Entre as substâncias avaliadas, o conocarpan apresentou atividade inibitória contra cepas de Staphylococcus aureus, atividade comparável aos antimicrobianos comerciais. No trabalho realizado por Pessini et al. 2007), o composto conocarpane isolado do gênero Piper apresentou inibição contra cepas de S.
Objetivo geral
Objetivos específicos
Conocarpano
Nos estudos realizados por Freixa et al. 2005) a substância conocarpan demonstrou atividade antifúngica contra leveduras com concentração inibitória mínima (CIM) entre 6,3 e 25 μg/mL e atividade marcante contra dermatófitos com CIMs ≤ 1 a 9 μg/mL. Nos estudos realizados por De Campos et al. 2007) o conocarpan demonstrou ser inativo contra bactérias Gram-negativas (Escherichia coli e Salmonella typhimurium), mas apresentou CIM entre 4 e 7 μg/mL contra bactérias Gram-positivas, e contra a cepa padrão de Staphylococcus aureus (ATCC 6538P) o A CIM foi de 4 µg/mL.
Staphylococcus aureus
A transmissão de microrganismos pode ocorrer por contato direto ou através de fômites (MURRAY et al., 2000). Entretanto, a resistência a esses antimicrobianos foi detectada dois anos após o início de seu uso (MURRAY et al., 2000; KONEMAN et al., 2001).
Agentes antimicrobianos
Os antibióticos, provenientes da antibiose, são substâncias anti-infecciosas, de origem natural, produzidas metabolicamente por microrganismos, enquanto agentes. Inibidores da síntese da parede celular: Por atuarem em estruturas que não existem nas células humanas, os agentes antimicrobianos com este local de ação são muito seguros e amplamente utilizados. Inibidores da síntese proteica: Os agentes com este local de ação podem atuar na subunidade ribossômica grande ou pequena, tanto em células procarióticas (subunidade 30S e 50S) quanto em células eucarióticas (subunidade 40S e 50S).
No caso de síntese parcial, as moléculas são completadas em laboratório para melhorar as propriedades antimicrobianas ou farmacológicas (MIMS et al., 1999; TRABULSI et al., 1999). As plantas possuem diversas vias metabólicas secundárias que criam diversas substâncias, incluindo alcalóides, flavonóides, isoflavonóides, taninos, cumarinas, quinonas, terpenos, polipeptídeos, polifenóis, bem como óleos essenciais, que às vezes são específicos de diversas famílias e gêneros. ou espécies, e cujas funções, até recentemente, eram desconhecidas, mas muitos destes compostos já demonstraram atividade antimicrobiana (CLARKE et al., 2001; COWAN, 1999; SIMÕES, 1998). Alguns estudos demonstraram que além de atividades em um microrganismo específico, substâncias obtidas de plantas apresentam atividade contra cepas de microrganismos resistentes a antimicrobianos, bem como efeito sinérgico entre substâncias vegetais associadas a outras substâncias vegetais, ou mesmo com antimicrobianos inativos. aumentando sua atividade (TSUCHIYA et al., 1996, BELOFSKY et al., 2004; FERNANDES Jr. et al., 2005; BETONI et al., 2006; CHANG et al., 2007; HORIUCHI et al., 2007; HORIUCHI et al., 2007; HORIUCHI et al., 2007; HORIUCHI et al., 2007; al., 2007).
Resistência bacteriana
Os microrganismos adquirem resistência através de vários mecanismos, mas clinicamente relevantes incluem a síntese de enzimas que inativam o fármaco, prevenção do acesso ao sítio alvo (inibição da absorção ou aumento da excreção) ou modificação do sítio alvo (BLACK, 1996; SCHAECHTER et al et al., 2002). À medida que as bactérias resistentes continuam a proliferar, novos problemas de resistência continuarão a surgir, complicando e dificultando o tratamento de doenças infecciosas. Contudo, Wood e Wolinsky (1971) encontraram apenas 27% de cepas sensíveis às penicilinas, número muito semelhante aos 26% relatados por Ross et al. 1974), em infecções comunitárias em crianças, indicando a indicação deste antimicrobiano para o tratamento de infecções causadas por S. Estudos realizados por Hughes et al. 1976), mostrou uma diminuição de até 15% na sensibilidade de S.
O monitoramento contínuo do perfil de suscetibilidade desse microrganismo no ambiente hospitalar é essencial, mas o perfil nas infecções comunitárias deve ser conhecido, pois o uso indiscriminado de antimicrobianos poderia alterar o comportamento desse microrganismo, como aconteceu com a penicilina. (ZAVADINACK-NETTO et al., 2001). É importante que sejam realizados estudos que visem o desenvolvimento ou possibilidade de administração simultânea de substâncias (SILVEIRA et al., 2006). A resistência bacteriana aos antimicrobianos é uma crise global emergente e a compreensão dos mecanismos de resistência é de fundamental importância para o desenvolvimento de novas estratégias de terapia anti-infecciosa (KUMAR; SCHWEIZER, 2005), bem como para a pesquisa, descoberta e produção de novos antimicrobianos. agentes. estar crescendo e sendo necessário.
Teste de sensibilidade antimicrobiana in vitro
A atividade antimicrobiana é medida in vitro para determinar a sensibilidade de um microrganismo a concentrações conhecidas de um determinado agente antimicrobiano (JORGE, 1997). Os testes foram realizados utilizando dois métodos, difusão e diluição em ágar para determinar a concentração inibitória mínima (CIM) ou a concentração bactericida mínima (CBM) (SERUFO; CLEMENTE, 2001). No teste de difusão, as informações obtidas são qualitativas, úteis para determinar a sensibilidade do microrganismo, mas não para estabelecer comparação de potência antimicrobiana.
O método causa problemas com substâncias que não se difundem no meio ambiente (SOUZA et al., 2003). Consiste em preparar diluições sucessivas do agente antimicrobiano para que o inóculo bacteriano seja em número padronizado antes de cada diluição e após a incubação verificando a menor concentração do agente antimicrobiano que inibiu a multiplicação bacteriana (TRABULSI et al., 1999). Vários fatores podem limitar ou distorcer os resultados dos testes que medem a atividade antimicrobiana in vitro, como o meio de cultura utilizado, que deve ser adequado e sem interferência de seus componentes na atividade do medicamento, no pH do meio, na temperatura e na incubação. atmosfera, o tamanho do inóculo, a concentração do medicamento, que deve ser padronizada (TAVARES, 1996).
MATERIAIS E MÉTODOS
Obtenção do conocarpano e seus derivados e análogos
Material microbiológico
- Isolamento e identificação dos microrganismos
- Manutenção dos microrganismos
As cepas que confirmaram o resultado para a espécie S.aureus foram então submetidas ao teste de suscetibilidade antibacteriana (antibiograma) para obtenção do perfil de resistência e determinação da concentração inibitória e bactericida mínima (CIM e CBM, respectivamente) para cada cepa isolada. As cepas bacterianas foram preservadas em ágar nutriente e mantidas refrigeradas (4 ºC) no Laboratório de Pesquisa em Microbiologia do curso de Farmácia da UNIVALI. Cada cepa bacteriana foi transferida do meio de manutenção para o meio BHI por 24 horas para ativar a respectiva cultura. A cepa bacteriana foi então semeada em ágar Mueller-Hinton (MERCK) e incubada a 37ºC por 18-24 horas.
Perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos
- Preparo dos inóculos
- Difusão radial em ágar
- Concentração inibitória mínima (CIM)
- Concentração bactericida mínima (CBM)
- Avaliação da associação dos antimicrobianos
O inóculo final para o ensaio de antibiograma foi de aprox. 1,5x108 células/ml, enquanto o inóculo final para o ensaio MIC foi entre 1 e 5x105 células/ml para obter entre 1 e 5x103 células em cada diluição (100 µL) (NCCLS, 19933)). A avaliação do perfil de resistência antimicrobiana foi realizada utilizando o ensaio de difusão radial em ágar, conforme recomendado pelo CLSI (2005). Após adição do inóculo bacteriano previamente preparado conforme descrito no ponto 4.3.1, as microplacas foram incubadas a 37 ºC por 12 horas.
