Efeitos do ESTE na atividade de H. pylori

A incubação do ESTE em todas as concentrações testadas não apresentou atividade antimicrobiana contra a bactérias H. pylori, não inibindo o crescimento bacteriano (dados não apresentados).

DISCUSSÃO

Extratos secos de flores de T. erecta são amplamente comercializados e utilizados no mundo devido ao carotenoide luteína, que apresenta um potencial biológico vasto. Além disso, na medicina tradicional as flores da T. erecta são popularmente utilizadas para tratar doenças gastrointestinais (MOLLIK et al., 2010) e já existem evidências experimentais sobre seu potencial benéfico na colite ulcerativa (MEURER et al., 2019). Em continuidade a tais evidências e embasado na utilização popular, os dados obtidos nesta pesquisa confirmaram, ao menos experimentalmente, o potencial antiulcera deste extrato, em especial na prevenção de lesões gástricas induzidas por etanol de uma maneira mediada pelo fortalecimento dos fatores protetores da mucosa gástrica, mas não com o envolvimento da redução da secreção ácida gástrica.

Alguns dados publicados têm confirmado as propriedades antioxidantes in vitro do extrato comercial de flores de T. erecta (BASHIR; GILANI, 2008; MEURER et al., 2019). Os mecanismos antioxidantes atribuídos a estes extratos podem ser a inibição da produção de radicais livres, a capacidade redutora e a forte capacidade de doação de hidrogênio de seus constituintes (BASHIR; GILANI, 2008). Essa forte característica antioxidante pode ser atribuída aos aspectos químicos de Tagetes, as quais possuem classes de metabólitos secundários como flavonoides, esteróis, carotenoides, saponinas, triterpenos, polissacarídeos, alcalóides, mucilagem e resinas (JACOBS et al., 1994; PICCAGLIY; MAROTTI; GRANDI, 1998). De fato, Meurer et al. (2019) descreveu a presença de laricitrina, dois hexosídeos de laricitrina, ácido elágico e mirecetina no ESTE.

O modelo de úlcera gástrica induzida por etanol é geralmente usado em estudos para investigação de substâncias com potencial antiulcera, pois o etanol promove estase no fluxo sanguíneo gástrico, levando o desenvolvimento de necrose e hemorragia no tecido gástrico (KANGWAN, PARK, et al., 2014). O etanol acidificado gera ulcerações hemorrágicas na mucosa gástrica, a redução da barreira de muco e da secreção de bicarbonato, além de aumentar a permeabilidade vascular promovendo a perda de células do epitélio gástrico (SILVA, 2014). Além disso, o etanol acidificado promove a peroxidação de lipídios através da produção de radicais hidroxila e ânions superóxidos, sendo esse o estágio inicial do dano celular causado pelas espécies reativas de oxigênio, a peroxidação da membrana celular (KWIECIEN et al. 2014). Em paralelo, a exposição ao etanol depleta antioxidantes da mucosa gástrica e reduz a síntese das prostaglandinas exacerbando mais a úlcera aguda (KWON et al., 2019).

Dados obtidos em cultivo celular indicam que o etanol possui capacidade de retardar a restauração do epitélio gástrico por provocar danos no citoesqueleto de células epiteliais da mucosa gástrica (RGM-1) mantidas em cultura. Também tem sido descrito que o etanol tem a capacidade de induzir a liberação de endotelinas, degranulação de mastócitos, inibição da síntese de prostaglandinas e consequente redução da produção de muco, além de provocar danos ao endotélio vascular da mucosa gástrica, desordem da microcirculação e isquemia, resultando na produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) (TAMOTSU MATSUHASHI, 2007; JIN-SHUI PAN, 2008).

Classicamente este método tem sido utilizado para a busca de produtos ou preparações com potencial antiulcera. A escolha desse modelo, se deu pelo seu efeito ulcerogênico e necrotizante resultando em dano direto da mucosa gástrica, ainda mais quando o etanol está acidificado. De fato, lesões hemorrágicas foram evidentes na mucosa gástrica de animais expostos ao etanol acidificado e pré-tratados com veículo, contudo observou-se que o extrato administrado oralmente reduziu a área da úlcera quando comparado ao veículo, na maior dose. Porém o mesmo resultado não foi encontrado quando o extrato foi administrado via intraperitoneal, indicando que o ESTE desempenha um efeito tópico na mucosa gástrica ou ainda de que modificações dependentes da acidez ácida gástrica podem ser necessárias para que o extrato exerça seu efeito antiulcera. Corroborando com os achados, Sindhu e Kuttan (2012) verificaram que a administração de luteína por via oral reduziu a erosão e o sangramento gástrico dos animais que receberam etanol.

