3.3 Metodologia
3.3.1 Alinhamento e análise das sequências 112
Os eletroferogramas obtidos foram analisados através do software Sequencing Analysis 3.7 (Applied Biosystems) para a determinação da qualidade das sequências.
O alinhamento e edição das mesmas foram feitos com a utilização dos softwares BioEdit 7.053 (Hall, 1999), Mega 5.2 (Tamura et al.. 2011), ambos utilizando o recurso ClustalW (Thompson et al., 1994) e/ou Geneious R6 ajustado na opção padrão (“geneious alignment”).
Ciclos Temperatura Duração
95º C 10 seg
50º C 5 seg
25 ciclos 60º C 4 min
A purificação dos produtos da reação de sequenciamento em resina Sephadex G-50, a preparação das amostras, a eletroforese capilar, o alinhamento e a análise das sequências são processos que foram realizados de forma idêntica para todas as amplificações feitas com os diferentes iniciadores.
Após o alinhamento, as sequências foram avaliadas visualmente e eventualmente corrigidas manualmente (usando o software Geneious R6) considerando as semelhança entre as sequências F e R. Uma sequência consenso foi extraída e alinhada com as demais sequências consensos.
3.4 Resultados
Três primers apresentaram temperaturas possíveis de provocar “grampos” e outros três apresentaram temperaturas onde seria possível a ocorrência de auto- dímeros. O tamanho das sequências dos iniciadores variaram entre 17 a 26 pares de bases. A tabela abaixo (Tabela 21) relaciona cada primer com algumas suas características físico-químicas. Os pares de primers tiveram desde temperaturas idênticas de pareamento (COI_389 F – COI_567 R) até temperaturas que variaram em aproximadamente 8oC (COI_524 F – COI_708 R).
Tabela 22 – Características dos iniciadores (primers).
Nome Sentid
o Inici
o Fim
Tamanh
o Tm %GC Hairpin
Tm Self Dimer
Tm Sequência
COI__2 F forwar
d 2 27 26 62.8 42.3 None None TTTTCAACCAACCACAAAGACATC
GG COI_172 R revers
e 149 172 24 59.2 37.5 37.8 None AATAAATGCGTGAGATGTGACGA
T COI_102 F forwar
d 102 118 17 55.9 58.8 41.2 5.0 TAGGCCAACCAGGAAGC
COI_317 R revers
e 298 317 20 55.8 55.0 None None GTAGGAGAAGTAGTGAGGGG
COI_263 F forwar
d 263 283 21 54.8 42.9 None None CCCCGAATAAATAACATGAGC
COI_452 R revers
e 436 452 17 51.4 47.1 None None TGGAAGATACACCTGCT
COI_389 F forwar
d 389 405 17 55.5 58.8 None None TCACACCCAGGAGCTTC
COI_567 R revers
e 548 567 20 55.5 45.0 32.2 None AGAAGGAGGACTGCTGTAAT
COI_524 F forwar
d 524 546 23 56.8 43.5 None 7.1 CCCCTATTCGTATGATCTGTACT
COI_708 R revers
e 683 708 26 65.0 46.2 None 15.5 ACTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA
GAA
Os pares de primers amplificaram com êxito (via PCR) cada um dos cinco fragmentos em que foi dividido o fragmento maior de 708pb do COI (DNA extraído de uma amostra sangue de um sagüi vivo) o que possibilitou o igualmente exitoso sequenciamento dos pares de fitas “forward” (F) e “reverse” (R) que, juntas, formaram as sequências consenso para a montagem dos pedaços de forma a completar o fragmento total de 708 pb (Figura 29). O primer que gerou o menor sequenciamento foi o COI_567 R (“4_R” na imagem) com 147 pb, e o que gerou a maior fita foi o COI_102 F (“2_F” na imagem) com 196 pb. O iniciador COI_172 R (“1_R” na imagem) gerou um “grampo” (hairpin) produzindo um sequenciamento espelhado e em reverso-complemento, contudo, sem comprometer a confecção da fita alvo (Figura 28).
Figura 28 - Eletroferogramas (produzidos com o software Geneious 6.0) dos sequenciamentos de cada um dos 10 primers (elaborados para a confecção do COI de sagüis) utilizando uma amostra referência de sangue de um indivíduos vivo.
Figura 29 - Alinhamento (produzidos com o software Geneious 6.0) das 10 sequências produzidas com os cinco pares de primers de COI, entre duas sequências de referência de Callithrix aurita (NOG_1) e C. jacchus (BB_7) com tamanho total de 708 pb.
