Voluntário E

A Figura 33 apresenta os gráficos da concentração dos seis endógenos ao longo do estudo de excreção do voluntário E. As concentrações encontradas no branco de urina e na urina mais concentrada estão descritas nos gráficos para facilitar a análise dos mesmos.

Figura 33: Concentração dos endógenos no estudo de excreção do voluntário E.

Primeiramente, pode-se observar que no estudo de excreção do voluntário E, os seis endógenos monitorados apresentaram perfis de excreção ligeiramente similares. Apesar disso, eles apresentaram os seus máximos de concentração em urinas coletada em horários diferentes. A testosterona apresentou a maior concentração na urina coletada após 122h enquanto a epitestosterona foi na urina coletada após 48h à ingestão do comprimido, assim como os isômeros androsterona e eticolanolona. Já os isômeros 5alfa-diol e 5beta-diol apresentaram maior concentração na urina coletada após 122h.

Na tabela a seguir, estão apresentadas as concentrações dos seis endógenos determinadas no branco de urina e na respectiva urina mais concentrada do estudo de excreção do voluntário E.

Tabela 23: Comparação da concentração dos endógenos no BU e na urina mais concentrada do voluntário E e a porcentagem de aumento.

Endógeno ^{Concentração no} BU (ng/mL) Maior concentração (ng/mL) - tempo de ingestão Porcentagem de aumento da concentração (%) Testosterona 52,96 253,13 - 122h 377 Epitestosterona 51,99 130,38 - 48h 150 Androsterona 2126,90 6116,96 - 48h 188 Etiocolanolona 829,63 2339,60 - 48h 182 5alfa-diol 92,75 546,22 - 122h 489 5beta-diol 155,30 730,85 - 122h 371

É possível observar no caso do voluntário E que o 5alfa-diol apresentou o maior aumento de concentração (489%) em relação ao branco de urina.

Comparando a concentração dos dois isômeros testosterona e epitestosterona, pode-se observar no branco de urina, que a concentração dos dois é muito próxima. Fazendo essa mesma comparação na urina coletada após à ingestão do comprimido, essa diferença sofre um aumento. Por exemplo, na urina coletada após 122 horas à ingestão do comprimido, a concentração de testosterona passa a ser 2,3 vezes maior do que a da epitestosterona.

Comparando a concentração dos dois isômeros androsterona e etiocolanolona, pode-se observar no branco de urina, que a concentração de androsterona é 2,6 vezes maior que a de etiocolanolona. Não houve alteração nessa proporção na urina coletada após 48h à ingestão do comprimido.

Comparando a concentração entre os isômeros 5alfa-diol e 5beta-diol no branco de urina, pode-se notar que o 5beta-diol é 1,7 vezes mais concentrado que o 5alfa-diol. Fazendo essa comparação na urina coletada após 122 horas à ingestão do comprimido, essa diferença diminuiu para 1,3 vezes.

Apesar da concentração da testosterona na urina coletada após 122 horas ser igual a 253,13 ng/mL, a concentração corrigida (considerando que a sua densidade foi 1,033) é 153,41 ng/mL, permanecendo abaixo do limite que sugeriria um perfil endógeno atípico. Conforme demonstrado na tabela em anexo (8.15), pode-se observar que nenhuma urina apresentou concentração corrigida de testosterona, epitestosterona, androsterona e etiocolanolona maior que os limites estipulados pelo documento técnico da AMA (TD2014EAAS), que são 200 ng/mL para testosterona e epitestosterona e 10000 ng/mL para androsterona e etiocolanolona para urinas masculinas. Na Figura 34 está o gráfico da Razão testosterona / epitestosterona versus o tempo de ingestão do comprimido do estudo de excreção do voluntário E.

Figura 34: Razão da testosterona / Epitestosterona do voluntário E.

Pode-se observar que nenhuma urina do estudo do voluntário E apresentou razão Test/Epi superior a 4. Apesar disso, é possível visualizar um ligeiro aumento dessa razão, principalmente nas urinas coletadas após 122 e 144 horas à ingestão do comprimido. Esse acréscimo se deve ao fato do nível de testosterona ter aumentado mais que o nível de epitestosterona.

Foi possível visualizar que um comprimido de Femara já é suficiente para provocar um aumento no nível dos seis endógenos monitorados. No caso da testosterona, isso já era o esperado devido ao letrozol inibir a enzima aromatase e assim não mediar a aromatização da testosterona em estradiol. 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 0 50 100 150 200 250 300 350 R a zã o T e st /E p i

Tempo de ingestão do Letrozol (h)

Isso é coerente também com o fato de em alguns tratamentos de epilepsia, os pacientes tomarem apenas uma dose de Femara por semana. Foi observado que, de uma forma geral, o nível de testosterona fica maior depois de aproximadamente 150-200 horas à ingestão do comprimido.