Além da utilização de etanol ou etanol acidificado em estudos de gastroproteção, a capacidade ulcerogênica dos AINEs também tem sido empregada experimentalmente na busca de substâncias gastroprotetoras. A indometacina é um fármaco da classe dos AINEs não seletivos, o principal mecanismo de dano associado a esse tipo de AINE na mucosa é a inibição não-seletiva da COX. A COX é responsável pela síntese de prostaglandinas e esta inibição está associada à diminuição do fluxo sanguíneo da mucosa, baixa secreção de muco e bicarbonato e a inibição da proliferação celular, favorecendo o aparecimento de úlceras (GARCÍA-RAYADO; NAVARRO;

LANAS, 2018).

As COX-1 e COX-2 desempenham papéis importantes na mucosa gástrica. A COX-1 está envolvida na síntese de prostaglandinas que estimulam a produção e secreção de muco e bicarbonato, aumentam o fluxo sanguíneo da mucosa e favorecendo a proliferação de células epiteliais. Apesar de a COX-2 estar envolvida em processos inflamatório dor e febre, tem sido descrito que no processo de cicatrização gástrica essa isoforma está envolvida na estimulação da proliferação celular, angiogênese e restauração da integridade da mucosa (GARCÍA- RAYADO; NAVARRO; LANAS, 2018).

Portanto, evidências sugerem que a COX-2 desempenha um importante papel na resolução da inflamação gástrica ou cicatrização gástrica. Estudos sugerem que a inibição da COX-2 através da administração de colecoxib promove prejuízo da cicatrização gástrica de roedores (GUO et al., 2006; COPPELLI et al., 2004). Além disso, os AINEs possuem propriedades físico-químicas que interrompem os fosfolipídios do muco e levam ao desacoplamento da fosforilação oxidativa mitocondrial, iniciando o dano à mucosa (KUNA et al., 2019).

Na úlcera induzida por indometacina, a administração oral de ESTE na maior dose promoveu redução da área de lesão quando comparado ao grupo veículo. Similarmente, Hobbenaghi et al. (2019) avaliaram o efeito da crocina, carotenoide derivado do Crocus sativus, na úlcera intestinal induzida por indometacina, e concluíram que a crocina protege a mucosa intestinal por meio de mecanismos antioxidantes, anti-inflamatórios e antiapoptóticos.

Adicionalmente, Boyacioglu et al. (2016) avaliaram os efeitos do licopeno na úlcera gástrica induzida por indometacina e verificaram que o tratamento de 100 mg/kg de licopeno reduziu significativamente a área da úlcera gástrica na mucosa gástrica. Assim, o efeito gastroprotetor de carotenoides no modelo de úlcera induzida por indometacina tem sido descrito na literatura e o teor de luteína presente no ESTE pode colaborar para o efeito do extrato contra a agressão na mucosa gástrica induzida por um AINE.

Além do carotenoide luteína, outros compostos descritos por Meurer et al. (2019) fazem parte da composição do ESTE, como por exemplo o ácido elágico. Beserra et al. (2011) avaliaram o efeito antiúlcera do ácido elágico em modelos de úlcera aguda induzida por etanol ou indometacina e crônica induzida por ácido acético em ratos.

Os autores identificaram que o mecanismo gastroprotetor do ácido elágico na úlcera induzida por etanol foi devido à intensificação na produção endógena de óxido nítrico, por seu efeito antioxidante e por repor a depleção de compostos sulfidrílicos não proteicos endógenos e atenuar a secreção de TNF-α. Já a gastroproteção efetuada contra a úlcera por indometacina envolveu a redução dos níveis plasmáticos de leucotrieno B. Assim, os autores sugerem que o ácido elágico fortalece os mecanismos de defesa e atenua os fatores agressivos da mucosa gástrica ao desempenhar papel gastroprotetor.

Dado os resultados promissores encontrados nos primeiros blocos de experimentos, partiu-se então para a investigação do modo de ação envolvido nos efeitos gastroprotetores do ESTE. Decidiu-se por verificar a contribuição do óxido nítrico (NO), compostos sulfidrílicos não-proteicos, prostaglandinas e α-adrenorreceptores na gastroproteção exercida pelo ESTE.