Para determinação da concentração bactericida mínima, as culturas provenientes do teste MIC (ponto 4.3.3) foram expostas às suas subculturas em meio ágar Mueller-Hinton sem amostras e incubadas a 37 ºC por 18 a 24 horas utilizando um replicador (sigma). Para interpretação dos resultados, considera-se que a inibição no teste de CIM e o crescimento do microrganismo na subcultura (CBM) significou ação bacteriostática, e a ausência de crescimento na subcultura foi bactericida (BARON; FINEGOLD, 1990). A avaliação da associação dos antimicrobianos com a substância conocarpane foi realizada pelo método de difusão radial em ágar, conforme descrito no ponto 4.3.2, com modificações.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Seleção das cepas resistentes
- Perfil de resistência das cepas bacterianas
Utilizamos antibiograma para investigar a sensibilidade das cepas isoladas do ambiente hospitalar, devido à alta variabilidade de resistência. Cepas bacterianas que apresentaram resistência a pelo menos um dos 12 antimicrobianos testados foram selecionadas como critério para seleção de cepas a serem utilizadas em testes de atividade antimicrobiana. Para verificar o perfil de resistência aos antimicrobianos foi utilizado o método de difusão radial em ágar (antibiograma), que permite a classificação das cepas como resistentes, suscetíveis intermediárias ou suscetíveis aos antimicrobianos testados, de acordo com as normas recomendadas pelo CLSI (2005) (Tabela 1 ).
A determinação do perfil de suscetibilidade das cepas bacterianas isoladas do ambiente hospitalar mostrou que 50% das cepas eram resistentes a quase todos os antimicrobianos testados, exceto à vancomicina, que foi o único antimicrobiano capaz de inibir todas as cepas testadas. Os valores de prevalência de cepas resistentes a um determinado antimicrobiano variam significativamente dependendo da comunidade (SADER et al., 2004). A determinação da sensibilidade das cepas de S.aureus obtidas de isolados clínicos permitiu a confirmação da resistência bacteriana aos antimicrobianos testados e, portanto, a seleção de microrganismos para realização de testes para avaliação da atividade antimicrobiana do conocarpan, seus derivados e análogos.
Atividade antibacteriana
Os resultados de CIM encontrados para as substâncias obtidas do conocarpano por acetilação, metilação e benzilação, bem como para os análogos α-di-isoeugenol e diidroisoeugenol (Tabelas 3 e 4), podem estar diretamente relacionados às diferentes estruturas químicas dessas substâncias (Figura 3). ). . Com a correlação entre a estrutura e a atividade das substâncias derivadas do conocarpan e dos análogos do conocarpan, presume-se que o efeito que poderia dificultar a perda da atividade antibacteriana pode estar relacionado à hidrofobicidade, uma vez que a substância do conocarpan é menos lipofílica em comparação aos derivados e análogos . .. Com este estudo, também foi estabelecido que devido à falta de um grupo hidroxila ligado na posição 4 da estrutura fenil-propenil-benzofurano nos derivados metilados, acetilados e benzoilados do conocarpan, eles não apresentaram atividade antimicrobiana.
Os resultados encontrados neste trabalho para MIC (teste de microdiluição em meio líquido) foram inferiores (1,87 μg/mL), provavelmente devido ao fato da substância conocarpan ser mais acessível em meio líquido, ou seja, com maior contato com o microrganismo, o que pode não ocorreu com a mesma intensidade quando utilizado meio sólido (teste de ágar).Apesar das diferenças entre a CIM e o CBM do conocarpan, os resultados encontrados confirmaram que a substância possui atividade bactericida, considerada uma propriedade desejável dos agentes antimicrobianos, tornando tornando-os clinicamente mais interessantes para utilização em ambientes hospitalares. Portanto, não é surpreendente que a estrutura do conocarpan não se assemelhe a nenhuma estrutura clínica de medicamento antimicrobiano.
Avaliação da associação entre antimicrobianos
Tabela 1: Perfil de suscetibilidade de cepas de Staphylococcus aureus resistentes a antimicrobianos de uso clínico associados ao conocarpan. Quanto à cepa S11, os resultados mostraram que não houve alteração no perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos clínicos quando associados ao conocarpan até a concentração máxima de 4 μg/mL, demonstrando que não afeta o efeito dos testados medicamentos antimicrobianos. Quando o conocarpan foi adicionado à cultura, as cepas apresentaram resistência a quatro agentes antimicrobianos, representando uma redução de 63,6% na resistência aos antimicrobianos testados para uso clínico.
Estes resultados sugerem que a substância conocarpan melhora a atividade dos antimicrobianos testados para uso clínico. Por outro lado, os possíveis mecanismos que o conocarpan pode utilizar para aumentar a eficácia dos antimicrobianos para uso clínico ou para aumentar a eficácia antimicrobiana da combinação são variados. Os resultados encontrados demonstraram o efeito sinérgico do conocarpan quando associado a antimicrobianos comumente utilizados, confirmando seu potencial para uso clínico devido aos excelentes resultados obtidos, isoladamente ou em combinações, principalmente contra cepas de S.
