A Fermentação

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Devido à importância econômica do processo biotec- nológico envolvendo a levedura Saccharomyces cerevisiae na produção de cerveja, diferentes grupos de pesquisa têm de- dicado esforços no estudo para a elucidação dos mecanismos de regulação metabólica deste eucarioto, no decorrer da fer- mentação dos mostos cervejeiros.

A fermentação dos mostos cervejeiros pode ser infl uenciada por vários fatores. Entre estes podem ser destacados: a composição do mosto, a temperatura da fermentação, o nível de oxigênio inicial, a concentração e a viabilidade celular e a concentração de etanol.

Neste artigo, encontram-se revisados e sumariados os aspectos mais relevantes da composição química básica, além dos principais mecanismos bioquímicos inerentes à fermenta- ção do mosto cervejeiro.

O processo cervejeiro

A cerveja é uma bebida de malte resultante da fermentação alcoólica do extrato aquoso do malte de cevada com lúpulo. O

Resumo

Genericamente, defi ne-se por cerveja uma bebida carbonatada de baixo teor alcoólico, pre- parada a partir de malte (usualmente de cevada), lúpulo, leveduras e água de boa qualidade, podendo ainda utilizar-se de adjuntos. Sabe-se que vários fatores infl uenciam a fermentação de mostos cervejeiros, dentre eles sua composição. Na presente revisão, aspectos básicos sobre a composição química do mosto e o metabolismo da levedura cervejeira na fermen- tação, estão sucintamente apresentados de maneira seqüencial.

Palavras-chave: fermentação, cerveja, biotecnologia

Summary

Generically, beer is defi ned as a carbonated drink of low alcoholic content, prepared from malt (usually of barley), hops, yeasts, water of good quality and some adjuncts. Many factors, like composition, infl uence the wort fermentation. In the present revision, basic aspects on the chemical composition of wort and the metabolism of the brewing yeast in the fermentation, summarily are presented in sequential way.

Keywords: fermentation, beer, biotechnology

Elementos Biotecnológicos fundamentais no processo cervejeiro:

2º parte – A Fermentação

I

NTRODUÇÃO

A origem das primeiras bebidas alcoólicas é incerta. Estima- se que o homem começou a utilizar bebidas fermentadas há 30 mil anos, sendo que a produção de cerveja deve ter se iniciado por volta de 8.000 a.C. Essa bebida foi desenvolvida paralela- mente aos processos de fermentação de cereais e difundiu-se lado a lado com as culturas de milho, centeio e cevada nas antigas sociedades estáveis. Há registros sobre a utilização da cerveja, na antigüidade, entre os povos da Suméria, Babilônia e Egito. Os egípcios fi zeram com que a cerveja fi casse conhecida pelos outros povos orientais, fazendo com que ela chegasse à Europa e daí para o resto do mundo, sendo uma das bebidas mais apreciadas nos dias atuais. Assim, a produção de cerveja é usualmente mencionada como um exemplo típico da biotecnologia “antiga”, devido à sua longa história.

Entende-se por Biotecnologia, o conjunto de conheci- mentos, técnicas e métodos, de base científi ca ou prática, que permite a utilização de seres vivos como parte integrante e ativa do processo de produção industrial de bens e serviços.

*Giovani Brandão Mafra de Carvalho, Adriana Andréia Rossi e João Batista de

Almeida e Silva Universidade de São Paulo – USP, Escola de Engenharia de Lorena – EEL, Departamento de Biotecnologia

*Autor para correspondência:

Estrada Municipal do Campinho

Caixa Postal 116

CEP: 12602-810. Lorena. SP Fone: (12) 3159-5107

E-mail: gbmafra@yahoo.com.br

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Artigo

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A cervejaria moderna aplica um amplo espectro de novas invenções técnicas, bioquímicas, microbiológicas e genéticas.

Exemplos de progressos contemporâneos podem ser encontrados ao longo de toda cadeia de produção: como o desenvolvimento de novos cultivares de cevada, uso de bactérias lácticas na fase de maltagem, obtenção de extratos de lúpulo com CO₂ supercrítico, fermentação de mostos de alta densidade (high gravity), imobilização de leveduras no bioreator, modifi cação genética de leveduras etc. (Carvalho et al., 2006b).

