5.3 Cultivo Celular
5.3.4 Quantificação da caspase 3
Figura 38: Quantificação da p-nitro anilina (pNa) formada nas células tumorais Hela em presença do Poliacetileno (Fração 6) isolado de V. scorpioides, utilizando dimetilsulfóxido (DMSO) para controle negativo e Paclitaxel como controle positivo com tempo de exposição de 24 horas. As barras são expressas pela média ± desvio padrão. **p<0,01 ANOVA seguido de TUKEY.
O aumento de caspase 3 nas células tumorais Hela e B16F10, sugerem que o Poliacetileno promove morte celular por apoptose. No entanto, esta via de morte celular não é exclusivamente apoptótica, pode ser observado nos experimentos realizados anteriormente a presença do processo necrótico.
Os resultados de quantificação estão de acordo com os obtidos por Choi et al. (2006), onde foram quantificadas as caspases 3 e 9 na presença de um poliacetileno nas concentrações de 5 e 10 M por 24 horas. O método de quantificação das caspases foi semelhante ao aqui utilizado, ou seja, quantificação da p-nitroanilina (p-Na). O poliacetileno na concentração de 5 M obteve pequeno aumento na caspase 3, sendo semelhante aos aqui obtidos com 1 M, mas na concentração de 10 M a atividade de caspase 3 se torna duas vezes mais potente comparada a concentração inferior, sugerindo resposta dose dependente.
As caspases pertencem à família de proteases cisteínas, podendo ser divididas em caspases inflamatórias e caspases apoptóticas, as quais podem ser incluídas nos grupos de caspases iniciadoras e efetoras. Caspases são os sensores centrais e executores da apoptose celular (THOME; TSCHOPP, 2001).
DMSO Poliacetileno Paclitaxel 0
10 20 30
40 1µM
1µM
**
µµµµmol pNa/min/mL
A apoptose pode ser iniciada por dois caminhos: O primeiro, também chamado de caminho extrínseco, é mediado pelos receptores de morte, como Fas (TNF). Adaptadores específicos de proteínas como FADD/MORT1; TRADD ou CRADD/RAIDD ligam-se aos receptores específicos formando um complexo que por sua vez ativa os iniciadores de apoptose como as caspases iniciadoras 2, 8 ou 10 as quais ativam as caspases efetoras (3, 6 e 7) induzindo a ativação cascata apoptótica (ROBBINS; COTRAN, 2005).
No segundo caminho, intrínseco, citocromos “c” são liberados pelas mitocôndrias para o citoplasma em células expostas a drogas quimioterapêuticas, a irradiações UV, fatores de crescimento ou ativação dos receptores Fas ou TNF. O citocromo “c” liberado liga-se ao Apaf-1, promovendo a oligomerização do complexo citocromo/APAF formando o apoptossomo. O recrutamento de procaspase-9 pelos apoptossomos ativos resultam na autoativação e subseqüentemente na ativação das caspases-3 efetora (ZHANG; HUANG, 2006).
A ativação das mitocôndrias para a liberação dos citocromos “c” pode ser feita também via receptores de morte que induzem a ativação de caspases iniciadoras (pro-caspase-8) levando a clivagem da proteína Bid. Os fragmentos resultantes da clivagem de Bid são translocados do citosol até as mitocôndrias, resultando na ruptura destas e liberação dos citocromos “c”. Além do citocromo “c”
outros fatores proapoptóticos como o AIF e Smac (DIABLO) estão envolvidos na ativação do sinal apoptótico. Outra proteína chamada HtrA2/Omi é liberada pela mitocôndria durante a apoptose. No citosol a proteína bloqueia a ação do inibidor de apoptose IAPs, levando o aumento da ativação das caspases (SALVESEN;
DUCKETT, 2002).
6 CONCLUSÕES
Através do processo extrativo foi isolado e caracterizados uma lactona sesquiterpênica do tipo hirsutinolídeo (Fração 15), um éster do ácido cafeico (cafeato de etila (Fração 17), um poliacetileno (Fração 6) além de uma mistura de lactonas sesquiterpênicas contendo um hirsutinolídeo e um glaucolídeo. Dentre as substâncias isoladas, o poliacetileno é inédito na literatura.
As lactonas sesquiterpênicas isoladas e em mistura, apresentaram níveis significativos de citotoxicidade para todos as linhagens celulares, tendo de modo geral maior afinidade para as células de adenocarcinoma de cérvix (Hela). O Cafeato de etila foi a substância isolada que apresentou índices baixos de citotoxicidade tanto para as células L929 quanto para as células tumorais B16F10 e Hela. O poliacetileno também demonstrou maior especificidade pelas células tumorais Hela com uma inibição de ~40% da viabilidade celular, sendo que nas células tumorais B16F10 e não tumorais L929 em 24 horas a diminuição da viabilidade celular foi de
~20%.
