UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA
DAIANE CAMILO NERY
DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO PARA A DETERMINAÇÃO DE FILTROS
SOLARES ORGÂNICOS POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA
EFICIÊNCIA E AVALIAÇÃO DA CORRELAÇÃO DO FATOR DE PROTEÇÃO SOLAR MEDIDO IN VIVO E IN VITRO POR ESPECTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO PRÓXIMO E QUIMIOMETRIA
CAMPINAS 2016
DAIANE CAMILO NERY
DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO PARA A DETERMINAÇÃO DE FILTROS
SOLARES ORGÂNICOS POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA
EFICIÊNCIA E AVALIAÇÃO DA CORRELAÇÃO DO FATOR DE PROTEÇÃO SOLAR MEDIDO IN VIVO E IN VITRO POR ESPECTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO PRÓXIMO E QUIMIOMETRIA
Dissertação de Mestrado apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Química na área de Química Analítica.
Orientadora: Profa. Dra. Susanne Rath
Coorientador: Prof. Dr. Jarbas José Rodrigues Rohwedder
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA DAIANE CAMILO NERY, E ORIENTADA PELA PROF(A). DR(A). SUSANNE RATH.
CAMPINAS 2016
Dedico esse trabalho a todos da minha família que me apoiaram incondicionalmente em todos os objetivos já traçados em minha vida. Obrigada pela paciência, amor, incentivo е carinho.
AGRADECIMENTOS
A trajetória que permitiu com que esse projeto de mestrado se concluísse foi muito longa e difícil. Compartilhei minha dedicação entre família, trabalho, preocupações da vida e o projeto. Com muita tranquilidade afirmo que sozinha jamais teria conquistado mais essa etapa.
Inicialmente gostaria de agradecer enormemente a Profª Drª Susanne Rath, que além de todos os ensinamentos, foi extremamente generosa, paciente e compreensiva. Com certeza esse projeto somente se concluiu com seu suporte.
Ao Prof. Dr. Jarbas por todo o aprendizado, sempre me socorrendo com ótimas ideias. Agradeço também a todos do laboratório de automação por terem sempre me recebido atenciosamente.
A todos os amigos do grupo Paracelsus e da UNICAMP, que com certeza fazem parte da minha segunda família. Vai ser muito difícil me desligar após 12 anos de convivência, com muitos momentos de descontração, incentivos, desabafos e contribuições acadêmicas.
A todos do Grupo Investiga (Allergisa e Dosage) que me apoiaram desde o inicio do meu projeto. Permitiram minhas ausências sem questionamentos e disponibilizaram sua estrutura para permitir com que meu projeto progredisse. Um agradecimento especial ao CEO da empresa Samuel Guerra Junior que ao longo dos 7 anos de empresa se tornou meu mentor.
A todos os meus amigos qυе dе alguma forma sempre estiveram próximos a mim.
Ao meu amigo e namorado, por sempre me desconectar em vários momentos estressantes.
A todos da minha família, inclusive aos que já se foram e que não tiveram a oportunidade de me acompanhar em mais essa etapa.
A toda direção e aos funcionários do Instituto de Química da UNICAMP pelo apoio acadêmico e técnico.
RESUMO
O fator de proteção solar (FPS) quantifica a eficácia de um protetor solar e é baseado na determinação da dose mínima eritematosa da pele protegida e não protegida em voluntários humanos. O objetivo desse trabalho foi propor uma técnica alternativa aos testes in vivo para a determinação do FPS em protetores solares utilizando as técnicas de espectroscopia no infravermelho próximo (NIR) associada à quimiometria e a cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de fotodiodos (HPLC-DAD).
Para o desenvolvimento e validação do método cromatográfico foram selecionados dez compostos orgânicos empregados como filtros solares mais recorrentes nos principais protetores solares comercializados no Brasil: benzofenona-3, octocrileno, octil dimetil paba, metoxicinamato de octila, butil metoxidibenzoilmetano, homosalato, salicilato de octila, etilexil triazona, metileno bis-benzotriazolil tetrametilbutilfenol e bis-etilexiloxifenol metoxifenil triazina. A separação cromatográfica foi realizada em coluna ACE C18 (150 mm x 4.6 mm, 3 μm), fase móvel composta por metanol:água:tetraidrofurano com eluição por gradiente. O butil metoxidibenzoilmetano foi quantificado no comprimento de onda de 358 nm e os demais compostos em 310 nm. Para determinação do teor dos filtros solares nos protetores solares foi utilizado método de padronização externa.
Para a previsão do FPS, empregando a técnica de NIR, foram utilizadas 53 amostras de diferentes valores de FPS e fabricantes. Todas as amostras analisadas por cromatografia continham mais de dois filtros solares em uma ampla faixa de concentração (0,24% m/m a 14,6% m/m). Modelos de calibração empregando PLS (Partial Least Squares) foram construídos para previsão do FPS e para previsão das concentrações dos filtros solares. Os modelos de previsão do FPS não se mostraram robustos quando foram empregadas amostras de protetores solares de diferentes procedências. Este fato, ocorreu devido a variabilidade da composição dos filtros solares e de suas matrizes. Entretanto, foi possível construir modelos para amostras de um mesmo fabricante e ainda prever a concentração dos filtros solares nos protetores usando espectroscopia NIR, com erro de previsão inferior a 10%.
ABSTRACT
The sun protection factor (SPF) quantifies the effectiveness of a sunscreen and is based on determining the minimum erythematous dose for protected and unprotected skin in human volunteers. The aim of this study was to propose an alternative technique to in vivo tests for determining the SPF in sunscreens using near infrared spectroscopy (NIR) associated with chemometrics and high-performance liquid chromatography with a photodiode array detector (HPLC-DAD).
For the development and validation of the chromatographic method ten organic compounds employed as sunscreen in commercial Brazilian sunscreens were selected: benzophenone-3, octocrylene, octyl dimethyl PABA, octyl methoxycinnamate, butyl methoxydibenzoylmethane, homosalate, octyl salicylate, ethylhexyl triazone, methylene bis-benzotriazolyl tetramethylbutylphenol and bis-ethylhexyloxyphenol methoxyphenyl triazine. The chromatographic separation was performed on a ACE C18 column (150 mm x 4.6 mm, 3 µm) and a mobile phase consisting of methanol:water:tetrahydrofuran with gradient elution. Butyl methoxydibenzoylmethane was quantified at a wavelength of 358 nm and the other compounds at 310 nm. To determine the content of the organic filters in sunscreens the external calibration method was used.