Segundo Virkajärvi (2001), o processo de produção de cervejas do tipo lager, predominante em todo mundo nos dias atuais, pode ser resumido em quatro fases, conforme descri- to abaixo:

1) O primeiro passo consiste na obtenção do malte de cevada através da germinação de grãos de cevada em condi- ções especiais. Este malte é moído ou triturado e misturado com água. As enzimas presentes no próprio malte, ativadas de acordo com um perfi l de temperaturas controlado pelo mestre cervejeiro, irão hidrolisar os polímeros presentes:

amido em dextrinas, mono, di e trissacarídeos e proteínas em peptídeos e aminoácidos. Esta primeira fase do processo é denominada mosturação. A fração insolúvel do mosto obtido é então fi ltrada, normalmente utilizando-se a própria casca do malte como camada fi ltrante.

2) O próximo passo consiste na fervura do mosto fi ltrado por 1 a 2 horas, após a adição do lúpulo. A fervura (ou cozi- mento) irá assegurar a assepticidade necessária e promoverá a precipitação de complexos entre proteínas e polifenóis, a solubilização/isomerização de componentes do lúpulo, a re- moção de compostos que determinam sabores desagradáveis no produto fi nal e a obtenção da concentração desejada de açúcares. As enzimas presentes são inativadas durante a fervura. O material precipitado, conhecido como trub, é então removido. Após a remoção do trub, o mosto é resfriado, transferido para o fermentador e aerado até a saturação na concentração de oxigênio dissolvido.

3) A fermentação da cerveja do tipo lager é dividida em duas fases: Fermentação principal (ou primária) e fermentação se- cundária. A fermentação principal dura entre seis e dez dias, temperaturas entre 7 e 15ºC sendo utilizadas. Durante a fer- mentação principal, a maior parte dos compostos responsá- veis pelas características organolépticas do produto fi nal são formados. Ao fi nal desta fase, a cerveja é resfriada para apro- ximadamente 4ºC e a maior parte das leveduras são retiradas pela base do fermentador. A fermentação secundária pode ser realizada no mesmo tanque da fermentação principal ou

fase dura entre uma e duas semanas.

4) Finalmente, a cerveja é estabilizada pelo resfriamento a temperatura igual ou inferior a 0ºC por um período de até três dias. Diferentes agentes estabilizantes, como sílica gel e taninos, podem ser utilizados. Leveduras e complexos entre proteínas e polifenóis irão precipitar, sendo fi ltrados poste- riormente. A carbonatação, a pasteurização e o envase fi nali- zam o processo de produção.

Cabe ressaltar a importância do fi nal da fase 2 e início da fase 3 citados acima. De acordo com Munroe (1994), o oxi- gênio é utilizado pela levedura para produzir esteróis e ácidos carboxílicos insaturados, que são essenciais para a síntese da membrana celular. Sem o oxigênio inicial, o crescimento celular fi ca restrito causando fermentação anormal e mudanças no fl avour da cerveja. O oxigênio é consumido pela levedura geralmente em poucas horas e, como os açúcares do mosto não são consumidos no início da fase lag, o glicogênio é essencial fonte de energia para atividade celular. Segundo Venturini Filho & Ce- reda (2001), no início da fermentação alcoólica a quantidade de leveduras a ser utilizada deve ser tal que resulte numa concen- tração de 5 a 15 milhões de células de levedura por mililitro de mosto. Embora as circunstâncias variem de mostos para mostos e de cepas para cepas, uma fermentação requererá 1 ppm de oxigênio dissolvido e 10⁶ cel/mL por cada 1ºP de extrato no mosto (Almeida e Silva, 2005).

Nos últimos anos, muito se tem estudado sobre o aumento de produtividade do processo cervejeiro, bem como o controle dos produtos formados durante o processo fermentativo. A infl uência das condições de fermentação sobre o fl avour da cerveja e o papel central do metabolismo da levedura na produção de compostos ativos no fl avour têm sido objeto de estudo de vários pesquisadores (Garcia et al., 1993; Almeida, 1999; Verstrepen et al., 2003, Guido et al., 2004; Vanderhaegen et al., 2006). O conhecimento geral do processo cervejeiro, bem como das características químicas do mosto e bioquímicas da fermentação são fundamentais ao cervejeiro, na busca de estratégias de melhoramento da produtividade e da estabilidade sensorial da cerveja produzida.

