4.1.3 Identificação das substâncias
Os compostos isolados, e a mistura utilizada em testes biológicos foram submetidos a análises espectrométricas de massas (EM) em equipamento Micromass Q-Tof (Laboratório Thomson de espectrometria de massas, Unicamp) e Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de 1D e 2D nos equipamentos Bruker AVANCE 400 e AVANCE DRX 400 (Laboratórios de RMN da UFPR e UFSCar, respectivamente).
4.2.1 Ensaio de Citotoxicidade (MTT)
A citotoxicidade nas células foi determinada pelo teste MTT (3-[4,5- dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio brometo) (Sigma). O MTT (sal de tetrazólio) é convertido em sal de formazan pelas células vivas, formando uma coloração azulada (MOSMANN, 1983).
As células L929, B16F10 e Hela foram plaqueadas, em placas de 96 poços, a 2.104 células/poço e incubadas com 300 µL de meio MEM suplementado com soro fetal bovino a 10% (SFB) por 24h a 37ºC em 5% CO2. A fim de manter todas as células em um mesmo estágio da divisão celular (Go), o meio MEM com SFB foi substituído por 180 L de meio MEM sem SFB e incubado por 1h a 37ºC em 5%
CO2. Posteriormente foram adicionadas 20 L das substâncias testes em diferentes concentrações (0,01; 0,1; 1,00; 10; 100 e 1000 g/mL), do controle positivo dimetilsulfóxido (DMSO) e do controle negativo (meio MEM sem SFB contendo 1%
de acetona) e incubadas por 1 e 24h a 37ºC em 5% CO2. Após este tempo foi retirado o meio e adicionado 270 µL de MEM sem SFB e 30 µl de MTT (5 mg/mL) e incubadas por 4h a 37ºC em 5% CO2. O meio juntamente com o MTT foi retirado e os cristais de formazan insolúveis foram dissolvidos em 100 µL de DMSO. A determinação da absorbância foi realizada em leitor de microplaca a 570 nm. Os testes foram realizados em quadruplicata. A viabilidade relativa das células relacionadas ao controle sem as substâncias testes foi calculada como absorbância da amostra teste/absorbância do controle negativo x 100. Através dos gráficos pode ser calculada a CI50 das substâncias testes.
4.2.2 Formação de Lactato desidrogenase (LDH)
As células L929 foram plaqueadas a 5.105 células/poço em placas de 6 poços e mantidas por 1 hora a 37ºC em 5% CO2. Foram adicionados 10 L das substâncias teste, do controle positivo (Triton X-100 0,8%) e do controle negativo (meio MEM sem SFB a 1% de acetona) e incubadas por 24h 37ºC em 5% CO2 nas concentrações pré-determinadas pelo teste de citotoxicidade (MTT). A determinação
da LDH é proporcional ao número de células lisadas por processo necrótico sendo mensurada pelo Kit LDH (DiaSys). Valores de absorbância foram medidos a 37oC, em leitor de microplaca. Os resultados foram realizados em triplicata e os resultados expressos pela A/min x 2000 (UI) conforme descrito pelo Kit (CRUZ-CHAMORRO et al., 2006; DIASYS, 2006).
4.2.3 Análise da morte celular por microscopia de fluorescência
Para este teste as células L929, B16F10 e Hela (2.104 células por poço em placas de 96 poços) foram incubadas em presença das substâncias teste, do controle positivo (DMSO) e do controle negativo (meio MEM sem SFB a 1% de acetona) por 24 h a 37ºC a 5% de CO2 em placas de 96 poços. O corante Brometo de etídeo (50 L de solução a 20 L/mL) e Anexina V-FITC (1 L de solução a 12 mg/mL) foram utilizados para verificar o mecanismo de morte celular. O Brometo de etídeo emite fluorescência vermelha por associação ao DNA das células com membrana celular alterada, este corante não marca célula saudável, ou seja, sugere a morte celular por necrose. Em caso de apoptose a fosfatidilserina desloca-se para membrana externa e, por sua vez, a anexina marcada com fluorocromo (FITC), liga- se a fosfatidilserina emitindo sinal de fluorescência.
Usando a combinação destes dois corantes, dois processos de morte celular podem ser identificados: a) células em necrose o núcleo fica marcado em vermelho por causa da desnaturação das membranas plasmáticas que permite a internalização do brometo de etídeo, assim como ocorre emissão de fluorescência verde, pois com as membranas desnaturadas a Anexina também internaliza e liga-se a fosfatidilserina; b) nas células em apoptose a membrana celular ainda está íntegra, mas a fosfatidilserina transloca-se para a parte externa da membrana plasmática. A Anexina V liga-se as mesmas emitindo fluorescência de coloração verde. Como o brometo de etídeo não internaliza, visualiza-se somente a fluorescência verde.
Foram avaliados dez campos microscópicos diferentes, classificados por presença de necrose superior a 75% das células do campo (+++), necrose entre 75% e 25%
das células (++) e necrose inferior a 25% das células (+).
As células foram analisadas usando microscópio de fluorescência (Olympus CKX41SF2, sistema de fluorescência CKX41-RFA e Sistema Olympus Q-color3 de
aquisição de imagens, da Olympus Optical Co. Ltd., e filtro de 480 e 520 nm) (NOBRE JUNIOR, 2006).
