PRODUÇÃO DE EMBRIÕES IN VITRO DE ENALAPRILAT E GEL DE ENALAPRIL INTRAVAGINAL EM BOVINOS. KUNKEL, D. PRODUÇÃO DE EMBRIÕES IN VITRO DE ENALAPRILAT E GEL DE ENALAPRIL POR FLUXO INTRAVAGINAL EM BOVINOS 2020.86f. Em relação ao capítulo "Enalaprilato na produção in vitro de embriões bovinos" Os ovários foram obtidos de frigoríficos com inspeção municipal.
As etapas de aspiração dos folículos antrais, maturação, fertilização e cultivo foram realizadas de acordo com a técnica de produção in vitro de embriões já consagrada. Influência do enalaprilato e do inibidor de angiotensina (1-7) na produção in vitro de embriões bovinos", mas os oócitos utilizados foram cultivados na ausência e na presença de 2 µM de enalaprilato, 2 µM de A-779 e 2 µM de enalaprilato + 2 µM de A- 779. Além disso, a produção in vitro de embriões permite o aprofundamento de conhecimentos relacionados aos processos fisiológicos, bioquímicos e biotecnológicos das espécies estudadas, sem a necessidade de utilização de animais de laboratório (GONÇALVES et al., 2008).
Ciclo Estral
Pesquisas demonstraram que a angiotensina II (Ang-II) tem um papel importante nos processos de maturação oocitária e ovulação (YOSHIMURA et al., 1996), e sua relação com a ovulação foi confirmada após o bloqueio dos receptores Ang II pela inibição completa da ovulação na pré-puberdade. ratas, mesmo quando esses animais são estimulados com gonadotrofina coriônica equina (eCG) e gonadotrofina coriônica humana (hCG) (PELLICER et al., 1988). A enzima conversora de angiotensina (ECA) foi identificada como um dos componentes reguladores do desenvolvimento folicular e maturação oocitária, pois está distribuída na superfície folicular dos oócitos e na zona pelúcida (BRENTJENS et al., 1986). Observações ultrassonográficas revelaram que o desenvolvimento e a regressão dos folículos ovarianos durante o ciclo estral ocorrem em um padrão de ondas que varia de duas a quatro ondas por ciclo. ciclo em vacas Bos taurus e de dois para três em vacas Nelore, com o crescimento de um folículo dominante. e atresia nos demais (BÓ, 2000; HAFEZ; HAFEZ, 2004; SARTORI et al., 2011).
Outra diferença notável é o diâmetro máximo do folículo dominante, em vacas Nelore o diâmetro pode atingir entre 10-12 mm, enquanto em vacas holandesas pode chegar a 16-20 mm (SARTORI et al., 2011).
Sistema Renina Angiotensina (SRA)
Sistema Renina Angiotensina Ovariano
Os receptores atuam em vários locais dos órgãos reprodutivos, nas mulheres os receptores AT1, AT2 e MAS têm afinidade para o desenvolvimento de folículos, células da granulosa, células em apoptose e ovulação, enquanto nos homens os receptores AT1 e MAS atuam principalmente na esteroidogênese, contratilidade. epidídimo e nas funções espermáticas (GONÇALVES et al., 2012; FERREIRA et al., 2011; LEUNG et al., 2003; REIS et al., 2010;).
Inibidores da Enzima Conversora de Angiotensina (IECAs)
Ação dos inibidores da ECA no trato reprodutivo
O uso do captopril em combinação com o ácido acetilsalicílico aumentou o fluxo sanguíneo para os ovários e útero de éguas cíclicas, promovendo maior fluxo de nutrientes, hormônios e estimulantes do crescimento endócrino (BOLLWEIN et al., 2004). Quanto à inibição da produção de Ang-II pelo captopril, esta não afetou a ovulação em ratas estimuladas com eCG/hCG ou em ovários perfundidos (DAUD et al., 1990; PETERSON et al., 1993; YOSHIMURA et al., 1994), sugerindo que a Ang-II produzida localmente não é crítica para o processo de ovulação (PEREIRA et al., 2015). O mecanismo de ação envolve a geração de outros fragmentos de angiotensina sem a participação da ECA. Por exemplo, a Ang-(1-7) pode ser formada por vias independentes da ECA, como ocorre na conversão direta de Ang-II em Ang-(1-7) pela via da ECA2, além de outras enzimas como a neutra endopeptidase (NEP) e prolilendopeptidase (PEP) que convertem Ang-I em Ang-(1-7) (SANTOS et al., 2013).