A composição química do mosto cervejeiro e sua fermentação Os açúcares

O metabolismo da levedura cervejeira, bem como de qualquer ser vivo, pode ser dividido didaticamente em ana-

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bolismo e catabolismo. O processo anabólico diz respeito a reações de síntese de material celular, tais como proteínas, gorduras, polissacarídeos etc., às custas de energia celular ar- mazenada na molécula de ATP. No catabolismo o processo se inverte, as moléculas são quebradas e oxidadas, sendo que a energia química produzida nessas reações é acumulada nas moléculas de ATP (Venturini Filho & Cereda, 2001).

A transformação do açúcar (glicose) em etanol e CO₂ en- volve 12 reações em seqüência ordenada, cada qual catalisada por uma enzima específi ca. Tal aparato enzimático está con- fi nado no citoplasma celular sendo, portanto, nessa região da célula que a fermentação alcoólica se processa (Figura 1).

Essas enzimas, referidas como “glicolíticas”, sofrem ações de diversos fatores (nutrientes, minerais, vitaminas, inibidores, substâncias do próprio metabolismo, pH, temperatura e outros), alguns que estimulam e outros que reprimem a ação enzimática, afetando o desempenho do processo fermentativo conduzido pelas leveduras (Lima et al., 2001).

Convém ressaltar que a levedura Saccharomyces é um aeróbio facultativo, ou seja, tem a habilidade de se ajustar metabolicamente, tanto em condições de aerobiose como de anaerobiose (ausência de oxigênio molecular). Os produtos fi nais da metabolização do açúcar irão depender das condi-

ções ambientais em que a levedura se encontra. Assim, enquanto uma porção do açúcar é transformada em biomassa, CO₂e H₂O em aerobiose, a maior parte é convertida em etanol e CO₂ em anaerobiose, processo denominado fermen- tação alcoólica (Lima et al., 2001). Para o cervejeiro, o catabolismo dos açúcares tanto em aerobiose como em anaerobiose são importantes. A via respiratória – energicamente mais efi ciente – é utilizada no início do processo de fermentação, com a fi nalidade de promover o crescimento e o reviramento do fermento. A via fermentativa tem a função de promover a transformação do mosto em cerveja, através da conversão do açúcar em etanol e gás carbônico (Venturini Filho & Ce- reda, 2001). Os carboidratos considerados substratos para a fermentação, tanto podem ser endógenos (constituintes da levedura, como glicogênio e trealose) como exógenos (sacarose, glicose, frutose e outros), estes últimos fornecidos a levedura (Lima et al., 2001).

Segundo Azeredo (1999), o mosto cervejeiro é compos- to em sua maior parte de carboidratos (cerca de 90%). O mosto contém os açúcares: sacarose, frutose, glicose, maltose e maltotriose além de dextrinas. De acordo com Hanns Seidel (1995) citado por Almeida (1999), em mostos obtidos apenas a partir de malte, os monossacarídeos representados pela glicose e frutose constituem de 7 a 9% do total de carboidratos; os dissacarídeos, representados pela sacarose e maltose, representam respectivamente 3% e 43-47% do total de carboidratos; os trissacarídeos, representados pela maltotriose, constituem de 11 a 13% do total; e os polissacarídeos, representados pelas dextrinas, constituem de 17 a 36% do total de carboidratos. O passo inicial na utilização dos açú- cares fermentescíveis pela levedura pode ser tanto a passa- gem intacta do açúcar através da membrana celular ou a sua hidrólise fora da membrana celular, seguida pela entrada na célula de alguns ou todos seus produtos de hidrólise. A maltose e a maltotriose são exemplos de açúcares que passam intactos através da membrana celular, enquanto a sacarose (e as dextrinas com Saccharomyces diastaticus) é hidrolisada por uma enzima extracelular, sendo seus produtos (glicose e frutose) metabolizados pela célula (Ameida e Silva, 2005).

Em uma situação normal, as leveduras cervejeiras são capa- zes de utilizar glicose, frutose, maltose e maltotriose, nesta seqüência aproximada, embora algum grau de superposição aconteça, sendo que as dextrinas somente são utilizadas por S. diastaticus (Russel, 1994). A sacarose é convertida em glicose e frutose pela enzima invertase produzida pela levedura (Walker, 2000). Na Figura 2 é mostrado o fl uxo dos principais carboidratos presentes no mosto cervejeiro, do exterior para o interior da levedura (Russel, 1994). Dos fatores ambientais que regulam a respiração e a fermentação em células de leveduras, a disponibilidade de glicose e oxigênio é o mais documentado (Walker, 2000). No caso de algumas leveduras,

Figura 1. Seqüência das reações enzimáticas pela fermentação alcoólica de carboidratos endógenos (glicogênio e trealose) ou exógenos (sacarose e maltose), conduzida por Saccharomyces cerevisiae (Lima et al., 2001)

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entre elas a Saccharomyces cerevisiae, em presença de glicose mesmo em condições estritamente aeróbias, o metabolismo é do tipo respiro-fermentativo. Esse comportamento meta- bólico é provocado por um efeito conhecido como efeito Crabtree ou repressão catabólica. Esse efeito se pronuncia em condições onde a concentração de glicose ultrapassa um va- lor limite. O mecanismo responsável pela repressão catabó- lica pode ser bastante complexo, mas estudos mostram que ocorre principalmente através do forte efeito repressivo da glicose sobre a atividade de enzimas respiratórias e também, possivelmente, pela inibição da expressão genética de enzimas constituintes da via respiratória, fazendo com que parte do piruvato que não pode ser oxidado pelo ciclo de Krebs seja reduzido a etanol pelo processo fermentativo (Bakker et al., 2001). Em contrapartida, um outro efeito conhecido como efeito Pasteur relaciona o oxigênio com a cinética do catabolismo de açúcar, estabelecendo que, sob condições anaeró-

bias, a glicólise aconteça mais rápido do que sobre condições aeróbias. Este fenômeno é observado somente quando as concentrações de glicose forem baixas (ex: cerca de 5nM em S. cerevisiae) ou sob certas condições de nutrientes limitantes (Walker, 2000). Segundo Nogueira & Venturine Filho (2005), a principal diferença entre o efeito Pasteur e o efeito Crabtree é que no primeiro, observa-se a tendência da levedura respi- rar em meios anaeróbios, enquanto no segundo, constata-se que a levedura pode fermentar mesmo na presença de oxigê- nio. Sabe-se que a glicose e a frutose (ou qualquer açúcar que forneça um destes açúcares por hidrólise), em concentração elevada, reprimem a respiração da levedura alcoólica. Portan- to, a respiração apenas é possível na presença de oxigênio e baixa concentração de açúcar; em todas as outras possibilida- des ambientais, a célula deverá fermentar preferencialmente.

O objetivo primordial da levedura, ao metabolizar anae- robicamente o açúcar, é gerar uma forma de energia (ATP, adenosina trifosfato) que será empregada na realização de diversos trabalhos fi siológicos (absorção, excreção e outros) e biossínteses, necessários à manutenção da vida, crescimento e multiplicação, para perpetuar a espécie. O etanol e o CO₂ resultantes se constituem tão somente de produtos de ex- creção, sem utilidade metabólica para a célula em anaerobiose. Entretanto, o etanol, bem como outros produtos de excreção (como o glicerol e ácidos orgânicos) podem ser oxidados metabolicamente, gerando mais ATP e biomassa, mas apenas em condição de aerobiose (Walker, 2000; Lima et al., 2001).

Na seqüência de reações enzimáticas de produção de ATP, e intrínsecas à formação de etanol, rotas metabólicas alternativas aparecem para propiciar a formação de mate- riais necessários à constituição da biomassa (polissacarídeos, lipídeos, proteínas, ácidos nucléicos e outros), bem como para a formação de outros produtos de interesse metabó-

Tabela 1. Aminoácidos na cervejaria

Figura 2. Metabolismo de carboidratos por Saccharomyces ssp (Russel, 1994)