Não é possível encontrar uma regra no efeito causado por uma dose do comprimido Femara sobre os seis endógenos monitorados. Observa-se que a dose provoca um aumento nos níveis, mas esse comportamento varia muito entre os voluntários.

5.5. FIGURAS DE MÉRITO DE VALIDAÇÃO QUALITATIVA

5.5.1. Seletividade

Para avaliar a seletividade, foi necessário avaliar os cinco brancos de urina dos cinco voluntários dos estudos de excreção e verificar a ausência de interferentes no tempo de retenção do analito alvo (carbinol). A seguir estão os cromatogramas de íons totais e o cromatograma de íons para as transições m/z 291→ m/z 160 e m/z 291 → m/z 217, respectivamente para cada branco de urina.

Voluntário A:

Figura 35: Cromatograma de íons totais e o cromatograma de íons extraídos para as transições

m/z 291 → m/z 160 e m/z 291 → m/z 217, respectivamente do BU do voluntário A. Ausência de Interferentes

Voluntário B:

Figura 36: Cromatograma de íons totais e o cromatograma de íons extraídos para as transições

m/z 291 → m/z 160 e m/z 291 → m/z 217, respectivamente do BU do voluntário B. Ausência de Interferentes

Voluntário C:

Figura 37: Cromatograma de íons totais e o cromatograma de íons extraídos para as transições

m/z 291 → m/z 160 e m/z 291 → m/z 217, respectivamente do BU do voluntário C. Ausência de Interferentes

Voluntário D:

Figura 38: Cromatograma de íons totais e o cromatograma de íons extraídos para as transições

m/z 291 → m/z 160 e m/z 291 → m/z 217, respectivamente do BU do voluntário D. Ausência de Interferentes

Ausência de Interferentes, Ruído mais intenso

Voluntário E:

Figura 39: Cromatograma de íons totais e o cromatograma de íons extraídos para as transições

m/z 291 → m/z 160 e m/z 291 → m/z 217, respectivamente do BU do voluntário E.

Os cromatogramas de íons totais dos cinco voluntários não apresentam picos cromatográficos na faixa de tempo de retenção entre 5 e 7,5 minutos, que corresponde a faixa do segmento 3. Observando os cromatogramas das transições dos voluntários A, B e C também não foi detectado nenhum analito com essas transições. Já no branco de urina dos

Ausência de Interferentes, Ruído mais intenso Ausência de Interferentes

voluntários D e E é possível ver um ruído mais intenso que os demais, mas que não pode ser confundido com o analito alvo, carbinol, que elui em aproximadamente 6,6-6,7 minutos.

Os cromatogramas dos cinco voluntários demonstrados anteriormente podem ser comparados com o cromatograma de uma urina positiva de letrozol, ou até mesmo com o cromatograma de um branco de urina fortificado com o metabólito carbinol. Estes dois últimos estão apresentados a seguir, respectivamente:

Urina positiva de letrozol (estudo de excreção):

Figura 40: Cromatograma de íons totais e o cromatograma de íons extraídos para as transições

m/z 291 → m/z 160 e m/z 291 → m/z 217, respectivamente de uma urina positiva de letrozol (Estudo de excreção)

Branco de urina fortificado com o metabólito carbinol em 100 ng/mL:

Figura 41: Cromatograma de íons totais e o cromatograma de íons para as transições m/z 291 → m/z 160 e m/z 291 → m/z 217, respectivamente de um branco de urina fortificado com 100 ng/mL do carbinol.

Pode-se observar que tanto nos cromatogramas da urina proveniente de estudo de excreção do letrozol, quanto nos cromatogramas da urina fortificada com o carbinol, existe um pico intenso bem resolvido referente à fragmentação do carbinol.

Uma amostra controle contendo todos os analitos (aproximadamente 215) monitorados por CG-QqQ foi analisada para demonstrar quais analitos eluem na faixa de tempo de retenção (5.1 até 7.4min), segmento que contém o carbinol.

Figura 42: Cromatograma de íons totais e o cromatograma de íons para as transições m/z 291 → m/z 160 e m/z 291 → m/z 217, respectivamente de uma amostra controle contendo todos os analitos monitorados por CG-QqQ.

Pode-se verificar a presença de cinco substâncias na respectiva faixa de tempo de retenção, que são, respectivamente: Metadona, Brombuterol, Carbinol, Probenecida e Zilpaterol.

Mesmo os picos estando bem resolvidos, o que não dá possibilidade de dúvida de coeluição de algum deles, quando se analisa o cromatograma de íons das transições referente ao carbinol, aparece apenas um pico. Desta forma, avaliando-se todas as observações dos

1 ^{2 3} 4 5

brancos de urinas, da urina positiva e da urina fortificada com o analito carbinol, pode-se afirmar que a análise desse analito é bem seletiva.

5.5.2. Repetibilidade

Para avaliar a repetibilidade, foi necessário comparar os dez valores de área analito/área padrão interno obtidos das dez replicatas das amostras controles.

Essa avaliação foi feita em diferentes concentrações: