Avaliação in vitro do mecanismo de ação citotóxica de lactonas sesquiterpênicas e outras substâncias isoladas de Vernonia scorpioides (Lam) Pers. Hirsutinolida (Fração 15), Hirsutinolida (S3) e Glaucolide (S2) (gráfico superior); mistura de lactonas, etil cafeína e poliacetileno (gráfico inferior) utilizando dimetilsulfóxido (DMSO) como controle negativo e metanossulfonato de metila (MMS) como controle positivo.
Objetivo Geral
Objetivos Específicos
O corante Brometo de Etídio (50 L solução 20 L/mL) e Anexina V-FITC (1 L solução 12 mg/mL) foram utilizados para verificar o mecanismo de morte celular. Dimetilsulfóxido (DMSO) foi utilizado para o controle negativo e Paclitaxel na concentração de 1 M foi utilizado para o controle positivo (KHALILZADEH et al., 2007). De acordo com Lee; Hwang e Lim (2004) em experimentos de citotoxicidade com poliacetilenos em células tumorais HT-29, houve um percentual de morte celular de 30% após 24 horas de exposição.
O composto apresentou baixa citotoxicidade em células L929 em 1 hora de exposição, com morte celular estatisticamente significativa (~20%) apenas para concentrações de 10 e 100 g/ml (Figura 25). Na concentração de 100 g/mL, conforme observado nas células L929, atingiu os níveis mais elevados de morte celular (~40%). A mistura de lactona apresentou uma porcentagem de 40% de morte celular na concentração de 10 g/mL para células Hela, indicando que esta fração era mais citotóxica para células Hela em comparação com células tumorais B16F10 (Figura 25).
Nas células tumorais B16F10, a citotoxicidade do cafeato de etila aumenta, tornando-se mais significativa na concentração de 48,0 M, resultando em aproximadamente 25% de morte celular. Numa exposição de 24 horas a uma concentração de 0,0243 M, aproximadamente 40% das células morreram. À medida que o tempo de exposição aumentou para 24 h, a percentagem de morte celular diminuiu (~5%) em todas as concentrações testadas, com a concentração de 0,0243 M permanecendo a mais tóxica.
Os resultados apresentados na Figura 30 sugerem morte celular por necrose, principalmente devido a misturas de hirsutinolídeo (S1), glaucolídeo (S2) e lactona. O aumento da caspase 3 nas células tumorais Hela e B16F10 sugere que o poliacetileno promove a morte celular por apoptose.
Produtos naturais com atividade antitumoral
Gênero Vernonia: Ocorrência e aspectos biológicos
O efeito antipirético do extrato, administrado na dose de 500 mg/kg, foi idêntico ao do medicamento padrão paracetamol. 2005) analisaram a atividade hipoglicemiante e antidiabética da fração acetona e da fração hexânica do V. Quanto ao potencial antidiabético, a fração acetona apresentou efeito anti-hiperglicêmico no teste oral de tolerância à glicose em ratos diabéticos.
Gênero Vernonia: Atividade antitumoral
Vários medicamentos antitumorais aumentam a expressão das enzimas catalíticas da fase 2 sem afetar as enzimas da fase 1, representadas principalmente pelo citocromo P450 (CYP). A expressão do citocromo P450 não foi afetada, mas houve indução na expressão de enzimas de fase 2, sugerindo potencial quimioterápico para o extrato.
Gênero Vernonia: Aspecto fitoquímico
Gênero Vernonia: Lactonas sesquiterpênicas e aspectos biológicos 25
Para testes in vivo, o câncer foi induzido por radiação ultravioleta B (UVB), onde camundongos pré-tratados com partenolídeo mostraram uma redução na incidência de papilomas em comparação com camundongos não tratados. Pagno (2004) demonstrou em camundongos que a fração diclorometano de V.scorpioides em doses de 5 mg/kg apresenta atividade antitumoral contra o tumor de Ehrlich, resultado posteriormente confirmado por Blind e Moya, que confirmaram a ocorrência de citotoxicidade por V.
Processo de morte celular
Lesão celular irreversível
A morte celular por necrose não é a via desejada para drogas antitumorais, pois não é um processo específico para células cancerígenas e também porque induz um intenso processo inflamatório (BURLACU et al., 2001). Células saudáveis migram para o local ocupado pela célula apoptótica sem aí haver processo inflamatório (ROBBINS; COTRAN, 2005).
Material Vegetal
Coleta
Obtenção de substâncias e mistura de Vernonia scorpioides
Foram coletadas 42 frações através do gradiente (1:1), das quais a fração 6 (2,77 mg) representou cristais e foi posteriormente identificada por RMN e EM. As frações (mg) foram reunidas porque tinham a mesma aparência química no CCD analítico e caráter cristalino posteriormente identificado por RMN e EM.