To predict the SPF using NIR fifty-three samples of sunscreen emulsions of different SPF values and manufacturer were employed. All analyzed samples by HPLC-DAD contained more than two sunscreen agents in a wide concentration range (0.324% m/m to 14.6% w/w). PLS’s (Partial Least Squares) calibration models were built in order
to predict the SPF and the sunscreen’s concentration in the products. The models to
predict the SPF were not robust when sunscreens from different manufacturers were evaluated, due to the variability of the composition of the sunscreens and their matrices. However, it was possible to construct calibration models for samples of the same manufacturer and also to predict the concentration of the active ingredients in sunscreens using NIR spectroscopy with a standard error of prediction less than 10%.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Espectro solar. ... 18
Figura 2: Distribuição do ozônio sobre a Terra ao longo de, aproximadamente, 35 anos. 1) 10/1979, 2) 10/1985, 3) 10/1994, 4) 10/2008, 5) 10/2010 e 6) 10/2014. (Adaptado NASA, Ozone Hole Watch). .. 19
Figura 3: Estrutura da pele. (Adaptado do NCI, National Cancer Institute, EUA). ... 21
Figura 4: Estimativa de casos de câncer de pele nos Estados Unidos. (A) Distribuição de novos casos de câncer de pele e mortes no intervalo de 1992 a 2010 e (B) Relação entre novos casos e sobrevida - considerando o intervalo de 2004 a 2010. (Adaptado de NCI, National Cancer Institute). ... 23
Figura 5: Estruturas dos filtros solares orgânicos (A) paba e (B) octildimetilpaba. Em vermelho estão indicados os principais grupos responsáveis pela fotoalergenicidade das moléculas(Nash, 2006). ... 31
Figura 6: Espectros de absorção na faixa do UVA e UVB. (A) MTX, (B) EHT , (C) TM e (D) TS. (Adaptado de BASF, 2011). ... 32
Figura 7: Modelo de representação do oscilador harmônico (em verde) e oscilador anarmônico (em azul) para uma molécula diatômica. ... 37
Figura 8: Escala colorimétrica L*a*b ... 47
Figura 9: Representação gráfica do ITA para a escala de Fitzpatrick (COLIPA, 2007). ... 48
Figura 10: Principais etapas de experimentação na determinação de FPS in vivo. ... 49
Figura 11: Cromatograma característico da separação dos 10 filtros solares por HPLC (40 g mL-1). Fase estacionária: coluna ACE C18, 250 x 4,6 mm, 5 µm. Fase móvel: metanol:água:THF. Gradiente de eluição empregado está descrito na Tabela 12. Detecção em 310 nm. (1) BZ3 (tr = 4,8 min), (2) OCT (tr = 8,2 min), (3) ODPaba (tr = 10,6 min), (4) MTX (tr = 11,7 min), (5) AVO (tr = 12,5 min), (6) SAL (tr = 14,5 min), (7) HMS (tr = 15,6 min), (8) EHT (tr = 23,6 min), (9) TM (tr = 24,0 min) e (10) TS (tr = 24,4 min). Detecção em 310 nm. ... 64
Figura 12: Cromatograma característico da separação dos 10 filtros solares por HPLC (40 g mL-1). Fase estacionária: coluna ACE C18, 150 x 4,0 mm, 3 µm. Fase móvel:metanol:água:THF. Gradiente de eluição empregado está descrito na Tabela 13. (A) Detecção em 310 nm. (1) BZ3 (tr = 2,9 min), (2) OCT (tr = 5,5 min), (3) ODPaba (tr = 7,0 min), (4) MTX (tr = 7,8 min), (5) AVO (tr = 8,3 min), (6) SAL (tr = 9,6 min), (7) HMS (tr = 10,4 min), (8) EHT (tr = 13,5 min), (9) TM (tr = 14,0 min) e (10) TS (tr = 15,1 min). (B) Detecção em 358 nm. (5) AVO (tr = 8,3 min). ... 65
Figura 13: Cromatograma característico da separação dos 6 filtros solares por HPLC-DAD presentes na amostra com FPS 30 (Fabricante A – Amostra 39). Fase estacionária: coluna ACE C18, 150 x 4,0 mm, 3 µm. Fase móvel: metanol:água:THF. Gradiente de eluição empregado está descrito na Tabela 13. Detecção em 310 nm. (1) BZ3 (tr = 3,0 min), (2) OCT (tr = 6,0 min), (3) AVO (tr = 9,0 min), (4) SAL (tr = 10,4 min), (5) EHT (tr = 13,5 min) e (6) TS (tr = 14,8 min). Detecção em 310 nm. ... 68
Figura 14: Cromatograma característico da separação dos 6 filtros solares por HPLC-DAD presentes na amostra com FPS 50 (Fabricante A – Amostra 40). Fase estacionária: coluna ACE C18, 150 x 4,0 mm, 3 µm. Fase móvel: metanol:água:THF. Gradiente de eluição empregado está descrito na Tabela 13. Detecção em 310 nm. (1) BZ3 (tr = 2,9 min), (2) OCT (tr = 5,6 min), (3) AVO (tr = 8,4 min), (4) SAL (tr = 9,8 min), (5) EHT (tr = 13,6 min) e (6) TS (tr = 15,1 min). Detecção em 310 nm. ... 69
Figura 15: Cromatograma característico da separação dos 2 filtros solares por HPLC-DAD presentes na amostra com FPS 30 (Fabricante B – Amostra 34). Fase estacionária: coluna ACE C18, 150 x 4,0 mm, 3 µm. Fase móvel: metanol:água:THF. Gradiente de eluição empregado está descrito na Tabela 13. Detecção em 310 nm. (1) OCT (tr = 5,5 min) e (2) AVO (tr = 8,2 min). Detecção em 310 nm. ... 69 Figura 16: Cromatograma característico da separação dos 3 filtros solares por HPLC-DAD presentes na amostra preparada em laboratório (Amostra 43). Fase estacionária: coluna ACE C18, 150 x 4,0 mm, 3 µm. Fase móvel:metanol: água:THF. Gradiente de eluição empregado está descrito na Tabela 13. Detecção em 310 nm. (1) MTX (tr = 7,8 min), (2) AVO (tr = 8,3 min) e (3) EHT (tr = 13,3 min). Detecção em 310 nm. ... 70 Figura 17: Cromatograma característico do placebo (Amostra 44) analisado por HPLC-DAD. Fase estacionária: coluna ACE C18, 150 x 4,0 mm, 3 µm. Fase móvel:metanol:água:THF. Gradiente de eluição empregado está descrito na Tabela 13. Detecção em 310 nm. ... 71 Figura 18: Cromatogramas característicos sobrepostos de soluções à 100 g mL-1 de butilparabeno, etilparabeno, fenoxietanol, metilparabeno, propilparabeno e tocoferol. Fase estacionária: coluna ACE C18, 150 x 4,0 mm, 3 µm. Fase móvel:metanol:água:THF. Gradiente de eluição empregado está descrito na Tabela 13. Detecção em 310 nm. ... 71 Figura 19: Curvas analíticas e gráfico de resíduos para as substâncias: benzofenona-3 (A.1) curva analítica, (A.2.) gráfico de resíduos, OCT (B.1) curva analítica, (B.2.) gráfico de resíduos, ODPaba (C.1) curva analítica, (C.2.) gráfico de resíduos, MTX (D.1) curva analítica e (D.2.) gráfico de resíduos e AVO (E.1) curva analítica e (E.2.) gráfico de resíduos. ... 73 Figura 20: Curvas analíticas e gráfico de resíduos para as substâncias: SAL (A.1) curva analítica, (A.2.) gráfico de resíduos, HMS (B.1) curva analítica, (B.2.) gráfico de resíduos, EHT (C.1) curva analítica, (C.2.) gráfico de resíduos, TM (D.1) curva analítica e (D.2.) gráfico de resíduos, TS (E.1) curva analítica e (E.2.) gráfico de resíduos. ... 74 Figura 21: Espectros NIR de 4.000 a 9.115 cm-1 (1.097 a 2.500 nm) para o conjunto de amostras de protetores solares (A) Espectros brutos, (B) Espectros com pré-tratamento de derivada primeira e alisamento com janela de 15 pontos. ... 82 Figura 22: Analise de PCA para o conjunto de amostras que possuem valor definido de FPS (A) Gráfico de scores e (B) Gráfico de resíduos versus leverage. ... 84 Figura 23: Análise de PCA para o conjunto após a exclusão da amostra 29 (A) Gráfico de Scores e (B) Gráfico de resíduos versus leverage. ... 85 Figura 24: Gráfico de correlação entre os valores de referência para o FPS e previstos pelo modelo PLS empregando 12 variáveis latentes para o conjunto de 106 espectros NIR para as 53 amostras. 86 Figura 25: Valores de erros relativos entre o valor de FPS previsto e aquele empregado como referência. As diferentes cores empregadas nos gráficos (vermelho e preto) representam os erros relativos para as replicatas das amostras. ... 88 Figura 26: Espectros NIR para as replicatas da amostra 32 após o pré-tratamento da primeira derivada e alisamento com janela de 15. ... 89 Figura 27: Gráfico de correlação entre os valores de referência para o FPS e previstos pelo modelo PLS para os espectros médios do conjunto de 53 amostras. ... 90
Figura 28: Gráfico de correlação entre os valores de referência para o FPS e previstos pelo modelo PLS para os espectros médios do conjunto de 19 amostras cujos valores de FPS foram determinados pelo teste in vivo. ... 92 Figura 29: Gráfico de correlação entre os valores de referência de FPS rotulados e previstos pelo modelo PLS para o conjunto de amostras comerciais. ... 93 Figura 30: Gráfico de correlação entre os valores de referência de FPS rotulados e previstos pelo modelo PLS para todas as amostras disponíveis para o Fabricante A. (B) Resultado obtido após a retirada das amostras 11 e 48 (ver Tabela 26). ... 96 Figura 31: (A) Gráfico de correlação entre os valores de referência de FPS rotulados e previstos pelo modelo PLS para todas as amostras disponíveis para o Fabricante B. (B) Resultado obtido após a retirada das amostras 32, 37 e 64 (ver Tabela 26). ... 96 Figura 32: Distribuição das amostras no conjunto de dados. ... 99 Figura 33: Intervalo de concentração das 53 amostras avaliadas por HPLC. ... 100 Figura 34: Gráfico de correlação para concentração de (A) OCT e (B) TS entre os valores de referência para o teor determinados por HPLC-DAD e previstos pelo modelo PLS. (*) referência neste caso representa os valores de concentração obtidos por método de HPLC. ... 102
