromatogramas característicos sobrepostos de soluções à 100 g mL-1 de butilparabeno, etilparabeno, fenoxietanol, metilparabeno, propilparabeno e tocoferol. Fase estacionária: coluna ACE C18, 150 x 4,0 mm, 3 µm. Fase móvel:metanol:água:THF. Gradiente de eluição empregado está descrito na Tabela 13. Detecção em 310 nm.

Para a determinação da linearidade e da faixa linear de cada um dos filtros solares foram construídas curvas analíticas (Figuras 19 e 20) no solvente em cinco níveis de concentração. As análises foram realizadas em triplicatas independentes e duplicata de injeção. Na Tabela 16 são apresentados as médias dos coeficientes angulares e de regressão linear, e seus respectivos desvios determinados pelo método dos mínimos quadrados ordinários, além da quantidade de pontos excluídos pela análise de resíduos.

Tabela 16: Parâmetros da regressão linear. Ativo Faixa de trabalho

µg mL-1 Coeficiente Angular (s) mL UA µg-1 Linearidade - r Pontos eliminados na análise de resíduos BZ3 1 – 20 25.705 (119) 0,9996 0 OCT 1 – 20 19.905 (79) 0,9997 1 ODPaba 1 – 20 73.714 (349) 0,9997 4 MTX 1 – 20 65.354 (141) 0,9999 6 AVO 1 – 20 60.819 (504) 0,9990 1 SAL 2 – 25 8.036 (55) 0,9993 2 HMS 2 – 25 8.781 (148) 0,9964 3 EHT 1 – 20 83.350 (457) 0,9996 2 TM 0,8 – 15 20.127 (134) 0,9994 4 TS 1 – 20 36.544 (290) 0,9992 4

Figura 19: Curvas analíticas e gráfico de resíduos para as substâncias: benzofenona-3 (A.1) curva

analítica, (A.2.) gráfico de resíduos, OCT (B.1) curva analítica, (B.2.) gráfico de resíduos, ODPaba (C.1) curva analítica, (C.2.) gráfico de resíduos, MTX (D.1) curva analítica e (D.2.) gráfico de resíduos e AVO (E.1) curva analítica e (E.2.) gráfico de resíduos.

Figura 20: Curvas analíticas e gráfico de resíduos para as substâncias: SAL (A.1) curva analítica,

(A.2.) gráfico de resíduos, HMS (B.1) curva analítica, (B.2.) gráfico de resíduos, EHT (C.1) curva analítica, (C.2.) gráfico de resíduos, TM (D.1) curva analítica e (D.2.) gráfico de resíduos, TS (E.1) curva analítica e (E.2.) gráfico de resíduos.

A qualidade das curvas analíticas construídas para cada substância e suas respectivas linearidades foi avaliada através da determinação dos parâmetros de regressão linear e inspeção visual dos gráficos de resíduos. A presença de valores extremos (outliers) foi avaliada pelo teste de resíduos padronizados,

respeitando a remoção máxima de pontos de 22,2% (Guia do Mapa, 2011) dos dados, ou seja, 6 medidas experimentais no conjunto de 30 para cada curva analítica.

Uma vez estabelecidas as faixas lineares das curvas analíticas, foi necessário avaliar a capacidade do método em determinar com exatidão a concentração dos filtros solares presentes nos protetores solares. A exatidão foi avaliada pelo teste de recuperação conforme descrito no item 3.5.4.3. A fortificação das amostras comerciais foi realizada em dois níveis de concentração (30 e 60% do valor previamente determinado). O placebo (amostra 44) foi fortificado com três filtros solares na concentração de 10% m/m para MTX, 5% m/m para AVO e 2,5% m/m para EHT. Essas concentrações foram selecionadas de acordo com a concentração total desses filtros solares na amostra 43, que possui a mesma composição (base cosmética) que o produto 44 (placebo).

O critério de aceitação considerado neste trabalho foi de uma recuperação no intervalo de 80 a 120% e os resultados obtidos estão apresentados na Tabela 17.

Tabela 17: Resultados de recuperação média (n=3), para diferentes níveis de fortificação, dos filtros

solares nas amostras de diferentes fabricantes e placebo. Em parênteses está expresso a estimativa dos respectivos desvios padrão.

Ativo

Amostras

FPS 30

(fabricante A – amostra 39) (fabricante A – amostra 50) FPS 50 (fabricante B – amostra 40) FPS 30

Placebo (Amostra preparada) 30% 60% 30% 60% 30% 60% 100%* BZ3 107,8 (3,5) 103,2 (2,1) 89,4 (0,7) 100,7 (1,0) OCT 100,2 (4,1) 99,9 (2,5) 88,0 (4,8) 99,6 (6,1) 97,9 (7,4) 102,7 (1,0) MTX 115,5 (1,4) AVO 99,4 (1,0) 99,5 (1,2) 95,0 (2,6) 100,2 (5,3) 100,3 (5,3) 101,2 (1,4) 101,9 (1,9) SAL 105,7 (2,7) 101,1 (2,7) 91,2 (4,2) 96,8 (1,3) EHT 143,1 (11) 128,2 (11,7) 105,3 (3,8) 127,3 (32,9) 106,8 (0,1) TS 105,3 (5,6) 99,4 (0,1) 95,7 (7,3) 95,7 (2,3)

Legenda: AVO: butil metoxidibenzoilmetano, BZ3: benzofenona-3, EHT: etilexil triazona, MTX: metoxicinamato de octila, OCT: octocrileno, SAL: salicilato de octila e TS: bis-etilexiloxifenol metoxifenil triazina. * A fortificação dessa amostra ocorreu na concentração nominal da amostra preparada em laboratório (Amostra 43).

A recuperação para todos os filtros solares indicaram exatidão aceitável, exceto para o EHT nas amostras comerciais de FPS 30 e 50. Para avaliar uma possível presença de efeito matriz, a amostra de FPS 50 foi analisada pelo método de adição de padrão e por padronização externa (curva do analito no solvente).

Outro aspecto importante a destacar é que a matriz da amostra de FPS 50 necessitou uma maior quantidade de acetona para a solubilização (60:40, v/v). A amostra foi analisada em triplicata por cada método e os coeficientes angulares e as respectivas estimativas dos desvios padrões das curvas estão apresentados na Tabela 18.

Tabela 18: Coeficientes angulares médios (n=6) e coeficientes de variação para as curvas analíticas

preparadas no solvente e no placebo para o ativo EHT.

Parâmetro Curva analítica no solvente Curva analítica na amostra Coeficiente angular

mL UA µg-1 83.792 83.435

Coeficiente de Variação

(%, m/m) 1,36 1,50

O teste F indicou que não existe diferença significativa, a um nível de confiança de 95%, para a variância dos dois conjuntos de dados e o teste t de Student levou a constatação de que não há diferença significativa (a um nível de confiança de 95%) entre as médias do teor de EHT determinado pelo método de padronização externa e de adição de padrão, que foi de 2,14 ± 0,08 % m/m e 2,18 ± 0,08% m/m, respectivamente.

Desta forma, conclui-se que a matriz não exerceu efeito sobre o resultado do EHT, embora o teste de recuperação tenha indicado isso.

O último parâmetro avaliado foi a precisão intra- e inter-dias. No primeiro e segundo dia as amostras foram analisadas em triplicata e no terceiro dia em sextuplicata conforme detalhado em 5.5.4.4.

A precisão intra-dia foi expressa pelo coeficiente de variação obtido no terceiro dia em sextuplicata (n=6), e o critério de aceitação considerado neste trabalho foi de uma variação de até 5% entre os resultados obtidos Tabela 19.

Todas as substâncias apresentaram precisão intra-dia dentro do intervalo estabelecido, sendo que a menor variação foi observada para o ativo benzofenona-3 e a maior variação foi observada para a AVO para o produto formulado.

Tabela 19: Resultados para precisão intra-dia (n=6). Ativo

Amostras

(A) FPS 30 (A) FPS 50 (B) FPS 30 Produto formulado

Teor CV% Teor CV% Teor CV% Teor

BZ3 2,15 2,37 3,47 0,86 OCT 2,62 0,97 2,17 1,78 7,65 1,08 MTX 9,58 3,88 AVO 3,24 1,72 2,73 0,90 2,32 1,68 5,86 4,17 SAL 3,08 3,10 4,01 1,78 EHT 1,70 2,10 1,86 1,46 3,09 3,53 TS 0,93 4,02 1,24 1,09

A precisão inter-dias foi expressa pelo coeficiente de variação obtida entre os três dias (n=12), e o critério de aceitação considerado neste trabalho foi de uma variação de até 10% entre os resultados obtidos. Os resultados encontrados neste estudo são mostrado na Tabela 20.