Como já citado anteriormente, o NO tem papel importante como vasodilatador na mucosa gástrica. O NO e prostaciclinas são vasodilatadores potentes que protegem a mucosa gástrica contra lesões. Quando ocorre um distúrbio na mucosa gástrica, ou um aumento da difusão ácida, há um aumento rápido do fluxo sanguíneo na mucosa, para promover e facilitar a remoção ou diluição do HCl ou de outros agentes nocivos (TARNAWSKI;

AHLUWALIA; JONES, 2012). De fato, os resultados mostraram que o pré-tratamento com o L-NAME, um inibidor não seletivo da NO sintase, aumentou a área de lesão gástrica. Além disso, o pré-tratamento com o L- NAME aboliu o efeito gastroprotetor do ESTE, sugerindo envolvimento do NO no efeito promovido pelo ESTE.

Além do NO, os compostos sulfidrílicos não-proteicos desempenham papeis importantes no processo de eliminação de substâncias tóxicas da mucosa gástrica (BARROS et al., 2016). Quando se usa um bloqueador de compostos sulfidrílicos, como o NEM, há um aumento da lesão gástrica em animais expostos ao etanol acidificado, da mesma forma que o evidenciado nos resultados obtidos. Além disso, se verificou que o pré-tratamento com o NEM, também aboliu o efeito do ESTE, também sugerindo a participação dos compostos sulfidrílicos no mecanismo gastroprotetor do extrato, o que pode ser suportado pela manutenção dos níveis de GSH induzido pelo ESTE na mucosa gástrica.

A ioimbina é um antagonista não seletivo de receptores α2 adrenérgicos, os quais medeiam as respostas envolvidas na regulação da secreção gástrica (GYIRES et al., 2000). O pré-tratamento com ioimbina também inibiu os efeitos do ESTE nas úlceras induzidas por etanol/HCl. De forma semelhante o pré-tratamento com indometacina também reduziu o efeito do ESTE, sugerindo que as prostaglandinas endógenas podem estar envolvidas no mecanismo de ação do ESTE contra a capacidade ulcerogênica do etanol acidificado.

Com base nos resultados pode-se observar que o ESTE se utiliza de vários mecanismos de ação para exercer seu efeito. Como citado por Meurer et al. (2019), o extrato é complexo e possui diversos constituintes, os quais podem estar relacionados com os efeitos obtidos no presente estudo, visto que há uma diversidade de moléculas com mecanismos bioativos diferentes.

A geração de espécies reativas de oxigênio constitui um processo contínuo e fisiológico fazendo parte de inúmeras funções no organismo. Contudo, quando ocorre uma produção exacerbada desses compostos, há o acionamento de um mecanismo de defesa, conhecido como mecanismo antioxidante. O estresse oxidativo ocorre quando há um desequilíbrio entre esses compostos oxidantes e os antioxidantes, como por exemplo quando há produção de radicais livres de oxigênio de forma exacerbada, podendo levar a perda de funções biológicas e, até mesmo, ao desequilíbrio homeostático (BARBOSA, COSTA, et al., 2010).

As defesas antioxidantes são classificadas como enzimáticas e não enzimáticas (LIMÓN-PACHECO;

GONSEBATT, 2009). Quando ocorre uma ausência de enzimas antioxidantes, as espécies reativas de oxigênio (EROS) encontram nos diferentes tecidos, incluindo a mucosa gástrica um alvo, promovendo peroxidação lipídica, danos ao DNA e proteínas (OLALEYE et al., 2007; BHATTACHARYYA et al., 2014).

O processo oxidativo também pode ser caracterizado pela peroxidação lipídica da membrana das células do tecido ulcerado, esse processo é iniciado pela reação de um radical livre com um ácido graxo insaturado, resultando na formação de LOOH. Ligado a isso, por conta da meia vida curta dos EROs, sua concentração fica difícil de determinar, por isso, indiretamente, pode ser feito a análise através dos níveis de hidroperóxido lipídico (LOOH) como um indicativo indireto do nível de estresse oxidativos (LIH-BRODY L, 1996; LEITE, 2014).