O teste dos primers, nas 16 amostras retiradas do Museu Nacional, geraram sete (43,7%) sequenciamentos (consensos montados), sendo que somente em quatro amostras foram capazes de reconstruir a sequência de 708 pb completa: MN5_pele, MN5_pêlo, MN6_pele e MN6_pêlo. MN5 apresentou sequenciamentos com eletroferogramas “sujos” para os primers do início e do final do COI, para ambas as amostras, como revelam as marcas pretas (bases não definidas) (Figura 30). MN6, por outro lado mostrou sequências limpas para ambas as amostras e para todos os cinco pares de primers. As amostras mais antigas, MN2 (1931) e MN7 (1931), não conseguiram ter todos os cinco pares de primers com resultados. MN2 (um C. aurita) sequenciou o primeiro primer com muito “ruído” emparelhando-se com C. jacchus, o segundo fragmento apresentou a fita do primer forward bastante limpa, mas apresentou as bases características da espécie com picos ambíguos (Figura 30) embora emparelhando com C. aurita. O exemplar MN7, um sagüi catalogado como C. jacchus, teve um sequenciamento limpo de 171 pb e alinhou-se com a sequência de referência da mesma espécie (BB_7) (Figura 31).
Figura 30 - Detalhe do sequenciamento do segundo fragmento do COI da amostra MN2 (1931) mostrando as bases de diferenciação entre C. aurita e C. jacchus com picos ambíguos.
A árvore gerada pelo software Geneious (NJ – JC) não separou os clados para as três espécies, mas permite uma visualização das bases que distinguem e agrupam as sequências, possibilitando que se perceba a disposição dos dados sobre os quais a árvore foi montada (Fig. 31).
Figura 31 - Árvore gerada usando o modelo de Neighbor-Joining (Jukes-Cantor) (software Geneious 6.0) mostrando os agrupamentos do alinhamento entre as sequências geradas utilizando os pares de primers em amostras de sagüis do Museu Nacional.
O software MEGA oferece algumas opções distintas das do Geneious, e permitiu a construção de uma árvore (NJ – K2P) em que as bases ambíguas fossem ignoradas. A árvore gerada desta forma agrupou indivíduos com semelhanças moleculares com o mesmo critério da classificação morfológica que os uniu em uma
mesma espécie. Os exemplares do Museu Nacional MN5 (pele e pelo), MN6 (pele e pelo) e MN7 (osso) agruparam corretamente com as referências das espécies correspondentes, C. aurita, C. penicillata e C. jacchus, respectivamente. Os sequenciamentos dos fragmento 1 e 2 do exemplar MN2 (pelo) não conseguiram parear esse indivíduo com a espécie semelhante a que ele é descrito morfologicamente (C. aurita), o fragmento 1 (que apresentou um sequenciamento com ruído significativo) se agrupou com 100% de identidade com o clado de C.
jacchus, e o fragmento 2, que teve picos ambíguos (particularmente nas mesmas bases que separam C. aurita de C. jacchus) apesar de ter um sequenciamento mais limpo, ficou isolado entre o clado dos C. aurita e os clados de C. jacchus e C.
penicillata (Fig.32).
Figura 32 – Árvore (NJ – K2P) (feita com o software Geneious 6.0) mostrando os agrupamentos das amostras do Museu Nacional que geram sequências comparáveis.
Se considerarmos o êxito de cada um dos 10 primers para cada uma das 16 amostras, isso resulta em 160 sequenciamento, sendo que destes, 46 geraram resultados apreciáveis, e destes 46, somente 30 (18,7%) sequenciamentos saíram limpos (todos os pares para MN6 pele e pelo, os pares 2 e 3 para MN5 pele e pelo, e o primer 1 para MN7 osso) (Tabela 22).
Tabela 23 - Pares de primers que resultaram em pares de sequências (F e R) limpas para as amostras do Museu Nacional
Pares de
primers Indivíduo Amostra No. de
tombo Data Local Espécie2
2 e 3 MN5 pele MN 77420 2010 Parati - RJ C. aurita
2 e 3 MN5 pelo MN 77420 2010 Parati - RJ C. aurita
todos MN6 pele CB 78 2009 pele C. penicillata
todos MN6 pelo CB 78 2009 BR 040 - Simão Pereira -
RJ C. penicillata
1 MN7 osso MN 5572 1941 Murungú - Ceará C. jacchus
A elaboração dos cinco pares de primers para fragmentos menores do marcador COI de sagüis passou pelas dificuldades intrínsecas do processo para conseguir originar produtos factíveis. Apesar das diferenças nas temperaturas de pareamento (Tm), foram usadas apenas três temperaturas diferentes para o protocolo de PCR: 62oC para o par do primeiro fragmento; 57oC para os pares do segundo, quarto e quinto fragmento; e 53oC para o par do terceiro fragmento.
O primer reverso do primeiro fragmento (COI_172 R), apesar de apresentar uma Tm relativamente alta produziu um “grampo” causando um sequenciamento
“espelhado” com aproximadamente o dobro do tamanho, mas como todos os primers foram confeccionados com uma cauda M13, é possível que o grampo tenha ocorrido pela soma de ambos primer e M13. Esse fato foi único, não ocorrendo nos demais primers.