Todas as substâncias apresentaram precisão inter-dias dentro do intervalo estabelecido, sendo que a menor variação foi observada para o ativo OCT (1,72%) e a maior variação foi observada para o EHT(7,32%).

Tabela 20: Resultados para concentração dos ativos e a precisão do inter-dias do método. Ativo

Amostras

(A) FPS 30 (A) FPS 50 (B) FPS 30 Produto formulado

Teor CV% Teor CV% Teor CV% Teor

BZ3 2,21 3,81 3,66 5,82 OCT 2,65 1,72 2,23 4,24 7,63 1,76 MTX 9,34 4,96 AVO 3,35 4,31 2,83 4,24 2,27 3,23 5,56 6,70 SAL 3,06 2,32 4,23 5,91 EHT 1,69 4,02 1,93 6,30 2,93 7,32 TS 0,92 4,87 1,23 2,76

4.2.1 Determinação das concentrações de filtros solares orgânicos

em protetores solares por cromatografia líquida de alta eficiência

Com objetivo de identificar uma possível correlação da concentração dos filtros solares com os espectros de infravermelho próximo, através do método cromatográfico desenvolvido nesse trabalho, foram determinadas as concentrações dos filtros solares no conjunto total de amostras (54) utilizadas na construção dos modelos quimiométricos. Cabe destacar que o método cromatográfico desenvolvido e validado permite a determinação de 10 filtros solares simultaneamente. No

entanto, a formulação pode conter outros protetores solares além destes dez, os quais podem vir a contribuir para o FPS final da formulação. A Tabela 21 descreve os resultados obtidos.

No conjunto das amostras é possível notar que os protetores solares apresentam diferentes combinações e concentrações de filtros solares para um mesmo valor de FPS.

A concentração dos filtros solares nas amostras analisadas variou em uma ampla faixa de concentração, de 0,24% m/m até 14,6% m/m. O filtro solar de maior concentração determinado foi de HMS para uma amostra de FPS em torno de 15 (amostra 13).

Considerando apenas as concentrações médias dos filtros solares foi verificado que quatro amostras apresentaram concentrações de pelo menos um dos filtros solares acima do máximo permitido pela Anvisa. Três amostras com teores de SAL acima do valor máximo permitido e uma amostra com o teor de MTX fora da faixa especificada pela Anvisa.

# Fabricante FPS Concentração %, m/m

BZ3 OCT ODPaba MTX AVO SAL HMS EHT TM TS

Amostras com valores de FPS in vivo

9 --- 14,6 3,13 --- 7,04 --- --- --- --- --- --- --- 23 --- 16,3 4,16 --- --- 9,99 --- --- --- --- --- --- 26 --- 17 --- 1,08 --- 4,87 1,80 1,77 --- --- 0,90 --- 4 --- 17,1 --- --- --- 7,51 --- --- --- --- --- --- 28 --- 18,3 5,08 --- --- 6,89 --- --- --- --- --- --- 27 --- 18,7 4,91 --- --- 6,41 --- --- --- --- --- --- 2 --- 22,3 3,17 3,17 --- 4,09 0,94 1,68 --- --- --- --- 69 --- 30 --- --- --- 4,92 --- --- --- --- 1,77 2,11 66 --- 30 --- 7,54 --- --- 2,42 3,9 8,69 --- --- --- 7 --- 31,1 --- 8,23 --- --- 1,22 --- --- 2,08 7,81 --- 3 --- 31,8 --- --- --- 9,15 --- 4,16 --- 2,58 --- 4,4 8 --- 32 1,91 1,66 --- 9,73 --- 1,41 --- --- --- --- 24 --- 32,3 2,37 2,04 --- 10,57 --- --- --- --- --- --- 22 --- 33,5 --- --- --- --- 1,36 --- --- --- 8,00 3,37 1 --- 33,8 --- 7,69 --- --- 1,47 4,03 --- --- --- --- 5 --- 43 2,30 6,53 --- --- 1,54 2,48 --- --- --- 3,33 6 --- 72,8 --- --- --- 9,65 --- 4,17 --- 2,67 5,67 6,57 25 --- 74,4 --- --- --- 9,50 --- --- --- 1,26 --- 1,38 67 --- 76,7 --- 7,66 --- --- 3,43 2,9 10,12 --- --- 4,64 Amostras comerciais 31 B 8 --- 2,94 --- --- 0,45 --- --- --- --- 60 E 15 --- 2,00 --- --- 1,27 --- --- 2,01 --- 0,99 59 I 15 --- --- --- 8,13 0,84 --- --- 4,13 --- --- 41 F 15 --- 2,36 --- --- 1,73 4,80 --- --- --- --- 38 A 15 1,31 0,77 --- --- 0,83 1,81 --- 1,53 --- 0,24 32 B 15 --- 3,46 --- --- 2,78 5,64 --- 0,34 --- --- 15 C 15 --- 4,44 --- --- 1,35 3,67 9,34 --- --- --- 13 C 15 --- 6,73 --- --- 2,24 6,04 14,6 --- --- --- 57 H 20 --- 3,18 --- 6,30 --- --- --- --- --- 3,24 33 B 20 --- 8,52 --- --- 1,48 --- --- --- --- 64 B 30 --- --- --- --- 1,18 --- --- --- --- --- 58 C 30 2,60 3,96 --- --- 1,23 --- --- --- --- --- 46 A 30 1,62 1,83 --- --- 1,9 1,69 --- 2,08 --- 1,32 45 B 30 --- 7,51 --- --- 2,33 --- --- --- --- --- 42 F 30 --- 1,90 --- --- 2,41 5,02 6,82 --- --- ---