Classe Grupo A Grupo B Grupo C Grupo D

I

Ácido glutâmico Glutamina Ácido aspártico

Asparagina Treonina

Prolina

II Valina

Isoleucina

Glicina Fenilalanina

Tirosina Alanina III

Lisina Arginina

Leucina Histidina

Maltose

Maltose Maltotriose

Maltotrise

α-glicosedase Glicose α-glicosedase Frutose

Glicose Glicose + Frutose

Sacarose Glicoamolase

Amido/Dextrina

Invertase

Permease Permease

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lico, relacionados direta e indiretamente com a adaptação e sobrevivência. Assim, juntamente com o etanol e o CO₂, o metabolismo anaeróbio permite a formação e excreção de glicerol, ácidos orgânicos (succínico, acético, pirúvico e outros), álcoois superiores, acetaldeído, acetoína, butilenoglicol, além de outros compostos de menor signifi cado quantitativo (Lima et al., 2001). Simultaneamente ocorre o crescimento das leveduras (formação de biomassa).

A formação do glicerol, o mais abundante dos compostos orgânicos secundários da fermentação, está acoplada à manu- tenção do equilíbrio redox celular, o qual é alterado quando da formação de ácidos orgânicos, biomassa e da presença de sulfi to no mosto. A formação de glicerol também está relacionada a uma resposta ao estresse osmótico, quando de concentrações elevadas de açúcares ou de sais no mosto (Walker, 2000; Lima et al., 2001).

Fermentações de mostos cervejeiros com concentrações de sólidos solúveis acima de 18% têm apresentado problemas relacionados principalmente à viabilidade celular, com uma fermentação lenta e incompleta. A toxidade do etanol e a alta pressão osmótica têm sido relatados como fatores limitantes (Casey et al., 1984). Dragone et al. (2003a), verifi caram experimentalmente que um aumento na concentração do mosto cervejeiro de 15 para 20 ºP resultou na diminuição da produtividade em etanol (Qp) em 0,08 g.l^-1.h^-1. Segundo Van Haecht et al. (1995), as leveduras produzem também sulfi to em uma quantidade que geralmente está relacionada com o total de açúcares fermentescíveis no mosto. Cervejas produ- zidas através de meio de concentração usual (cerca de 12 ºP) contêm menos que 10 mg/L de SO₂. Em contrapartida, cervejas elaboradas pelo método de alta concentração do meio (superiores á 12 ºP) podem conter sulfi to em níveis acima de 10 mg/L. Estes autores também afi rmam que mostos com a

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ni et al. (1993), citado por Van Haecht et al. (1995), usando diferentes mostos elaborados com 65% de malte e 35% de vários tipos de adjuntos, mostrou que um aumento na quantidade de substrato fermentescível aumenta signifi cativamente a quantidade de SO₂ fi nal.

São discutíveis as razões fi siológicas que levam a levedura a produzir e excretar o ácido succínico (o segundo produto or- gânico secundário mais abundante na fermentação alcoólica).

Admite-se que sua formação se deve a um meio fermentativo inadequado, pois não há evidência de necessidade metabólica desse ácido pela levedura, na proporção que é produzido.

Entretanto, parece que sua formação e excreção conferem às leveduras maior competitividade com as bactérias contaminates, numa fermentação industrial. O ácido succínico em ação sinérgica com o etanol exerceria uma intensa atividade antibacteriana, o que é notado durante uma fermentação al- coólica (Lima et al., 2001).

O acetaldeído é o precursor imediato da síntese do etanol. Quantidades signifi cativas passam para o mosto fermen- tado e são reabsorvidas, no fi nal da fermentação. Presente em excesso (25 mg/L) proporciona um fl avor de “amônia”

na cerveja. A fermentação em altas temperaturas e a super dosagem de fermento podem ocasionar um aumento no teor de acetaldeído (Schimdt, 1996 citado por Azeredo, 1999).

Os íons inorgânicos

Além de carbono e nitrogênio, os microrganismos exigem uma série de outros elementos, sob a forma de compostos inorgânicos. Alguns são necessários em quantidades apreciá- veis – macronutrientes- enquanto que, de outros, bastam tra- ços – micronutrientes. Dentre os primeiros temos o fósforo, sob a forma de fosfatos, importante no metabolismo energé- tico e na síntese de ácidos nucléicos: o enxofre, necessário por fazer parte de aminoácidos como cistina e cisteína e para a síntese de vitaminas com a biotina e tiamina; o potássio, ativador de enzimas e regulador da pressão osmótica; o magné- sio, ativador de enzimas extracelulares e fator importante na esporulação; o ferro, necessário para a síntese dos citocro- mos e de certos pigmentos. O papel dos micronutrientes não é tão bem conhecido, dadas as difi culdades de seu estudo.