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Lista de filtros solares e as suas quantidades máximas que podem ser empregados em
protetores solares, autorizados pelas agências reguladoras brasileira, americana e europeia. ... 26
Tabela 2: Lista de filtros solares orgânicos mais utilizados nas principais marcas de protetores solares no Brasil. ... 27
Tabela 3: Trabalhos publicados com aplicação em determinação de filtros solares em protetores solares por HPLC-DAD. ... 33
Tabela 4: Trabalhos publicados nos últimos cinco anos para determinação de filtros solares. ... 35
Tabela 5: Descrição dos filtros solares presentes nas formulações comerciais. ... 45
Tabela 6: Componentes do protetor solar preparado em laboratório (amostra 43 e 70). ... 46
Tabela 7: Escala de Fitzpatrick para diferentes fototipos*. ... 48
Tabela 8: Descrição do gradiente de eluição da fase móvel, mantido a 0,85 mL min-1 durante toda corrida cromatográfica. ... 52
Tabela 9: Volumes adicionados de filtros solares presentes nos protetores solares a partir de soluções estoques à 1 mg mL-1 (item 3.5.2.1). Soluções utilizadas para avaliação da exatidão. ... 54
Tabela 10: Conjunto de amostras com valores de FPS obtida in vivo, através do rótulo de produtos comerciais. Também são indicadas amostras preparadas em laboratório. ... 57
Tabela 10: Conjunto de amostras com valores de FPS obtida in vivo, através do rótulo de produtos comerciais. Também são indicadas amostras preparadas em laboratório. ... 58
Tabela 11: Distribuição dos filtros solares utilizados em protetores solares de oito diferentes fabricantes com base na descrição dos rótulos dos protetores solares comerciais pesquisados entre dezembro de 2012 e janeiro de 2013. ... 61
Tabela 12: Método cromatográfico na separação de 10 filtros solares utilizando a coluna ACE C18 (250 x 4,6 mm de 5 µm). ... 63
Tabela 13: Método cromatográfico na separação de 10 filtros solares utilizando a coluna ACE C18 (150 x 4,0 mm, 3 µm). ... 63
Tabela 14: Comparação entre os tempos retenção para duas colunas C18 de diferentes diâmetros de partícula. ... 66
Tabela 15: Parâmetros cromatográficos do método otimizado. ... 67
Tabela 16: Parâmetros da regressão linear. ... 72
Tabela 17: Resultados de recuperação média (n=3), para diferentes níveis de fortificação, dos filtros solares nas amostras de diferentes fabricantes e placebo. Em parênteses está expresso a estimativa dos respectivos desvios padrão. ... 75
Tabela 18: Coeficientes angulares médios (n=6) e coeficientes de variação para as curvas analíticas preparadas no solvente e no placebo para o ativo octil triazona. ... 76
Tabela 19: Resultados para precisão intra-dia (n=6). ... 77
Tabela 20: Resultados para concentração dos ativos e a precisão do inter-dias do método. ... 77
Tabela 21: Concentração média (%, m/m) dos filtros solares orgânicos determinados por HPLC-DAD nos protetores solares. ... 79
Tabela 21: Concentração média (%, m/m) dos filtros solares orgânicos determinados por HPLC-DAD nos protetores solares. ... 80 Tabela 22: Parâmetros para o modelo de regressão multivariada empregando PLS para o conjunto de 106 espectros NIR para as 53 amostras. ... 86 Tabela 23: Parâmetros para os modelos de regressão multivariada empregando PLS para cada uma das replicatas do conjunto de 53 amostras. ... 90 Tabela 24: Parâmetros para o modelo de regressão PLS para as amostras com FPS medidos in vivo. ... 92 Tabela 25: Parâmetros para o modelo de regressão linear PLS para as amostras comerciais utilizando os valores de FPS rotulado como valores de referência.. ... 93 Tabela 26: Conjunto de amostras empregadas para construção dos modelos de calibração PLS para dois diferentes fabricantes. ... 95 Tabela 27: Resultados para os modelos de regressão linear PLS para o conjunto de amostras de diferentes fabricantes e também para a combinação de suas amostras. ... 96 Tabela 28: Resultados para os modelos de regressão linear PLS para o conjunto de amostras para determinação do teor dos filtros solares. ... 103
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
AVO Butil metoxidibenzoilmetano (Avobenzona)
BZ Diidroxi Benzofenona
BZ3 Benzofenona-3
BZ4 Benzofenona-4
BZ8 Benzofenona-8
COLIPA
Associação Europeia de Cosméticos, Higiene Pessoal e Perfumaria (The European Cosmetic, Toiletry and Perfumery Association)
CTFA Associação de Cosméticos, Higiene Pessoal e Fragrância (The Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association)
DAD Detector de arranjo de fotodiodos
DBT Dietilexil butamido triazona
DHBZ 4,4-Diidroxi benzofenona
DHEB Dietilamino hidroxibenzoil hexil benzoato
DTS Drometrizol trisiloxano
EHT Etilexil triazona
EU União Europeia (European Union)
FDA
Departamento Americano de Saúde e Serviços Humanos – Agência de Administração de Alimentos e Drogas (Food and Drug Administration)
FPS ou SPF Fator de Proteção Solar (Sun Protection Factor)
HBZ 4-Hidroxibenzofenona
HMS Homosalato
HOMO Orbital molecular preenchido de maior energia (Highest Occupied Molecular Orbital)
HPLC Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (High Performance Liquid Chromatography)
INCA Instituto Nacional do Câncer
ISO Organização internacional de Padronização (International Organization for Standardization)
JCIA Associação Japonesa da Indústria de Cosméticos (Japan Cosmetic Industry Association)
LUMO Orbital molecular vazio de menor energia
(Lowest Unoccupied Molecular Orbital) MBC 4-Metilbenzelideno cânfora
MED Dose mínima eritematosa (Minimal Erythemal Dose) MTIP Metoxicinamato de isopentila
MTX Metoxicinamato de octila
NASA Agência Aeronáutica Nacional e Espacial (National Aeronautics and Space Administration)
NIR Infravermelho próximo (Near Infrared)
ODPaba Octil dimetil paba
OTC Medicamentos sem prescrição médica (Over-the-counter)
Paba Ácido p-aminobenzóico
PBSA Fenilbenzimidazol ácido sulfônico
PCA Análise de Componentes Principais (Principal Component Analysis)
PLS Mínimos quadrados parciais (Partial Least Square)
RDC Resolução da Diretoria Colegiada
Sal Salicilato de octila
TDSA Terafilideno dicânfora ácido sulfônico
TM Metileno bis-benzotriazolil tetrametilbutilfenol (Tinosorb M®)
SUMÁRIO
1 Introdução ... 18
1.1 Radiação solar... 18
1.2 Pele 19
1.2.1 Câncer de pele ... 22
1.2.2 Proteção da pele contra a radiação solar ... 23
1.3 Protetores solares ... 24
1.3.1 Filtros inorgânicos ... 29
1.3.2 Filtros orgânicos ... 30
1.4 Determinação da concentração de filtros solares ... 32
1.4.1 Fator de proteção solar ... 35
1.5 NIR (Espectroscopia de Infravermelho próximo) ... 37
1.6 Quimiometria ... 39 2 Objetivo ... 42 3 Experimental ... 43 3.1 Reagentes ... 43 3.2 Instrumentação ... 44 3.2.1 Determinação do FPS in vivo ... 44 3.2.2 Medidas NIR ... 44 3.2.3 Análise Cromatográfica ... 44
3.3 Seleção dos filtros solares ... 44
3.4 Amostras de protetores solares ... 45
3.5 Procedimentos... 47
3.5.1 Determinação do FPS – ensaios in vivo ... 47
3.5.2 Análises Cromatográficas ... 51
3.5.3 Condições cromatográficas ... 52
3.5.4 Desenvolvimento e validação do método HPLC-DAD ... 52
3.5.5 Construção de modelos de calibração multivariados empregando espectroscopia NIR e Quimiometria ... 56
4 Resultados e Discussões ... 60
4.1 Seleção dos filtros solares ... 60
4.2 Desenvolvimento do método cromatográfico ... 62
4.4 Construção de modelo multivariado para previsão de FPS ... 81
4.4.1 Análise de componentes principais para o conjunto de amostras ... 83
4.4.2 Modelo PLS para determinação do FPS ... 85
4.4.3 Modelo de calibração para amostras com FPS obtidos in vivo ... 91
4.4.4 Modelo de calibração para amostras comerciais... 93
4.4.5 Modelo de calibração para previsão de FPS de amostras comerciais de mesmo fabricante 94
4.4.6 Modelos PLS para determinação da concentração dos filtros solares ... 99
5 Conclusões ... 104
1 Introdução
1.1 Radiação solar
No momento em que a energia solar deixa sua atmosfera, o espectro eletromagnético emitido se encontra em sua forma mais pura (Figura 1 – indicado em amarelo). Após deixar a superfície solar, a radiação percorre cerca de 150 106 km até atingir a Terra (Aschwanden, 2006). Durante esse percurso ocorrem interações com o ambiente ao seu redor que fazem com que a energia dessa radiação seja dissipada e atenuada (Figura 1 – indicado em vermelho).