# Fabricante FPS Concentração %, m/m

BZ3 OCT ODPaba MTX AVO Sal HMS EHT TM TS

Amostras comerciais 39 A 30 2,24 2,69 --- --- 3,42 3,04 --- 1,64 --- 0,88 34 B 30 --- 7,43 --- --- 2,32 --- --- --- --- --- 20 D 30 --- 3,76 --- 3,88 --- --- --- --- 4,07 2,32 19 D 30 --- 4,89 --- 4,30 --- --- --- 0,60 --- 2,03 12 J 30 3,75 --- --- 7,20 1,37 4,20 9,66 --- --- --- 11 A 30 --- --- --- 6,65 --- --- --- --- 1,67 2,85 61 G 40 5,49 --- --- 6,54 1,82 3,99 6,71 --- --- --- 35 B 40 --- 9,74 --- --- 3,14 --- --- --- --- --- 63 A 50 --- 3,07 --- --- 1,89 --- --- 3,35 --- 2,8 62 E 50 --- 3,37 --- --- 2,05 --- --- 3,39 --- 3,33 47 A 50 3,43 1,88 --- --- 2,01 3,60 --- 2,46 --- 1,71 40 A 50 3,76 2,20 --- --- 2,89 4,57 --- 2,11 --- 1,19 36 B 50 --- 9,72 --- --- 1,84 --- --- 1,73 --- 2,2 16 C 50 5,48 4,40 --- --- 2,14 3,75 12,61 --- --- --- 65 E 60 --- 3,66 --- --- 2,67 --- --- 3,99 --- 3,68 37 B 60 --- 5,00 --- --- 4,02 5,58 --- 1,55 --- --- 18 D 60 --- --- --- 9,68 --- 4,45 --- 3,91 4,01 2,69 17 D 60 --- --- --- 10,05 --- 4,60 --- 4,10 4,12 2,76 48 A 70 --- 2,10 --- --- 1,25 --- 2,69 2,71 2,46 3,44 Máximo 5,49 9,74 7,04 10,57 4,02 6,04 14,6 4,13 8,00 6,57 Mínimo 1,31 0,77 7,04 3,88 0,45 1,41 2,69 0,34 0,90 0,24 ANVISA* 10 10 8 10 5 5 15 5 10 10

Legenda: BZ3: benzofenona-3, OCT: octocrileno, ODPaba: octildimetilpaba, MTX: metoxicinamato de octila, AVO: butil metoxidibenzoilmetano, Sal: salicilato de octila, HMS: homosalato, EHT: etilexil triazona, TS: bis-etilexiloxifenol metoxifenil triazina e TM: metileno bis-benzotriazolil tetrametilbutilfenol . Em azul estão apresentadas os resultados das amostras empregadas na validação (n=3) e em preto os resultados das amostras analisadas em duplicata com o método validado.* Máximo permitido pela legislação vigente.