Esta falta de efeito dos inibidores da ECA na ovulação pode ser atribuída a um aumento de Ang-(1-7) possivelmente induzido por gonadotrofinas, por exemplo a administração de GnRH em vacas que aumenta a concentração de Ang-(1-7) aumentada em vacas. o fluido folicular (TONELLOTTO dos SANTOS et al., 2011).
Função ovariana e esteroidogênese
Estudos realizados utilizando o enalapril como inibidor da ECA não tiveram efeitos sobre a ovulação em ovelhas submetidas a um protocolo de sincronização de estro e ovulação para inseminação artificial e superovulação (COSTA et al., 2014; PEREIRA et al., 2015), quando comparados a modelos (DAUD et al., 1990; PETERSON et al., 1993; YOSHIMURA et al., 1994) que usaram captopril. Além disso, o uso de gonadotrofinas exógenas também pode estimular importantes fatores parácrinos relacionados ao processo ovulatório, como membros da família do fator de crescimento epidérmico (EFG) (ASHKENAZI et al., 2005; CONTI et al., 2006) e prostaglandinas ( RICHARDS et al., 2002a), o que pode mascarar os efeitos dos inibidores da ECA na ovulação. Em relação ao enalapril, Pereira et al. 2015), mostrou que a inibição da ECA durante um protocolo de superovulação em ovelhas diminui a produção de estradiol, enquanto Costa et al. 2014), utilizou enalapril em um protocolo de sincronização de estro em ovelhas e neste protocolo houve aumento na produção de estradiol.
Considerando esses fatos, para um protocolo de superovulação, recomenda-se a administração do inibidor da ECA após a retirada da fonte de progesterona (PEREIRA et al., 2015).
Produção in vitro de embriões (PIV)
Maturação in vitro (MIV)
In vivo, a retomada da meiose é iniciada por um aumento pré-ovulatório de LH e ocorre apenas em oócitos de folículos dominantes, maduros e prontos para a meiose. Nas células internas do cumulus, vários processos penetram na zona pelúcida e atingem o oolema com junções comunicantes (RICHARDS et al., 2002b). A maturação, a fecundação e o desenvolvimento embrionário apresentaram melhores resultados na presença de células do cumulus, fato que ressalta a importância dessas células na maturação oocitária in vitro (GONÇALVES et al., 2008).
Durante a maturação molecular do oócito ocorre a síntese do mRNA materno e de proteínas importantes para o desenvolvimento embrionário inicial (SIRARD demonstrou em roedores que a capacidade translacional e o acúmulo de proteínas pelo oócito é dependente da ação do FSH, que através do ação do EGF nas células somáticas do folículo determinou a ativação da via PI3K/AKT dentro do oócito. retirada do oócito Com o fechamento das junções comunicantes e a diminuição dos níveis de cGMP (Cyclic Guanosine Monophosphatase), o processo de reinício da meiose ocorre dentro do oócito.
Esses eventos provocam a ativação da enzima Fosfodiesterase 3 (PDE3A), que serve para quebrar o cAMP (Cyclic Adenosine Monophosphatase), que posteriormente leva a uma diminuição dos níveis de cAMP, o que resulta no rompimento da célula germinativa através da via de desfosforilação. o CDK1 determinado. proteína e ativação do MPF. A ruptura do blasto germinativo é seguida pela organização do material genético até atingir a metáfase II, que está associada à ativação da MAPK dentro do oócito. O processo de maturação também depende da participação de fatores autócrinos e parácrinos produzidos e secretados pelas células que compõem o ambiente folicular.
Este último é o mais utilizado entre os laboratórios de PIV, que geralmente é suplementado com soro fetal bovino (FBS), aminoácidos como L-glutamina, bicarbonato de sódio, FSH, LH, estradiol-17β, piruvato de sódio, lactato, vitaminas e antibióticos (GANDHI et al., 2000; SMETANINA et al., 2000). Além disso, também é necessário o uso de estufa que mantenha atmosfera gasosa e temperatura controlada e adequada, sendo que o tempo de maturação varia de 18 a 24 horas em atmosfera controlada contendo 5% de CO2 no ar e umidade saturada (GONÇALVES et al. ., 2007 ; VARAGO et al., 2008).