Tem-se, todavia, demonstrado, em casos específi cos, a necessidade de elementos como cobre, cobalto, zinco, manganês, sódio, boro e muitos outros (Alterthum, 2001).

Sabe-se que a levedura cervejeira S. cerevisiae requer tra- ços de alguns minerais, como cobre (0,012 ppm), ferro (0,075 ppm) e zinco (0,5 ppm). Entretanto, o excesso desses metais pode levar a alguns problemas. A maioria dos mostos forne-

α- acetolactato valina

α- acetolactato descarboxilase

reação não enzimática

diacetil diacetil redutase NADH

acetoína

2, 3- butanodiol

Figura 3. Esquema metabólico envolvendo o α-acetolactato (Yamauchi et al., 1995a)

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ce esses elementos em proporção adequada, porém algumas cervejarias adicionam zinco, para corrigir eventuais defi ciên- cias oriundas da adição de uma grande quantidade de adjuntos (Azeredo, 1999).

De acordo com Fix (1989) citado por Azeredo (1999), os íons magnésio desempenham um importante papel no crescimento da levedura, como co-fator em muitas reações metabólicas. O malte geralmente fornece um suprimento adequado desse íon. Ao contrário, o íon cálcio, que é alta- mente benéfi co à mosturação, tende a inibir o crescimento da levedura, em quantidades excessivas, sendo seu limite de 100 ppm.

O nitrogênio

Segundo Azeredo (1999), o conteúdo de nitrogênio no mosto cervejeiro representa 5% dos sólidos solúveis totais.

A principal fonte de nitrogênio para a síntese de proteínas, ácidos nucléicos e outros componentes nitrogenados é a va- riedade de aminoácidos formados a partir da proteólise das proteínas do malte. O mosto contém 19 aminoácidos e, sob condições fermentativas de uma cervejaria, as leveduras os consomem de uma maneira ordenada, sendo que diferentes aminoácidos são removidos em vários estágios do ciclo fermentativo (Russel, 1994). Conforme relatado por Fix (1989) citado por Azeredo (1999), os aminoácidos são absorvidos pela levedura na seguinte seqüência:

Grupo A: Aminoácidos que são rapidamente absorvidos no meio e são eliminados do mosto no fi nal da fase de crescimen- to da levedura. São eles: Ácido glutâmico, Glutamina, Ácido aspártico, Asparagina, Serina, Treonina, Lisina e Arginina.

Grupo B: Aminoácidos que são absorvidos mais lentamente.

São eles: Valina, Leucina, Isoleucina e Histidina.

Grupo C: Aminoácidos que são absorvidos somente após a fase lag e somente após a eliminação dos aminoácidos do Grupo A do mosto. São eles: Glicina, Felilalanina, Tirosina, e Alanina.

Grupo D: Aminoácidos que permanecem presentes por toda a fermentação. A saber: Prolina.

É comum, classifi car os aminoácidos de acordo com seu papel na fermentação e sua contribuição como nutriente para a levedura (Tabela 1):

Classe I – Esses aminoácidos podem ser sintetizados pela levedura durante a atividade metabólica normal. Não é ne- cessária sua presença no mosto.

Classe II – Esses aminoácidos são vitais para o metabolismo da levedura, devendo ser fornecidos pelo mosto. A sua remo- ção do mosto pode levar a alteração do fl avor da cerveja.

Classe III – Esses aminoácidos são cruciais no metabolismo da levedura. O mosto cervejeiro constitui a sua única fonte. A remoção desses aminoácidos pode alterar signifi cativamente o fl avour fi nal da bebida.