Quando se observou os níveis de LOOH pode-se notar um aumento no grupo veículo comparado ao grupo naive. No entanto, no grupo tratado com o ESTE esse parâmetro foi diminuído, indicando que o extrato pode minimizar o dano as membranas lipídicas da mucosa gástrica efetuado pela intensa geração de EROs decorrente da exposição ao etanol. Corroborando com o achado, Brito et al. (2018), verificaram que o pré-tratamento com o extrato etanolico de Spondias mombin L., a qual possui ácido elágico como um dos compostos bioativos, o que é similar ao encontrado no ESTE, reduziu a peroxidação lipídica quando comparado ao veículo, em modelo de úlcera induzida por etanol.

Ao analisar a atividade da SOD, um antioxidante enzimático, de forma inesperada, não houve diferença estatística entre o grupo naive e o tratado com veículo. De forma contrária, De Oliveira Cabral et al. (2017) demonstrou que a administração de etanol acidificado promoveu uma redução da SOD no grupo veículo, quando comparado ao naive. Entretanto, o grupo tratado com o ESTE experimentou redução na atividade da SOD quando comparado ao grupo veículo. A SOD é a primeira linha de defesa enzimática, promovendo a desmutação do ânion superóxido em peróxido de hidrogênio que posteriormente é catalisado por outras enzimas antioxidantes (OLALEYE et al., 2007; PATLEVIč et al., 2016). O ESTE não promoveu um aumento da atividade da SOD, indicando que o extrato possui uma ação antioxidante direta sem envolver esse mecanismo de defesa. No estudo de Meurer et al (2019), demonstrou que o grupo tratado com o ESTE normalizou a atividade da SOD, quando comparado ao grupo naive. Contudo, apesar de redução de atividade da SOD, é provável que os efeitos antioxidantes diretos em parte pela presença de carotenoides e flavonoides podem exercer efeito compensatório o que, por conseguinte justificaria a redução dos níveis de lipoperóxidos e manutenção dos níveis de GSH mesmo em vigência de atividade de SOD reduzida.

Um dos parâmetros defensores da mucosa gástrica avaliado é o GSH, que é um antioxidante não enzimático, composto pelos aminoácidos glutamina, cisteína e glicina e que possui papel fundamental na defesa do organismo frente ao estresse oxidativo (PATLEVIC et al., 2016). Entre as suas funções, pode-se destacar a capacidade de eliminar e prevenir a formação de EROs, sendo assim um importante parâmetro da capacidade antioxidante na mucosa gástrica (KUMAR DAS, 2007). Além disso, o GSH promove a redução dos dissulfetos da dieta, o metabolismo dos lipídeos peroxidados, a desintoxicação xenobiótica e a montagem de oligômeros de mucina para manter a fluidez do muco (PÉREZ et al., 2017).

No presente estudo, pode-se perceber que os níveis de GSH aumentaram no grupo tratado com o ESTE quando comparado ao grupo veículo. Indicando uma melhor preservação deste antioxidante, mostrando que o ESTE promoveu efeito positivo na redução do estresse oxidativo, uma vez que a depleção do GSH está associada a elevada lesão oxidativa na mucosa gástrica exposta ao etanol (PÉREZ et al., 2017). Esses achados corroboram com os resultados de Meurer et al. (2019) onde o tratamento com ESTE (300 mg/kg) aumentou a disponibilidade de GSH no cólon de camundongos colíticos quando comparado ao veículo. Da mesma forma, Sindhu e Kuttan

(2012) demonstraram, em seu estudo com luteína nas doses de 100mg/Kg e 250mg/Kg aumentou o GSH gástrico em animais ulcerados com etanol quando comparados ao veículo.

De forma não esperada a análise dos níveis da atividade da catalase (CAT) não apresentaram diferenças estatísticas significativas entre o grupo ESTE quando comparado ao veículo ou naive. A glutationa-S-transferase (GST) apresentou um aumento dos níveis do veículo, carbenoxolona e ESTE quando comparado ao naive. O GST é uma família de enzimas de desintoxicação que catalisam a conjugação de GSH com uma ampla variedade de compostos eletrofílicos endógenos e exógenos (TOWNSEND; TEW, 2003). Os resultados obtidos sugerem que o ESTE promove o aumento da ação desta enzima que participa da prevenção da úlcera através da redução da formação de radicais livres e outros xenobióticos.