4.2.4 Determinação da caspase-3 por ensaio colorimétrico
As células tumorais B16F10 e Hela foram plaqueadas, em placas de 6 poços, a 5.105 células/poço. Foram mantidas por 24 horas na presença das substâncias testes. Para o controle negativo foi utilizado dimetilsulfóxido (DMSO) e para o controle positivo Paclitaxel na concentração de 1 M (KHALILZADEH et al, 2007). As células foram tripsinizadas e centrifugadas a 1000xg a 4oC, seguido de duas etapas de lavagem. O centrifugado formado foi ressuspendido em 100 L de tampão de lise (5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM DTT e 1% Triton X- 100) e incubado em banho de gelo por 20 minutos. Após centrifugação a 5000xg por 30 minutos a 4oC, o sobrenadante corresponde ao lisado. A presença de caspase 3 no lisado produz a p-nitroanilina (pNa) que gera coloração, quantificado em 405 nm.
Em placa de 96 poços foram colocados em cada poço 84 L de tampão de ensaio (100 mM Hepes, 1 mM EDTA, 10 mM DTT e 10% Glicerol), 10 L do reagente de uso (substrato de caspase 3 a 2 mM) e 5 L do lisado.
Os testes foram realizados em octaplicata e os resultados expressos em M pNa/min/mL (POSMANTUR; WANG; GILBERTSEN, 1998).
4.2.5 Análise da fragmentação do DNA
As células tumorais Hela foram plaqueadas, em placas de 6 poços, a 5.105 células/poço. Foram mantidas por 24 horas na presença das substâncias testes.
Para o controle negativo foi utilizado dimetilsulfóxido (DMSO) e para o controle positivo Paclitaxel na concentração de 1 M (KHALILZADEH et al., 2007). As células foram tripsinizadas e centrifugadas a 1000xg a 4oC, as células foram lavadas duas vezes e centrifugadas novamente. O centrifugado formado foi ressuspendido com 250 L de tampão de lise (0,5% SDS, 10 mM Tris, 1 mM EDTA e 100 g/mL de
proteinase K, pH 8.0) e incubado por uma noite a 4oC. Posteriormente foi centrifugado a 5000xg por 20 minutos. O sobrenadante foi removido para frascos novos, adicionado isopropanol (1:1) e ajustado para 0,5 M NaCl, deixado precipitar durante uma noite a 4oC. O precipitado formado foi removido e lavado duas vezes com etanol 70%. O etanol 70% foi deixado evaporar e o precipitado foi ressuspendido em 40 L de tampão TE (10 mM Tris, 0,1 mM EDTA e 20 g/mL RNAse, pH 8.8). A eletroforese realizada com aplicação de 15 L deste produto em agarose gel 1,5% por 60 minutos (25 V e 300 mA), seguido de revelação com brometo de etídeo e lâmpada de UV, com imagem fotografada para documentação (CHOI et al., 2006).
4.2.6 Ensaio do Cometa
No ensaio de genotoxicidade foram utilizadas células de medula de camundongos Swiss, projeto aprovado pela Comissão de Ética em Pesquisa da UNIVALI sob protocolo número 236/07.
As células foram retiradas e contadas em câmara de Neubauer com azul de tripan, com concentração da suspensão celular ajustada em 2,5.106 cél/mL. Lâminas foscas de microscópio receberam 100 L de agarose gel 0,6% distribuídos por esfregaço e armazenadas a 4oC por 15 minutos. Foi adicionado 20 L da suspensão celular em 90 L de agarose gel com baixo ponto de fusão (0,6%) a 37oC. Após a mistura, os 110 L foram gotejados nas lâminas com agarose gel 0,6%
e cobertos com uma lamínula. As lâminas foram mantidas a 4oC durante 15 minutos.
Após esta incubação as lamínulas foram retiradas e as lâminas foram tratadas com 100 L de substâncias testes, com dimetilsulfóxido (DMSO) para controle negativo e metilmetanosulfonato (MMS) a 40 mM como controle positivo. As lâminas foram incubadas por 24 horas a 37oC, seguido de resfriamento a 4oC e duas etapas de lavagem. As lâminas foram mergulhadas em tampão de lise (2,5 mM NaCl, 100 mM Tris, 100 mM EDTA, 1% N-lauril sarcosinato, 1% Triton X-100 e 10% DMSO, pH 10.0) a 4oC por 1 hora. Após a lise as lâminas foram acomodadas em tampão de corrida (1 mM EDTA e 300 mM NaOH) por 30 minutos e submetidas a eletroforese a 300mA, 25 V por 30 minutos. Após a eletroforese as lâminas foram neutralizadas através de lavagem com tampão de neutralização (0,4 M Tris). As lâminas foram
coradas com 50 L de brometo de etídeo (20 g/mL) e foi realizada visualização em microscópio de fluorescência em comprimento de onda 510-569 nm de excitação e filtro de barreira de 590 nm (CAVALCANTI et al., 2006) (Olympus CKX41SF2, sistema de fluorescência CKX41-RFA e Sistema Olympus Q-color3 de aquisição de imagens, da Olympus Optical Co. Ltd). Foram observados 20 cometas e calculado pelo índice de dano (ID) pela somatória dói níveis de dano: (Nível 0 x 0) + (Nível 1 x 1) + (Nível 2 x 2) + (Nível 3 x 3) + (Nível 4 x 4)