Figura 1: Espectro solar.
(Adaptado de NTNU, Norges teknisk-naturvitenskapelige universitet)
As atenuações da radiação solar ocorrem de forma mais significativa devido a três fatores associados à atmosfera terrestre (Rothschild & Lister , 2003):
Vapor d’água: a radiação solar que passa pelo vapor é espalhada e refletida e, como a maior densidade de vapor d’água é observada nas regiões tropicais do planeta, a atenuação da radiação é mais efetiva nessas regiões.
Micropartículas presentes na atmosfera (como areia, fuligem e outros materiais) funcionam como filtros, absorvendo e refletindo a radiação. Quando a atmosfera está mais limpa e seca a atenuação é bem menor.
As moléculas de água e de oxigênio possuem capacidade de absorver a energia da radiação solar na região do infravermelho e visível. Já o ozônio (O3)
tem a capacidade de absorver a radiação solar na região do ultravioleta, mais especificamente a radiação na região do UVC (de 280 a 200 nm). A Figura 2 mostra a distribuição da densidade de ozônio na atmosfera terrestre, medida em unidade Dobson ao longo de vinte e cinco anos, compreendendo o período de 1979 a 2014. Quanto mais próximo de 550, na escala Dobson (vermelho), maior será a concentração de ozônio na atmosfera terrestre e quanto mais próximo de 110 (violeta) menor é a sua concentração. Nesta figura é possível visualizar que a distribuição de ozônio não é homogênea e que ao longo dos anos sua concentração está sofrendo uma grande redução, comprometendo a capacidade de absorver a radiação UV. Aparentemente nos últimos 15 anos a quantidade de ozônio presente na atmosfera tem se mantida estável, embora um dano à camada já tenha sido ocasionada quando se compara as avaliações inicias em 1979, no qual havia sido detectado um buraco com extensão de 0,1 106 km2 com a atual, que é de aproximadamente 20 106 km2 (NASA, Ozone
Hole Watch).
Figura 2: Distribuição do ozônio sobre a Terra ao longo de, aproximadamente, 35 anos. 1) 10/1979,
2) 10/1985, 3) 10/1994, 4) 10/2008, 5) 10/2010 e 6) 10/2014. (Adaptado NASA, Ozone Hole Watch).
1.2 Pele
A radiação solar que atinge a atmosfera terrestre é absorvida pela pele do ser humano e desencadeia diversos processos sobre o organismo. A região do espectro que pode causar os efeitos mais nocivos ao ser humano é a ultravioleta (UV), compreendida entre 200 – 400 nm e a região do infravermelho.
A radiação solar na região do infravermelho pode causar queimaduras na pele, acarretando desde uma simples vermelhidão até queimaduras mais profundas, além de provocar insolação devido o excesso de aquecimento corporal(Gilbertz et
al, 2011).
Já os danos causados ao ser humano, relacionados à exposição da radiação na região do ultravioleta, estão associados a alterações genéticas. Estas se devem principalmente a capacidade das moléculas mais importantes do organismo humano, como proteínas e os ácidos nucleicos, absorverem a radiação no comprimento de onda da região do ultravioleta (Cestari et al, 2012). Dentre as doenças associadas a alterações genéticas ocasionadas pela radiação solar, o câncer de pele é a mais conhecida.
Baseado nos efeitos causados à pele, o intervalo da região do ultravioleta é subdividido em três regiões (Flor et al, 2007):
UVA (400 – 320 nm): região responsável pelo bronzeado, foto envelhecimento cutâneo, com relaxamento e perda de firmeza da pele e o aparecimento de rugas, intolerância solar (alergias solares), desordens pigmentares e desenvolvimento de cancros cutâneos;
UVB (320–280 nm): região responsável pela formação do eritema e por alterações genéticas no organismo, pelo bronzeado, pelas queimaduras, reações alérgicas e cancros cutâneos;
UVC (280 - 200 nm): essa região é conhecida como germicida e é a mais perigosa para o ser humano, porém hoje, ela é praticamente absorvida em sua totalidade pelo oxigênio e o ozônio da atmosfera.
A pele tem três camadas, a epiderme (mais externa), a derme e a hipoderme, ou tecido subcutâneo (Gilbertz et al, 2011) (Figura 3):
Figura 3: Estrutura da pele. (Adaptado do NCI, National Cancer Institute, EUA).
Epiderme: é a camada mais fina e dividida em quatro estratos: o córneo, o granuloso, espinhoso e basal. As células basais dão origem aos queratinócitos, também chamados células escamosas, que produzem queratina e impermeabilizam a pele. Nesta região existem também os melanócitos, células que produzem melanina, pigmento que dá cor à pele e propriedades que lhe conferem uma eficiente proteção contra os raios ultravioletas. Entre os humanos não existe diferença de contagem de melanócitos, contudo pessoas negras produzem mais melanina e, portanto, os malefícios causados pela radiação solar nesses indivíduos são menores. É nessa camada que o câncer surge.
Derme: camada intermediária da pele, formada por fibras de colágeno, elastina e gel coloidal, que conferem a tonicidade, elasticidade e equilíbrio à pele; apresenta uma grande quantidade de vasos sanguíneos e terminações nervosas. É mais espessa que a epiderme e abriga as glândulas sudoríparas, folículos pilosos (as raízes dos pelos), vasos sanguíneos e nervos.
Hipoderme (ou tecido subcutâneo): é a terceira e última camada da pele, formada basicamente por células de gordura. Dessa forma, sua espessura é bastante variável, conforme a constituição física de cada pessoa. Ela faz a junção da epiderme e derme ao resto do seu corpo e dá suporte a elas. Além
disso, a hipoderme mantém a temperatura do corpo, acumula energia para o desempenho das funções biológicas e auxilia na proteção dos órgãos internos.
1.2.1 Câncer de pele
O câncer de pele é o mais frequente no Brasil e corresponde a 25% de todos os tumores malignos registrados no país (INCA, Instituto Nacional de Câncer, 2014). Alguns estudos demonstram que países próximos a regiões dos trópicos possuem maior incidência deste câncer em comparação a outras regiões do mundo. Ele apresenta altos percentuais de cura, se for detectado precocemente.
Devido ao alto grau de complexidade dos constituintes da pele, existem inúmeros casos de diferentes linhagens de câncer, divididos em dois principais grupos: câncer de pele não-melanoma e os melanomas.
Entre os tumores de pele, o tipo não-melanoma é o de maior incidência e de menor mortalidade. As linhagens mais frequentes são carcinoma basocelular, responsável por 70% dos diagnósticos, e o carcinoma espinocelular, representando 25% dos casos. O carcinoma basocelular, apesar de mais incidente, é também o menos agressivo (INCA, Instituto Nacional de Câncer).
Já o melanoma é bem mais raro que os carcinomas baso e espinocelular, representando cerca de 5% de todos os casos reportados. Contudo, é uma doença bem mais grave, no entanto, se descoberto no seu estágio inicial, o melanoma quase sempre apresenta cura. Porém, se diagnosticado tardiamente, tende a se espalhar para outras partes do corpo em um processo chamado metástase (INCA, Instituo Nacional de Câncer).
Uma estimativa realizada pelo Instituto de Câncer dos Estados Unidos (NCI, National Cancer Institute), demonstrou o aumento da incidência de melanoma na população Norte Americana (Figura 4). A sobrevida do paciente é acompanhada até 5 anos após a recuperação do paciente.
Figura 4: Estimativa de casos de câncer de pele nos Estados Unidos. (A) Distribuição de novos
casos de câncer de pele e mortes no intervalo de 1992 a 2010 e (B) Relação entre novos casos e sobrevida - considerando o intervalo de 2004 a 2010. (Adaptado de NCI, National Cancer Institute).
Um levantamento realizado pelo INCA atribuiu 1.507 mortes (842 homens e 665 mulheres) decorrentes ao melanoma em 2010 (INCA, Instituto Nacional do Câncer). Já em 2014 estimou-se 98.420 novos casos de câncer de pele não melanoma nos homens e 83.710 nas mulheres no Brasil(INCA, 2014).