Identificação das substâncias puras e misturas de lactonas…
Cultura de células …
- Ensaio de Citotoxicidade (MTT)
- Formação de Lactato desidrogenase
- Análise da morte celular por microscopia de fluorescência
- Determinação da caspase-3 por ensaio colorimétrico
- Análise da fragmentação do DNA
- Ensaio do cometa
Para manter todas as células no mesmo estágio de divisão celular (Go), o meio MEM com SFB foi substituído por 180 L de meio MEM sem SFB e incubado por 1 hora a 37ºC em 5%. O brometo de etídio emite fluorescência vermelha quando associado ao DNA de células com membranas celulares alteradas.Esse corante não marca uma célula saudável, ou seja, indica morte celular por necrose. No caso de apoptose, a fosfatidilserina move-se para a membrana externa e, por sua vez, a anexina marcada com fluorocromo (FITC) liga-se à fosfatidilserina, emitindo um sinal de fluorescência. Ao utilizar a combinação desses dois corantes, podem ser identificados dois processos de morte celular: a) células em necrose, o núcleo fica marcado em vermelho devido à desnaturação das membranas plasmáticas, o que permite a internalização do brometo de etídio, bem como a liberação de fluorescência verde., porque com membranas desnaturadas a anexina também internaliza e se liga à fosfatidilserina; b) nas células em apoptose, a membrana celular ainda está intacta, mas a fosfatidilserina transloca-se para a parte externa da membrana plasmática.
As células foram analisadas utilizando um microscópio de fluorescência (sistema de fluorescência Olympus CKX41SF2, CKX41-RFA e sistema de aquisição de imagens Olympus Q-color3, da Olympus Optical Co. Ltd., e filtro de 480 e 520 nm) (NOBRE JUNIOR, 2006). As células foram tripsinizadas e centrifugadas a 1000xg a 4oC, as células foram lavadas duas vezes e centrifugadas novamente. A eletroforese foi realizada executando 15 L deste produto em gel de agarose 1,5% por 60 minutos (25 V e 300 mA), seguida de revelação com brometo de etídio e lâmpada UV, com imagem fotografada para documentação (CHOI et al., 2006) ).
As células foram retiradas e contadas em câmara de Neubauer com azul de tripano, com concentração da suspensão celular ajustada para 2,5.106 células/ml.
Análise estatística
Isolamento de substâncias
Identificação das substâncias isoladas e mistura de lactonas
- Poliacetileno (Fração 6)
- Hirsutinolídeo (Fração 15)
- Mistura de lactonas sesquiterpênicas (Fração 19-21)
- Cafeato de etila (Fração 17)
O seu espectro de RMN de 1H mostrou evidência de um composto principal contendo evidência de contaminação com algum triterpeno não identificado numa proporção de 5:1 por integração (Figuras 6 e 7). O último sinal relevante no espectro é um singleto de metila a 1,97 ppm, com carbono correspondente a 4,5 ppm, detectado no experimento HSQC. Seu espectro de RMN de 1H (Figura 14) mostrou sinais de um hirsutinolídeo característico de Vernonia comparando os sinais publicados anteriormente (Tabela 2).
Assim como outras lactonas deste tipo, a fração 15 apresentou apenas sinais amplos de RMN de 1H à temperatura ambiente, e os sinais e seus múltiplos foram determinados apenas a 0 oC (Figura 14). Seu espectro de RMN de 1H (Figuras 16 e 17) apresentou sinais característicos das lactonas de Vernonia apresentando sinais para 4 acetatos e sinais duplicados na região dos hidrogênios característicos ligados ao C-13 e para os metils 14 e 15, levando à presença de 2 lactonas em proporções quase iguais após a integração das áreas, suspeita-se que uma seja ligeiramente maioritária, denominada 19 maiores e as outras 19 menores (Figura 15). Um breve exame do espectro de RMN de 13C mostrou a presença de cerca de 30 carbonos, o que confirmou a suspeita de uma mistura de duas lactonas semelhantes.
Os dados espectrais destas substâncias estão sendo descritos pela primeira vez neste artigo. Os sinais de RMN de 1H e 13C, bem como as correlações de HSQC e HMBC das 3 substâncias são encontrados no Apêndice A (Figuras 7 a 15 e Tabelas 1 a 3).
Cultivo Celular
Avaliação da viabilidade celular
- Poliacetileno (Fração 6)
- Hirsutinolídeo (Fração 15)
- Mistura de lactonas sesquiterpênicas (Fração 19-21)
- Cafeato de etila (Fração 17)
- Hirsutinolídeo (S1)
- Glaucolideo (S2)
- Hirsutinolídeo (S3)
O poliacetileno não apresentou diferença significativa em relação ao grupo controle negativo na citotoxicidade nas células B16F10, resultado este seguido ao apresentado no L929 com exposição de 24 horas, ou seja, baixo efeito citotóxico que não ultrapassou 20% de morte celular. Quando a fração 15 foi deixada em contato com células L929 por 24 h, a resposta citotóxica foi semelhante, ou seja, produziu pouca morte celular (~20%) apesar da concentração de 0,0262 e 262 M ter sido estatisticamente diferente do controle grupo. Com o aumento do tempo de exposição para 24 h, o perfil de citotoxicidade permaneceu idêntico ao observado em 1 h, sendo as concentrações de 10 e 100 g/ml novamente as mais citotóxicas, com aprox. 20% de morte celular.