A formação de álcoois superiores e diacetil (2,3 butano- diona), como subprodutos da fermentação está intimamente relacionada com o metabolismo dos aminoácidos (Almei- da,1999). O diacetil é uma cetona produzida tanto pelas leveduras cervejeiras como por bactérias lácticas (contaminates), é capaz de conferir odor (desagradável) de manteiga rançosa a bebida, em concentração igual ou superior a 0,10 ppm (Ven- turini Filho & Cereda, 2001). Cabe ressaltar, a importância do aminoácido valina para a levedura cervejeira. Na ausên- cia desse composto, a levedura vai sintetizá-lo, produzindo a partir do piruvato, α-acetolactato, que é reduzido à valina, conforme demonstrado na Figura 3 (Yamauchi et al., 1995a).

O excesso de α-acetolactato é excretado pela célula e no mosto, de acordo com o pH do meio, temperatura, presen- ça de oxigênio etc. esse composto será reduzido a diacetil (Figura 4). Na fase de maturação, a levedura reincorpora esse diacetil, metabolizando-o até acetoína, que não altera o fl avour da cerveja. Entretanto, em presença de grandes quantidades de diacetil, devido à produção do mesmo por bactérias contaminantes como Lactobacillus sp e Pediococcus sp, a levedura não consegue metabolizar todo o diacetil e este permanecerá no mosto, afetando a qualidade do produto fi - nal, promovendo o já citado fl avour de manteiga rançosa (Ya- mauchi et al., 1995b). O controle efi ciente da concentração de diacetil pode ser obtido com estratégias para a prevenção da formação do precursor (α-acetolactato), ou de aumento da taxa de descarboxilação química do precursor (Carvalho et al., 2006b). Segundo Munroe (1994), tanto o diacetil como a 2,3 pentanodiona (ambos dicetonas vicinais) são importan-

piruvato

α- acetolactato α- acetolactato

valina diacetil acetoína

diacetil EXTRATO (Açúcar fermentescível)

Figura 4. Excreção do da célula de levedura α-acetolactato (Yamauchi et al., 1995b)

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Revista Analytica^•Dezembro 2006/Janeiro 2007^•Nº26 53 prilato de etila e acetato de fenil etila. A síntese dos ésteres, durante a fermentação da cerveja, ocorre pela reação entre álcoois e intermediários metabólicos da biossíntese de lipíde- os, conforme detalhado na Figura 6 e pode ser infl uenciada por vários fatores, como o conteúdo de lipídeos no mosto, o teor de oxigênio dissolvido no mosto, a cepa de levedura, etc.

Isso ocorre porque a produção de acetato de etila e acetato de isoamila é catalisada pela enzima álcool-ecetiltransferase, enzima ligada a parede celular, que é inibida por ácidos graxos insaturados. Muitos fatores que aumentam o teor de ácidos graxos instaurados podem reprimir a biossíntese dos ésteres (Yamauchi et al., 1994 citados por Azeredo, 1999).

Os ácidos graxos são formados pela biossíntese de lipídeos ou excesso de intermediários do metabolismo de carboidratos.

As cadeias carbônicas longas de ácidos graxos de C₁₄ a C₁₈ são encontradas no mosto. As cadeias pequenas de C₄ a C₁₂ são for- madas pela levedura. A autólise da levedura pode contribuir, em grande parte para o aumento de ácidos graxos no mosto. Outros fatores estão ainda associados, como valores elevados de pH e de extrato inicial no mosto (Verstrepen et al., 2003).

As vitaminas

Denominam-se fatores de crescimento os compostos or- gânicos indispensáveis a um determinado microorganismo, mas que ele não consegue sintetizar. Tais fatores, portanto, devem estar presentes no meio para que o microrganismo possa crescer. Muitos desses fatores são vitaminas, em espe- cial do complexo B; outras vezes são aminoácidos, nucleotí- deos e ácidos graxos. As necessidades dos microrganismos, nesse particular, são variadíssimas (Alterthum, 2001).

A cevada e o malte são fontes ricas de muitas vitaminas, dentre elas, as do complexo B, importante fator de crescimento para levedura, durante a fermentação. Nesse grupo, biotina, inositol e pantotenato são importantes. Um mosto com um alto conteúdo extrato de malte irá suprir essas vitaminas, em pelo menos duas vezes mais, do que a necessidade da levedura (Azeredo, 1999).