1.2.2 Proteção da pele contra a radiação solar
Existem dois mecanismos de proteção natural da pele contra a absorção da radiação solar:
Melanina: sua síntese ocorre na camada basal da epiderme, a função da mesma é transformar a radiação solar absorvida em calor e radiação fluorescente.
Estrato córneo: O estrato córneo é a parte mais externa da pele e é constituída de células mortas compostas basicamente por queratina que conferem a capacidade de absorção e reflexão da radiação. Além do processo físico de reflexão da radiação, ocorre também a proteção da pele por mecanismos antioxidativos produzidos pela ação dos queratinócitos.
Apesar dos mecanismos naturais de defesa do organismo, eles não são considerados suficientes para proteger a pele contra a radiação solar e dessa forma faz-se necessário a utilização de outras estratégias para reduzir ao máximo a absorção de radiação solar pela pele, como:
Barreira física: Essa é a forma mais fácil e de menor custo de prevenção. Compreende a utilização de vestuário e acessórios, como chapéu, que impedem que a radiação solar entre em contato direto com a pele.
Controlar o intervalo de horário de exposição solar: a radiação solar é menos intensa no Brasil entre as 10 horas da manhã e depois das 16 horas da tarde. Contudo, esse é o método menos aconselhável, pois esse intervalo de tempo protege a pele majoritariamente apenas contra radiação UVA. Além disso, as condições ambientais são muito diferentes nas diferentes regiões do planeta. Filtros solares: são agentes químicos ou físicos de uso tópico capazes de filtrar
a radiação ultravioleta que atinge a pele. Os protetores solares são os produtos comercializados que contém em sua composição os filtros solares. Os protetores solares podem se apresentar em diferentes formas – gel, emulsão ou spray.
1.3 Protetores solares
O protetor solar tem sido um importante aliado contra a exposição excessiva da pele aos raios solares. Referências a sua utilização podem ser encontradas desde o século XIX (Urbach, 2001; Schalka & Reis, 2011), porém, somente no século XX, a sociedade e a comunidade científica voltaram suas atenções para os efeitos nocivos que o sol pode causar a saúde humana. A primeira patente de um produto com proteção solar foi registrada em torno de 1950 nos Estados Unidos, pela empresa Coppertone. No entanto, somente em 1978 foi criado o primeiro registro normativo da agência Norte Americana FDA (Food and Drug
Administration) visando à regulamentação para fabricação desse tipo de produto. Já
no Brasil o primeiro produto com proteção solar foi produzido pela Johnson & Johnson, em 1984(Johnson & Johnson do Brasil).
Um panorama que ilustra o crescimento dos esforços da comunidade científica nas pesquisas relacionadas aos filtros solares é a quantidade de artigos
publicados em revistas científicas. Uma comparação simples, inserindo a palavra chave “sunscreen” no Science Direct, mostra que em 1995 foram publicados 134 artigos e, em 2014, foram 1.040, ou seja, um aumento de quase 8 vezes em um período de dez anos.
A ANVISA, por meio da Resolução RDC 47 (ANVISA, 2006), tem autorizado o uso de 33 substâncias como filtros solares, das quais, dentre essas, somente 16 são aprovadas para uso livre pela Agência Norte Americana FDA segundo o CFR – Code of Federal Regulations Title 21(FDA, 2014) e 27 pela União Europeia(EU, Cosmetics Directive 76/768/EEC). Nos Estados Unidos, a legislação que regulamenta os protetores solares é a mesma que regulamenta os medicamentos vendidos sem prescrição no país, produtos conhecidos como OTC (over-the-counter).
A Tabela 1 apresenta os filtros solares e suas concentrações máximas permitidas no Brasil, Estados Unidos e na União Europeia. Como pode ser visto nesta tabela a maioria dos compostos utilizados como filtros solares são moléculas orgânicas e apenas o dióxido de titânio e óxido de zinco possuem características inorgânicas.
Tabela 1: Lista de filtros solares e as suas quantidades máximas que podem ser empregados em
protetores solares, autorizados pelas agências reguladoras brasileira, americana e europeia.
N° Filtros solares autorizados (Nomenclatura de acordo com INCI*)
Concentrações máximas permitidas nos protetores solares (%, m/m) Brasil
(ANVISA) EUA (FDA)
Comunidade Europeia
(EU)
1 Metassulfato benzalcônio cânfora 6 --- 6
2 Tereftalilideno dicânfora ácido sulfônico 10 --- 10
3 Butil metoxidibenzoilmetano 5 3 5
4 Benzelideno cânfora ácido sulfônico e seus sais 6 --- 6
5 Octocrileno 10 10 10
6 Metoxicinamato de etoxietila 3 3 ---
7 Benzofenona-8 3 3 ---
8 Antranilato de mentila 5 5 ---
9 Salicilato de trietanolamina 12 12 ---
10 Fenilbenzimidazol ácido sulfônico
(e sais de sódio, potássio e trietiamina) 8 4 8
11 Metoxicinamato de octila 10 7,5 10
12 Benzofenona-3 10 6 10
13 Benzofenona-4 10 10 ---
14 Benzofenona-5 5 --- 5
15 Ácido para-aminobenzóico (PABA) 15 15 5
16 Homosalato 15 15 10
17 Poliacrilamidometil benzelideno cânfora 6 --- 6
18 Dióxido de titânio 25 25 25
19 Etoxi aminobenzoato de etila 10 --- 10
20 Octil dimetil paba 8 8 8
21 Salicilato de octila 5 5 5 22 Metoxicinamato de isopentila 10 --- 10 23 Metilbenzilideno cânfora 4 --- 4 24 Benzilideno cânfora 2 --- 2 25 Octil triazona 5 --- 5 26 Óxido de zinco 25 25 --- 27 Drometrizol trisiloxano 15 --- 15
28 Dietilexil butamido triazona 10 --- 10
29 Metileno bis-benzotriazolil tetrametilbutilfenol 10 --- 10
30 Bisimidazolato 10 --- 10
31 Bis-etilexiloxifenol metoxifenil triazina 10 --- 10
32 Polisilicone 15 10 --- 10
33 Dietilamino hidroxibenzoil hexil benzoato 10 --- 10
*EU, Cosmetics Directive 96/335/EC.
Mediante uma pesquisa de mercado realizada em 2012 (ver item 3.3) junto a farmácias e revendedoras na cidade de Campinas, SP, foram avaliados os componentes mais recorrentes nas oito principais marcas comerciais de protetores
solares. Foi verificado que 13 filtros solares (Tabela 2) são utilizados com mais frequência em protetores solares, tipo emulsão, comercializados no Brasil. Isso representa, aproximadamente, 40% dos filtros permitidos pela ANVISA.
Tabela 2: Lista de filtros solares orgânicos mais utilizados nas principais marcas de protetores solares
no Brasil. continua Composto Nomenclatura INCI (Sinônimo) Abreviatura
(CAS) Fórmula Estrutural Faixa Espectral
Octocrileno (2-Ciano-3,3-difenilacrilato de 2-etilexil) OCT (6197-30-4) Proteção UVB max: 303 nm Butil metoxidibenzoil-metano (Avobenzona) AVO (70356-09-1) Proteção UVA max: 358 nm Dióxido de titânio TiO2 (13463-67-7) TiO2 Proteção em amplo espectro (UVA e UVB) Tereftalideno dicânfora ácido sulfônico TDSA (92761-26-7) Proteção UVA max: 345 nm Etilexil salicilato (Salicilato de octila) SAL (118-60-5) Proteção UVB max: 306 nm Benzofenona-3 BZ3 (131-57-7) Proteção UVB max: 288 nm
Tabela 2: Lista de filtros solares orgânicos mais utilizados nas principais marcas de protetores solares no Brasil. continuação Composto Nomenclatura INCI (Sinônimo) Abreviatura
(CAS) Fórmula Estrutural Faixa Espectral Etilexil triazona (Octil triazona) EHT (88122-99-0) Proteção UVB max: 314 nm Bis-etilexiloxifenol metoxifenil triazina (Tinosorb® S) TS (187393-00-6) Proteção em amplo espectro (UVA e UVB) Homosalato (Salicilato de homomentila) HMS (118-56-9) Proteção UVB max: 305 nm Fenilbenzimidazol ácido sulfônico (Ácido 2- fenilbenzimidazol-5-sulfônico) PBSA (27503-81-7) Proteção UVB max: 306 nm Metoxicinamato de octila (4-Metoxicinamato de 2-etilexila) MTX (5466-77-3) Proteção UVB max: 310 nm Dietilamino hidroxibenzoil exil benzoato (Uvinul T A plus) DHEB (302776-68-7) Proteção UVA max: 354 nm
Tabela 2: Lista de filtros solares orgânicos mais utilizados nas principais marcas de protetores solares no Brasil. continuação Composto Nomenclatura INCI (Sinônimo) Abreviatura (CAS)
Fórmula Estrutural Faixa Espectral Metileno bis-benzotriazolil tetrametilbutilfenol (Tinosorb® M) TM (103597-45-1) Proteção em amplo espectro (UVA e UVB)
Para produção de um protetor solar que seja efetivamente eficiente contra a radiação, deve-se adicionar ao produto uma combinação dessas substâncias, uma vez que cada substância possui a capacidade de absorção e/ou reflexão da radiação em um intervalo específico de comprimento de onda. Essa combinação de substâncias deve permitir que ocorra ampliação da faixa de comprimento de onda da radiação solar que é bloqueada pelo protetor solar, melhorando a sua qualidade de proteção à radiação solar nociva a pele.