O glaucolide (S2) apresentou citotoxicidade significativa nas células L929 com exposição de 1 h em comparação ao controle negativo, sendo a concentração de 0,0243 M a mais citotóxica com 27% de morte celular. Essa mesma concentração foi a única que apresentou citotoxicidade significativa em células tumorais B16F10 com morte celular de aproximadamente 35%. Foi observado efeito citotóxico em todas as concentrações testadas, mas a concentração mais citotóxica foi de 2,43 M, com percentual de morte celular de ~42%.
2001) observaram a citotoxicidade da lactona sesquiterpênica na concentração de 100 M e 24 horas de exposição em células Hela, Jeg-3 e Cos-7, e em todas as linhagens celulares a morte celular foi estatisticamente significativa com inibição da viabilidade celular até 80 %.
Avaliação da morte celular: Necrose X Apoptose
- Quantificação de lactato desidrogenase
- Marcadores de morte celular Anexina V-FITC e Brometo de etídeo
- Fragmentação do DNA
Assim, a detecção de LDH pode ser um sinal de que o processo de morte celular se deve à necrose devido à sua liberação no meio extracelular. Esta experiência foi realizada com células L929 utilizando um tempo de exposição de 1 hora. As substâncias e concentrações testadas foram selecionadas com base em testes de citotoxicidade em células L929 com exposição de 1 hora, o que significa que apenas a concentração mais citotóxica de cada substância que apresentou certo grau de significância de morte celular foi selecionada.
Por ser um processo organizado com as vantagens acima mencionadas, a apoptose é o mecanismo preferido de morte celular. Devido aos resultados observados nos experimentos de quantificação de LDH e marcadores de morte celular, onde podem ser distinguidos dois processos de morte celular, necrose e apoptose, pode-se enfatizar que o poliacetileno e o hirsutinolídeo (S3) são as substâncias que representam os maiores níveis de apoptose , embora também represente necrose, nos dois tipos de células tumorais utilizados. Esses resultados, somados aos observados na determinação da presença de apoptose no processo de morte celular, sugerem que o poliacetileno como substância isolada de V. scorpioides é o mais adequado para estudos posteriores do mecanismo de ação antitumoral em células Hela.
A Figura 31 mostra a fragmentação do DNA de células expostas a poliacetileno, DMSO como controle negativo e Paclitaxel como controle positivo.
Genotoxicidade
No entanto, a realização de testes de genotoxicidade pode ajudar a esclarecer os danos ao DNA causados pelo poliacetileno. Pode-se observar que Hirsutinolide (S1) e Mistura de lactonas, respectivamente 90% e 80% dos cometas formados nos níveis 3 e 4 (nível máximo de genotoxicidade), ou seja, altos níveis de genotoxicidade. O cafeato de etila (Figura 32) foi a substância testada para apresentar cometas nos níveis mais baixos de genotoxicidade (1 e 2), 50% em cada um desses níveis.
Observe que o controle negativo obteve 65% de cometas formados no nível 0 (menor nível de genotoxicidade) (Figura 35), e o controle positivo (Figura 36) obteve 70% de cometas no nível 4 (Figura 32). A Figura 33 mostra que todas as substâncias apresentam ID estatisticamente significativa (p<0,001) em comparação ao grupo controle negativo. Apenas o cafeato de etila apresentou DI menor que as demais substâncias, com diferença significativa (p<0,01) em relação ao controle negativo.
Como resultado dos resultados de genotoxicidade, nota-se que todas as substâncias apresentam níveis de genotoxicidade estatisticamente significativos.
Quantificação da caspase 3
Vernonia scorpioides (Lam.) Pers.: Avaliação da atividade e efeito cicatrizante em feridas cutâneas em porquinhos-da-índia. Investigação da atividade antineoplásica de subfrações do extrato bruto de Vernonia scorpioides até isolamento de substância pura. Efeitos da aplicação tópica do extrato de Vernonia scorpioides em feridas excisionais em camundongos.
Estufa fitoquímica biomonitorada de frações de extrato de Vernonia scorpioides (Lam.) PERS., ASTERACEAE, no modelo antitumoral. Esta lactona foi originalmente encontrada em Vernonia scorpioides e Vernonia saltensis e é muito característica do gênero Vernonia.