Fecundação in vitro (FIV)
Para sistemas de maturação de IVP em bovinos, diversos meios têm sido estudados e testados para esta etapa, como Fluido Ovidutal Sintético - SOF, Ham's F-12 e Meio de Cultura de Tecidos 199 (TCM 199®).
Cultivo in vitro (CIV)
Objetivo Geral
Objetivos Específicos
Além disso, vacas Bos indicus respondem bem ao tratamento com estradiol e progesterona para sincronizar o surgimento de uma nova onda folicular (MAPLETOFT, et al., 2009). No entanto, existe uma classe de drogas que promovem a inibição dessa enzima, elas se ligam ao sítio catalítico da ECA, causando um bloqueio reversível na conversão da angiotensina I em angiotensina II (TAVARES et al., 2015). Com base nesse conhecimento, nos resultados encontrados em estudos conduzidos por nosso grupo e no fato de que o inibidor da ECA aumenta a disponibilidade de Ang-(1-7), a adição de enalapril (IATF) a cabras aumentou as taxas de prenhez. , parto e gêmeos (FERNANDES NETO et al, 2018), em ovinos causaram aumento da concentração sérica de estradiol no período pré-ovulatório (D12) (COSTA et al., 2014).
Fazer com que os níveis de Ang II aumentem gradativamente, apesar da manutenção da inibição da ECA (MOOSER et al., 1990). A inibição da ECA pode ser realizada por meio de inibidores como o enalapril, que causa um bloqueio reversível na conversão da angiotensina I em Ang-II (Tavares et al., 2015). A inibição da ECA resulta em menor disponibilidade de Ang-II e maior disponibilidade de Ang-(1-7) (Brosnihn et al., 1999).
Dados da literatura indicam que a ECA está presente nos mesmos locais de ação da Ang-II, podendo alterar a disponibilidade de Ang-II e influenciar o desenvolvimento folicular e a ovulação (Pan et al., 2013). No entanto, os resultados do presente estudo, com a adição de enalaprilato ao meio de maturação in vitro, fertilização e cultura embrionária, mostram que a inibição da ECA não afetou a taxa de blastocisto, mesmo com a possível diminuição da disponibilidade de Ang-II , que pode atuar na formação do blastocisto, mas isso não foi observado, provavelmente porque sua ação na maturação oocitária ocorre por meio das células da teca (Stefanello et al., 2006), ausentes no modelo de cultivo adotado no experimento. Portanto, a ECA induz a produção excessiva de Ang-II que pode prejudicar a capacidade reprodutiva por meio do aumento do estresse oxidativo (Yoshimura et al., 1994).
Com a inibição da ECA pelo enalapril, observou-se bloqueio da produção de Ang-II e aumento da atividade antioxidante no cérebro de ratos com neurodegeneração (Kmet et al., 2019), e o enalapril inibiu a produção de peróxido de hidrogênio pelas células mesangiais in vitro (Muñoz et al., 1997). A distribuição da ECA na superfície folicular dos oócitos e na zona pelúcida faz com que ela seja um dos componentes reguladores durante o desenvolvimento folicular e maturação oocitária (Brentjens et al., 1986). O uso de enalapril bloqueia a conversão de angiotensina I em Ang-II (Tavares et al., 2015), levando a uma diminuição da disponibilidade de Ang-II e aumento da disponibilidade de Ang-(1 -7) (Brosnihn ) e outros, 1999).
Após a obtenção dos dados para as variáveis MCI e número total de células, foi realizado o cálculo da proporção de MCI e TC (%) e posterior avaliação dos embriões que se encaixam nos extratos abaixo e > 40%, de MCI em relação ao TC (Kawamoto et al., 2019). Portanto, a ECA está presente nos mesmos locais de ação da Ang-II, aumentando a formação de Ang-II e alterando o desenvolvimento folicular e, consequentemente, a ovulação (Pan et al., 2013). Além disso, a Ang-(1-7) e seu receptor MAS atuam estimulando a esteroidogênese ovariana e modulando funções da fisiologia ovariana, tais como: desenvolvimento folicular, ovulação, atresia e maturação oocitária em ratas (Costa et al., 2003).