1.3.1 Filtros inorgânicos
O mecanismo de ação dos filtros solares com características inorgânicas (óxido de zinco e dióxido de titânio) ocorre por espalhamento, reflexão e absorção (em menor quantidade) da radiação solar, e o mecanismo de ação depende do índice de reflexão, tamanho das partículas, a dispersão da substância na emulsão do protetor solar e a espessura do filme formado sobre a pele. Devido à predominância da reflexão e espalhamento da radiação, os filtros inorgânicos são considerados mais seguros sendo capazes de oferecer proteção em amplo espectro (contra os raios UVA e UVB) e apresentarem baixo risco de irritação. Por essas características eles são os compostos mais recomendados no preparo de protetores solares para uso infantil e para pessoas com peles sensíveis (Flor et al, 2007; Serpone et al, 2007).
A incorporação dos filtros inorgânicos nos protetores solares ocorre por dispersão e, dessa forma, o tamanho das partículas influencia diretamente na eficácia, espalhabilidade e homogeneidade do produto.
O desenvolvimento e avanço da nanotecnologia permitiu a produção de filtros inorgânicos com óxidos nano-particulados, os quais tem apresentado um melhor desempenho nos protetores solares (Serpone et al, 2007).
1.3.2 Filtros orgânicos
A capacidade dos filtros solares orgânicos de absorver a radiação solar deve-se essencialmente a presença de compostos aromáticos com grupos carboxílicos nas moléculas. As estruturas dos principais filtros orgânicos estão apresentadas na Tabela 2.
Ao absorver a radiação UV, os elétrons presentes no orbital molecular preenchido de maior energia (HOMO, highest occupied molecular orbital) são excitados para o orbital molecular vazio de menor energia (LUMO, lowest
unoccupied molecular orbital). Quando os elétrons retornam ao seu estado
fundamental ocorre liberação de energia. A radiação UV de alta energia que foi absorvida é transformada em outros tipos de energia, como o calor, que são menos lesivas à pele.
A energia da radiação solar na região do UV que é absorvida pelas moléculas dos filtros solares pode levar a reações fotoquímicas, como isomerização cis-trans, tautomerismo ceto-enólico, reações entre os filtros solares orgânicos ou produtos de degradação e/ou a formação de radicais livres (Kockler et al, 2012). A fotodegradação e a formação de radicais livres podem ocasionar duas importantes consequências:
Perda da eficiência da proteção contra a radiação solar, reduzindo assim o FPS do produto (Kockler et al, 2012).
Possível geração de substâncias com potencial alergênico. Algumas substâncias ainda autorizadas pelos órgãos de regulamentação são conhecidas pelo seu potencial fotoalergênico, entre essas, se destacam o paba e octilidimetilpaba (Lowe, 2006; Nash, 2006) (Figura 5 A e B).
Figura 5: Estruturas dos filtros solares orgânicos (A) paba e (B) octildimetilpaba. Em vermelho estão
indicados os principais grupos responsáveis pela fotoalergenicidade das moléculas(Nash, 2006).
O princípio da ação alergênica desses compostos é resultado de fotoativação e fotodegradação, que induz a formação de radicais livres de oxigênio. Assim, os benefícios que a utilização dessas substâncias proporciona são reduzidos quando comparados com as consequências negativas que a utilização desses compostos pode trazer no futuro.
A descoberta desse potencial alergênico presente em alguns filtros solares empregados em protetores solares criou uma demanda no mercado, exigindo que as empresas se adaptassem e que procurassem desenvolver novos produtos.
Essa demanda exigiu investimento das indústrias em pesquisas que permitissem a redução das concentrações dos compostos sem comprometer a capacidade de fotoproteção e que ainda reduzissem o potencial alergênico nos protetores solares.
Em 2000, a atualização da resolução da ANVISA (2006) levou à introdução de novos filtros solares que possuíam maior capacidade de absorção e proteção à radiação em uma faixa mais ampla do UVA e UVB, sendo conhecidos como filtros solares de amplo espectro. Além da alta capacidade na absorção da radiação, vários estudos mostraram que esses filtros possuem alta estabilidade nos produtos finais (Couteau et al, 2007; Wong & Orton, 2011). Na Figura 6 são apresentados os espectros de um composto com capacidade estreita de absorção na faixa do UV-VIS (MTX), um composto com maior capacidade de absorção (EHT) e compostos com capacidade de absorção em amplo espectro (TM e TS).
Figura 6: Espectros de absorção na faixa do UVA e UVB. (A) MTX, (B) EHT , (C) TM e (D) TS.
(Adaptado de BASF, 2011).
1.4 Determinação da concentração de filtros solares
Existem várias opções de métodos analíticos disponíveis para doseamento de filtros solares em protetores solares (Rastegarzadeh et al, 2013; Sánchez-Brunete et al, 2011; Peruchi & Rath, 2012; Orsi et al, 2006), porém devido à baixa volatilidade e alta polaridade dos filtros orgânicos, a cromatografia líquida de alta eficiência é a técnica mais utilizada no desenvolvimento de métodos de quantificação para esses compostos. Uma vez que todos os filtros solares orgânicos tem a capacidade de absorver a radiação na região do UV e sua grande maioria está presente em elevadas concentrações nas formulações (de 2 a 15%, m/m, Tabela 1), o detector de arranjo de fotodiodos (DAD) tem sido o mais empregado na etapa de quantificação após separação cromatográfica.
Atualmente, os maiores desafios relacionados aos métodos cromatográficos de doseamento de filtros solares está na separação de um número elevado de substâncias de polaridades diversas em uma única corrida cromatográfica em um tempo reduzido de análise. Com a disponibilidade de colunas cromatográficas de diâmetro de partículas menores do que 5 µm e equipamentos de
ultra-alta eficiência que suportam elevadas pressões esses objetivos têm sido alcançados.
Recentes trabalhos indicaram a utilização de métodos cromatográficos para determinação de mais de 10 filtros orgânicos (Benedé et al, 2014; Tsui et al, 2014), no entanto, nestes as corridas cromatográficas são longas, ou seja, a separação requer mais de 30 minutos. Esse tempo é longo e desvantajoso na indústria, onde resultados para controle de qualidade devem ser liberados em pouco tempo. Ainda, tempos longos requerem volumes elevados de solventes e dedicação do equipamento, que são desvantajosos do ponto de vista econômico.
Atualmente as pesquisas destinadas exclusivamente para o desenvolvimento de métodos de determinação de filtros solares em protetores solares têm sido mais escassas, pois a grande maioria desses compostos já foi amplamente estudada. Contudo, considerando o contexto onde as indústrias sempre investem em inovação e desenvolvimento de novas moléculas com o propósito de serem utilizados em protetores solares, os métodos desenvolvidos que podem ser aplicados em rotinas de controle de qualidade necessitam ser revisados e otimizados. Na Tabela 3 estão apresentados alguns trabalhos reportados na literatura que objetivaram a determinação de filtros solares orgânicos em protetores solares empregando a HPLC-DAD.