Verifi ca-se na literatura que efeitos de estresse tais como elevadas pressões osmóticas e a falta de nutrientes em mostos cervejeiros de alta densidade, afetam negativamente o 2,3 pentanodiona, cujo precursor é o α-acetohidroxibutira-

to, produzido pela levedura quando se processa a síntese do aminoácido isoleucina.

O metabolismo dos aminoácidos isoleucina, leucina e valina liberam a maior parte dos álcoois superiores. Estes reforçam a atividade fi siológica do etanol, diminuindo a tolerância à bebida, estando associados à dor de cabeça. Os álcoois superiores juntamente com os ésteres são componentes essenciais para a caracterização do fl avour da cerveja. Os principais álcoois superiores formados durante a fermentação são o álcool isoamílico, o isobutanol e o n-propanol. Na formação dos álcoois superiores, os aminoácidos presentes no mosto são primeiramente desaminados para a formação dos oxi-ácidos correspondentes e então os aminoácidos são biossintetizados na célula da levedura. O pool de oxi-ácidos é derivado, principalmente, da absorção de aminoácidos do mosto e parte é derivada do metabolismo dos carboidratos, conforme demonstrado na Figura 5. Os principais fatores que aumentam a produção de álcoois superiores na fermentação cervejeira são: elevado teor de ami- noácidos no mosto, altas temperaturas, altas concentrações de etanol e uma alta dosagem de levedura (Yamauchi et al., 1994 citados por Azeredo, 1999).

Os lipídeos

A fração de lipídeos no mosto está entre 5 a 7 mg por 100 mL. Eles são derivados de três fontes: um grupo é prove- niente do metabolismo da levedura e é tipicamente saturado.

O lúpulo oxidado, também constitui outra fonte. O grupo de maior interesse, no entanto, são os ácidos graxos insaturados, derivados do malte. Eles são tipicamente encontrados no trub do mosto, o qual consiste em mais de 50% de lipíde- os. Quantidades consideráveis desses lipídeos são extraídos no mosto, durante o processo de mosturação. Durante o processo fermentativo, o metabolismo dos lipídeos prove- nientes do mosto ocorre somente na fase aeróbia. Células mais velhas de levedura cervejeira costumam conter muitas gotículas de gordura no citoplasma. Os lipídeos possuem efei- to negativo sobre a qualidade sensorial da cerveja, afetando ainda e estabilidade da espuma. O aspecto positivo é que participam de muitas reações no metabolismo da levedura, dentre elas, contribuem para inibir a formação de ésteres de acetato, durante a fermentação. Os ésteres são os principais responsáveis pelo fl avour da cerveja. Altos teores de ésteres aumentam a ação fi siológica do etanol e diminuem o paladar da cerveja (Azeredo, 1999). De acordo com Verstrepen et al.

(2003), os principais ésteres ativos no fl avour da cerveja são:

acetato de etila, acetato de isoamila, caproato de etila, ca-

Álcoois

superiores Aminoácidos

Levedura Figura 5. Síntese metabólica dos Álcoois Superiores (adaptado por Azeredo, 1999)

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R e f e r ê n c i a s

desempenho fermentativo da levedura cervejeira S. cerevisiae.

Para alcançar as vantagens da elaboração de cervejas por este processo (high gravity), devem ser consideradas algumas es- tratégias para acelerar as fermentações. Uma das soluções propostas para reduzir o tempo de fermentação e aumentar a concentração de etanol é a suplementação nutricional do meio com fontes de nitrogênio assimilável, vitaminas, esteróis e ácidos graxos insaturados (Casey et al., 1984; Dragone et al., 2003b).

C

ONCLUSÃO

Conclui-se que a busca na melhora da produtividade e da estabilidade sensorial da cerveja depende do conhecimento e

controle de vários fatores que infl uenciam o processo biotec- nológico cervejeiro (temperatura de fermentação; concen- trações de substratos, células de leveduras, etanol etc.). De- talhes como a composição química do mosto, o metabolismo e a regulação metabólica da levedura cervejeira no decorrer da fermentação, são primordiais ao pesquisador cervejeiro na elaboração de estratégias de controle e aperfeiçoamento deste processo.

Agradecimento

Os autores agradecem o apoio fi nanceiro recebido da Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo – FA- PESP, para o desenvolvimento de projetos de pesquisa.

Artigo

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