A MPO é considerada um marcador indireto de presença de neutrófilos no tecido lesionado, comumente usada como um marcador do conteúdo tecidual de leucócitos polimorfonucleares como os neutrófilos que migram para o local do estímulo inflamatório, e o método se baseia então na liberação de MPO para o tecido lesado. De fato, o grupo ulcerado tratado com o ESTE apresentou atividade reduzida dessa enzima quando comparado ao grupo ulcerado tratado com o veículo, indicando que houve uma diminuição no recrutamento de neutrófilos. No processo de ulceração, por conta da inflamação, ocorre recrutamento de leucócitos que promove o aumento do consumo de oxigênio para produção de ânion superóxido, levando a produção de inúmeras EROs, assim esses resultados demonstram um possível efeito positivo na redução da inflamação gástrica e, como consequência, redução das úlceras gástricas (VEEN; WINTHER; HEERINGA, 2009).

Um estudo que buscou avaliar o efeito da luteína na redução de úlceras gástricas induzidas por etanol em ratos mostrou que a luteína administrada por 5 dias pode, aumentar as enzimas antioxidantes de uma forma significativa. Eles relataram que esse resultado pode ser dado pela redução do estresse oxidativo induzido pela administração de etanol (SINDHU; KUTTAN, 2012). Além do mais, resultados positivos com as doses de 300 mg/kg do extrato de ESTE também foram encontrados no estudo de Meurer et al., (2019), onde mostrou que a administração via oral foi benéfica para o tratamento adjuvante de desordens inflamatórias intestinais, sendo capaz de melhorar os parâmetros de estresse oxidativo e a atenuação de secreção de citocinas inflamatórias. Sugere-se, assim, que a T. erecta, por sua ação antioxidante, pode favorecer a gastroproteção.

Na prática clínica a úlcera gástrica é tratada com inibidores da secreção de ácido gástrico, em especial inibidores da bomba de prótons. A justificativa para o uso desses inibidores se dá pelo fato de que os IBPs promovem uma hiperplasia das células parietais, a qual está relacionada ao efeito trófico de indução da proliferação da hipergastrinemia, que é moderadamente aumentada em pacientes que utilizam IBPs em longo prazo. A hipergastrinemia é acompanhada por uma diminuição nos níveis de somatostatina e consequentemente à potente supressão ácida induzida pelo IBPs (hipocloridria), regulada por um sistema de feedback negativo coordenado pelo ácido (LAMBERTS; BRUNNER; SOLCIA, 2001; LUNDELL et al., 2015; SCHUBERT, 2016;

MALFERTHEINER; KANDULSKI; VENERITO, 2017).

O ácido gástrico converte pepsinogênio em pepsina, a qual tem atividade proteolítica (RAUFMAN, 1996) em pH 1 – 4 (YAMAMOTO, 1975). A secreção ácida gástrica é fisiologicamente regulada pelas células parietais, ativadas por diferentes estímulos como gastrina nos receptores CCK-2, histamina dos receptores H2 e acetilcolina nos receptores m3 (SCHUBERT, 2011). Essas vias ativam a bomba de prótons H⁺K-ATPase, que libera íons H⁺ (CALABUIG et al., 2009).

Sendo assim, utilizou-se a metodologia de ligadura do piloro para avaliar a possível influência do ESTE no volume, pH, acidez total e atividade péptica e inferir se o extrato desempenha atividade gastroprotetora através de mecanismo antisecretor ácido gástrico. Os resultados obtidos demonstram que a administração do ESTE não alterou volume, pH, acidez total e atividade péptica e, portanto, os efeitos alcançados pela administração do extrato são mediados pelo fortalecimento de fatores protetores da mucosa gástrica, mas não pela redução da acidez do conteúdo gástrico. Realmente, Mard et al. (2015), analisando o efeito da crocina, um carotenoide derivado do Crocus sativus, demonstrou que o volume, o pH e a acidez total do conteúdo gástrico também não foram afetados pelas doses estudadas de crocina (7,5, 15 e 30 mg/ kg).

4. CONSIDERAÇÕES FINAIS

O extrato seco de T. erecta apresentou efeito antiulcerogênico mediado pela redução do estresse oxidativo e processo inflamatório gástrico, além de outros modos de ação complementares que incluem o óxido nítrico, a disponibilidade de grupamentos sulfidrílicos, os receptores alfa 2 adrenérgicos e prostanoides. Esse efeito pode ser devido sua grande quantidade de carotenoides, principalmente a luteína, presente nesta planta.

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