Tabela 3: Trabalhos publicados com aplicação em determinação de filtros solares em protetores
solares por HPLC-DAD.
continua Número de filtros orgânicos Compostos analisados Tempo de análise (minutos) Referências 11 PBSA, BZ4, BZ3, MBC, MTX, OCT, DHEB, AVO,
TS, TM e EHT
30 Orsi et al, 2006
7 BZ4, BZ3, AVO, ODPaba,
MTX, HMS e Sal 20 Chisvert et al, 2001
8
MTX, BZ3, AVO, SAL, MBC, ODPaba,
PBSA e OCT
20 Simeoni et al, 2005
3 BZ4, TDSA, e PBSA 6 Chisvert & Salvador, 2002
16
Paba, HMS, BZ3, PBSA, TDSA, AVO, OCT, MTX, MTIP, EHT, DTS, DBT, MBC, SAL, ODPaba e BZ4
30 Schakel et al, 2004
6 BZ3, ODPaba, MTX, OCT,
SAL e MA 45 Dinunzio & Gadde, 1990
Tabela 3: Trabalhos publicados com aplicação em determinação de filtros solares em protetores
solares por HPLC-DAD.
continuação Número de filtros orgânicos Compostos analisados Tempo de análise (minutos) Referências 5 BZ3, ODPaba, MTX, MBC,
AVO 15 Scalia et al, 2000
4 TS, BZ3, MTX, AVO 30 Dencausse et al, 2008
8 BZ3, OCT, ODPaba, AVO,
HMS, SAL, MBC e MTX 20 Peruchi & Rath, 2012
15 BZ3, SAL, MTIP, MBC, OCT, ODPaba, MTX, AVO, HMS, DBT, EHT, DTS, TM, TS e DHEB 30 Chisvert et al, 2013 12
PBSA, BZ3, MTIP, DHEB, OCT, MTX, SAL, AVO,
DBT, EHT, TM e TS
30 Nyeborg et al, 2010
Legenda: AVO: butil metoxidibenzoil metano, BZ3: benzofenona-3, BZ4: benzonfenona-4, DBT: dietilexil butamido triazona, DHEB: dietilamino hidroxibenzoil exil benzoato, DTS: drometrizol trisiloxano, EHT: etilexil triazona, HMS: homosalato, MBC: 4-metilbenzelideno cânfora, MTIP: metoxicinamato de isopentila, MTX: metoxicinamato de octila, OCT: octocrileno, ODPaba: octildimetilpaba, PBSA: fenilbenzimidazol ácido sulfônico, SAL: salicilato de octila, TDSA: terafilideno dicânfora ácido sulfônico, TM: metileno bis-benzotriazolil tetrametilbutilfenol, TS: bis-etilexiloxifenol metoxifenil triazina e MA: metil antranilato.
Nos últimos anos verificou-se que o foco do desenvolvimento de métodos analíticos envolvendo a determinação de filtros orgânicos está direcionado para a sua determinação em outras matrizes que não sejam cosméticas. Os principais campos de aplicação para os métodos desenvolvidos recentemente envolvem investigações de filtros solares como agentes de contaminações em solo e água, efeitos dos filtros solares na toxicidade humana, fotoestabilidade, entre outros (Tabela 4). Nestes casos, de modo geral, as concentrações são bem menores do que aquelas encontradas nos protetores solares (na ordem de ng g-1) e devido à complexidade das matrizes requerem detectores seletivos e que também permitam a confirmação de identidade. Neste sentido, a cromatografia líquida associada à espectrometria de massas sequencial (LC-MS/MS) tem sido a técnica de escolha. No entanto, em estudos nos quais as concentrações dos filtros orgânicos estão presentes nas amostras com valores comparáveis àquelas encontradas nos protetores solares, a técnica por HPLC com detectores UV ou DAD ainda tem sido aplicados. Exemplos são os estudos de fotoestabilidade ou mesmo no desenvolvimento de procedimentos de preparo de amostras (Tabela 4).
Tabela 4: Trabalhos publicados nos últimos cinco anos para determinação de filtros solares. Campo de
aplicação Preparo de amostra
Compostos analisados Técnica empregada Referência s Preparo de amostra
Micro extração por barra de agitação com capacidade adsortiva SAL BZ3, MTX, ODPaba, HMS, MTIP, MBC e OCT HPLC-UV Benedé & Chisvert, 2014 Ambiental
Várias etapas de filtração em SPE, centrifugação e secagem da amostra sob
vácuo e nitrogênio AVO, BZ, BZ3, BZ4, BZ8, SAL, HMS, MTIP, MBC, OCT e ODPaba LC-MS/MS Tsui et al, 2014 Resíduos em amostra biológica Centrifugação, seguido de hidrólise com enzimas e
utilização de SPE BZ3 LC-MS/MS Dewalque et al, 2014 Determinação de filtros solares em em batons, maquiagens, pós-barba, etc. Emprego de solvente de extração sob ultrassom e homogeneizador mecânico
com mistura de: acetona, metanol, EDTA e adição de
padrão interno
AVO, MTX, OCT, TS, SAL, EHT, PBSA, TM, DBT, DTS, TDSA, HMS, BZ3, ODPaba, MTIP, BZ4, MBC HPLC-UV Manová et al, 2013 Ambiental
Amostras de peixe tratadas com adição de solvente, padrão interno isotópico com posterior secagem e
uso de PLE BZ, BZ3, HBZ, DHBZ, MBC, MTX, OCT e ODPaba LC-MS/MS Gago-Ferrero et al, 2013 Ambiental Microextração em metanol com adição de diferentes
solventes de extração e centrifugação para separação de fases
BZ, BZ3, Sal e HMS HPLC-UV Zhang & Lee, 2012
Ambiental
SPE, seguido de secagem sob nitrogênio e ressuspensão em solvente de cromatografia BZ3, MBC, OCT, AVO, MTX, SAL e HMS HPLC-UV e quimiometria Vosough & Mojdehi, 2011 Preparo de amostra Adsorção em multicamadas de Polietileno BZ3, MBC, OCT, ODPaba MTX, AVO, SAL, HMS, TS e TM
HPLC-UV Moreta & Tena, 2011
Fotoestabilidade Diluição em isopropanol MTX, BZ3 e OCT HPLC-UV
Gaspar & Campos,
2010 Legenda: AVO: butil metoxidibenzoilmetano, BZ: diidroxi benzofenona, BZ3: benzofenona-3, BZ4: benzonfenona-4, BZ8: benzonfenona-8, DBT: dietilexil butamido triazona, DHBZ: 4,4-diidroxi benzofenona, DHEB: dietilamino hidroxibenzoil exil benzoato, DTS: drometrizol trisiloxano, EHT: etilexil triazona, HBZ: 4-hidroxibenzofenona, HMS: homosalato, MBC: 4-metilbenzelideno cânfora, MTIP: metoxicinamato de isopentila, MTX: metoxicinamato de octila, OCT: octocrileno, ODPaba: octildimetilpaba, PBSA: fenilbenzimidazol ácido sulfônico, SAL: salicilato de octila, TDSA: terafilideno dicânfora ácido sulfônico, TM: Tinosorb M, TS: Tinosorb S.
1.4.1 Fator de proteção solar
Para avaliar a eficiência e a capacidade de um protetor solar contra a radiação, foi desenvolvido um fator de correlação numérico, o qual é conhecido como FPS (fator de proteção solar). O FPS é medido através da resposta eritematosa (queimadura solar) da pele à radiação ultravioleta. O FPS é a razão calculada entre a energia necessária para indução de uma resposta eritematosa
mínima (MED) entre uma pele protegida pelo produto e a mesma pele sem proteção. O teste é realizado in vivo em voluntários humanos.
Em 2006, foi elaborado e publicado um método de referência (CTFA, COLIPA, CTFA-SA, JCIA, 2006) para avaliação do FPS, com a participação das indústrias europeias, japonesas, americanas e africanas. Em 2010 esse método foi atualizado e convertido em uma ISO, pela International Organization for
Standardization (ISO 24444:2010). Embora esse método seja o único método oficialmente aceito no mundo para realização do teste, existem vários questionamentos em relação a sua robustez (Schalka & Reis, 2011; Pathak, 1982):
I. Segundo a normativa não é permitido a participação do voluntário que tenha sido exposto ao sol ou tenha participado de testes de determinação do FPS por pelo menos 2 meses; contudo não há uma avaliação que indique que essa regra seja obedecida;
II. Quantidade de produto aplicado: a normativa padroniza que a quantidade de produto aplicado no voluntário para determinação do FPS seja de 2 mg cm-2. Esse valor não condiz com a média do produto realmente utilizada pela população mundial, que usualmente é de 1 mg cm-2, ou seja, o real fator de proteção é menor que o determinado (Couteau et al, 2012; Kim et al, 2009);
III. Seleção de resultados: para a realização do teste um grupo de 20 voluntários é selecionado, porém, ao final do estudo é permitida a exclusão de até 50% de resultados que não estejam de acordo com o valor esperado;
IV. Resultado final é obtido através de um método subjetivo, permitindo questionamentos de reprodutibilidade e repetitividade;
V. Coeficiente de variação: é admitida uma variação de até 17% em relação ao resultado final de FPS esperado (CTFA, COLIPA, CTFA-SA, JCIA, 2006; ISO 24444:2010);
VI. Questionamentos éticos: a participação do voluntário nesse teste implica que o mesmo receberá radiação ultravioleta artificial diretamente na pele por um período determinado para o surgimento do eritema. Tendências no mundo científico apontam para esforços em evitar cada vez mais o envolvimento de humanos e animais na participação de testes científicos.
Em um trabalho prévio realizado por Peruchi (2010) foi evidenciada a possibilidade de empregar a fluorescência de raios-X associada à quimiometria para a determinação do FPS em loções solares. Embora essa técnica tenha apresentado resultados promissores, o equipamento para a realização das medidas não é muito habitual em laboratórios de análise de cosméticos. Desta forma, neste trabalho foi avaliada a possibilidade do emprego da técnica de Espectroscopia no Infravermelho Próximo (NIR) associada à quimiometria para a determinação do FPS.
1.5 NIR (Espectroscopia no Infravermelho Próximo)
De um modo geral, técnicas espectroscópicas estudam a interação da radiação eletromagnética e a matéria. No caso da Espectroscopia no Infravermelho Próximo (NIR, Near Infrared Spectroscooy), que abrange a região do espectroeletromagético de 750 nm – 2.500 nm (14.300 – 4.000 cm-1
), a interação da radiação com moléculas causa variações de movimentos vibracionais e rotacionais das ligações entre os átomos. Essa técnica é majoritariamente utilizada para moléculas nas quais grupos funcionais orgânicos possuem ligações como C-H, O-H e N-H (Pasquini, 2003; Souza et al, 2013).
Utilizando a teoria do oscilador harmônico e anarmônico é possível descrever a interação entre a radiação e a matéria como transições entre níveis de energia, originando as bandas observadas no espectro do infravermelho, onde representa número quântico vibracional (Figura 7).
Figura 7: Modelo de representação do oscilador harmônico (em verde) e oscilador anarmônico (em
Na teoria do oscilador harmônico as transições eletrônicas só podem ocorrer quando o número quântico vibracional variar em uma unidade ( = ±1), ou seja, as transições permitidas só ocorrem entre níveis adjacentes. Esse modelo fundamenta o entendimento nas transições vibracionais fundamentais, que não podem ser observadas na região do infravermelho próximo, contudo são importantes para compreensão das bandas encontradas nos espectros NIR.
No entanto, as transições que são visualizadas em maior proporção nos espectros de NIR não podem ser explicadas por esse modelo, pois as bandas observadas nesta região envolvem transições vibracionais entre níveis não adjacentes.
Neste caso, as transições vibracionais entre os níveis não adjacentes podem ser explicadas pelo modelo de oscilador anarmônico (Figura 7). Diferente do modelo harmônico, este modelo considera a repulsão entre nuvens eletrônicas quando os núcleos atômicos se aproximam e a força de ligação quando os átomos se distanciam uns dos outros. Além disso, neste modelo o número quântico vibracional pode assumir valores diferentes de 1, permitindo transições entre níveis não adjacentes. Mesmo sendo possíveis números quânticos superiores à 1, apenas transições para três números quânticos são mais comumente observadas. As bandas de absorção aparecem aproximadamente nas frequências de 1 (banda fundamental), 2 e 3 (sobretons). Estes últimos têm uma menor intensidade em relação à banda fundamental de cerca de 10 e 100 vezes, respectivamente. Os sobretons são observados entre 780 e 2.000 nm (13.000 a 5.000 cm-1).
Na região NIR também são observadas bandas em consequência da interação entre diferentes modos de vibração. Estas bandas são denominadas de bandas de combinação e surgem quando dois ou mais modos vibracionais interagem de maneira que a energia de transição seja a combinação linear da uma dada frequência da radiação incidente. As bandas de combinação no NIR aparecem na região entre 1.900 e 2.500 nm (5.300 – 4.000 cm-1
).
A utilização das bandas presentes nos espectros NIR é bem complexa e dificilmente dados qualitativos e quantitativos são obtidos diretamente a partir dos dados espectrais. Porém, após consideráveis avanços ligados a tecnologia computacional foi possível aplicar conhecimentos quimiométricos na utilização de
espectros NIR (Pasquini, 2003; Souza et al, 2013), o que colaborou decisivamente para popularização desta técnica em diversas áreas.
Vários instrumentos para obtenção de espectros NIR estão disponíveis no mercado e a seleção da configuração do mesmo depende de vários fatores. Contudo as características físicas da amostra é sem dúvida o principal fator na escolha do equipamento adequado.
Para a obtenção dos espectros de amostras sólidas ou semi-sólidas opacas a técnica mais recomendada é a refletância difusa, que se baseia na medida da fração de um feixe de luz refletido pela amostra, que alcança um detector disposto de forma apropriada visando maximizar a coleta do sinal analítico.
Protetores solares possuem característica físicas semi-sólidas e normalmente são opacos devido à formação da emulsão água/óleo e à presença em suspensão de óxidos de zinco e/ou titânio. Vários grupos funcionais presentes nas moléculas dos filtros solares orgânicos apresentam ligações do tipo C-H, O-H e N-H e, portanto, os espectros NIR apresentam informações a respeito destas substâncias. A limitação da técnica NIR para análise dos protetores solares é a ausência de informação a respeito do filtros solares inorgânicos, óxido de zinco e dióxido de titânio, presentes em muitas formulações de protetores solares.
1.6 Quimiometria
A quimiometria é uma área da química voltada à aplicação de métodos estatísticos e matemáticos visando solucionar problemas de origem química. (Hibbert et al, 2009). Apesar de ser considerada uma área relativamente recente, sua evolução ocorreu de forma rápida, possibilitando também uma rápida inserção dessa tecnologia nos setores industriais, otimizando o controle de qualidade de seus processos de fabricação. Como principais usuários dessa ferramenta, destacam-se os setores alimentício (Luna et al, 2013; Latorre et al, 2013; Cruz et al, 2013; Souza
et al, 2011), de combustíveis (Khanmohammadi et al, 2012; Bassbasi et al, 2013;
Schale et al, 2012; Kehimkar et al, 2014) e farmacêutico (Li et al, 2014, Breitkreitz et
al, 2013, Martí-Aluja et al, 2012).
Apesar do setor de cosméticos movimentar por ano aproximadamente 40 bilhões de reais (ABIHPEC, ADDI, SEBRAE, 2014), o investimento em novas
tecnologias, como o uso da quimiometria no processo de controle de qualidade durante a produção, ainda são escassos.
A rápida transição da quimiometria como ferramenta acadêmica para a indústria se deve principalmente a três fatores (Ferreira et al, 1999): rapidez na realização das análises, manutenção da integridade das amostras e substituição de métodos de análise antigos e lentos por técnicas instrumentais modernas e mais rápidas.
Dentre todas as ferramentas da quimiometria, a análise de componentes principais PCA (Principal Component Analysis) (Souza & Poppi, 2012) e a construção de modelos de calibração multivariados são as mais empregadas (Pasquini, 2013).
Os objetivos principais de uma análise multivariada empregando algoritmos matemáticos como, por exemplo, o NIPALS é reduzir a dimensionalidade do conjunto de dados buscando encontrar similaridade ou diferenças entre amostras (Souza & Poppi, 2012). As componentes principais (PC) buscam explicar, de forma sequencial, a maior variância dos dados visando sempre a redução da dimensionalidade do conjunto de dados. As PC são ortogonais entre si, ou seja, as informações contidas em cada uma delas são diferentes. Após a redução da dimensionalidade, usualmente as variáveis obtidas descrevem a maior parte da quantidade de informação, ou seja, a primeira componente principal é aquela que descreve a maior variância dos dados (Moita & Moita, 1998), a segunda PC, a segunda maior variância dos dados e assim por diante.
A análise por PCA além de reduzir a dimensão das variáveis, permite verificar possíveis semelhanças entre amostras e a presença de amostras anômalas. Já entre os métodos quantitativos para análise de dados multivariados destaca-se o PLS (Partial Least Squares Regression), que é um exemplo de técnica de calibração multivariada que tem por objetivo detectar correlação linear entre duas ou mais propriedades das amostras (Pasquini, 2013; Ferreira et al, 1999).
Este procedimento engloba três etapas: calibração, validação e previsão externa. A etapa de calibração estabelece uma relação linear entre o conjunto inicial de dados (espectros de NIR) e as propriedades conhecidas de amostras de referência (FPS, por exemplo). A validação cruzada avalia o modelo construído quanto a capacidade de previsão do parâmetro de interesse de uma amostra (ou grupo de amostras), que apesar de serem parte do conjunto de calibração não