O processo necrótico, juntamente com a apoptose, foi evidenciado em todas as substâncias testadas. Entretanto ficou evidenciado que o poliacetileno apresentou maiores indícios de apoptose, apesar de não ser exclusivo. Em experimento com marcadores de morte celular, essa substância obteve índices de necrose menores que 25% nas três linhagens celulares utilizadas. Ainda foi confirmada a ocorrência de processo apoptótico pela baixa liberação de LDH (~600 UI). A indução da caspases 3 pelo poliacetileno foi observada nas células tumorais B16F10 e Hela, mesmo quando utilizada em baixa concentração (1 M). A fragmentação do DNA de células Hela em contato com o poliacetileno não formou banda específica de apoptose, o que pode ser devido ao potencial genotóxico demonstrado no ensaio do cometa. Todas as substâncias isoladas, assim como a mistura de lactonas sesquiterpênicas, apresentaram níveis estatisticamente significativos de genotoxicidade.
Considerando os promissores resultados obtidos com o poliacetileno, a continuidade dos estudos com a pesquisa de citocromo "c", proteínas como a Bcl-2, Bax, assim como caspases iniciais (8 e 9), possibilitarão o desvendamento da via apoptótica, intrínseca ou extrínseca, envolvidas no processo de morte celular.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS
ADRAIN, C.; MARTIN, S. The mitochondrial apoptosome: a killer unleashed by the cytochrome seas. Trends in biochemical sciences v.26, p.390-397, 2001.
ALBERTON, B. E. Análise fitoquímica e avaliação da toxicidade de Vernonia scorpioides (Lam.) Pers. Monografia (Graduação em Farmácia). Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, 2002.
ALMEIDA, S.; PALHANO, G. C. Vernonia scorpioides (Lam.) Pers.: Avaliação da atividade e efeito cicatrizante em feridas na pele de cobaias. Monografia
(Graduação em Farmácia). Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, 2001.
ANKARCRONA, M.; DYPBUKT, J. M.; BONFOCO, E.; ZHIVOTOVSKY, B.;
ORRENIUS, S.; LIPTON, S. A.; NICOTERA, P. Glutamate-induced neuronal death: a succession of necrosis or apoptosis depending on mitochondrial function. Neuron.
v.15, p.961-973, 1995.
BABALOLA, O. O.; ANETOR, J. I.; ADENIYI, F. A. Amelioration of carbon
tetrachloride-induced hepatotoxicity by terpenoid extract from leaves of Vernonia amygdalina. The African journal of medical sciences. v.30, p.91-93, 2001.
BAZON, J. N.; LOPES, J. L. C.; VICHNEWSKI, W.; DIAS, D. A.; NAGAMITI, K.;
CUNHA, W. R.; HERZ, W. Cardinolides and other constituents from Vernonia fruticulosa and Vernonanthura discolor. Phytochemistry. v.44, p.1535-1536, 1997.
BIOAGENCY. Apoptose e inflamação. Bioagency, 2006. Disponível em
<www.bioagency.com.br>. Acesso em: 16. Fev, 2006.
BLANCO, J.; GIL, R. R.; BOCCO, J. L.; MERAGELMAN, T. L.; GENTI-RAIMONDI, S.; FLURY, A. Aromatese inhibition by an 11, 13-dihydroderivative of a sesquiterpene lactone. The Journal of Pharmacology and experimental therapeutics. v.297, p.1099-1105, 2001.
BLIND, L. Z.; MOYA, R. F. P. Estudo da atividade antineoplásica das sub- frações do extrato bruto de Vernonia scorpioides até o isolamento de uma substância pura. 2005. Monografia (Graduação em Farmácia). Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, 2005.
BOCCA, C.; GABRIEL, L.; BOZZO, F.; MIGLIETTA, A. A sesquiterpene lactone, costunolide, interacts with microtubule protein and inhibits the growth of MCF-7 cells.
Chemico-biological interactions. v.147, n.1, p.19-86, 2004.
BORKOSKY, S.; VALDES, D. A.; BARDON, A.; DIAZ, J. G.; HERZ, W.
Sesquiterpene lactones and other constituents of Eirmocephala megaphylla and Cyrtocymura cincta. Phytochemistry. v.42, p.1637-1639, 1996.
BORTNER, C. D.; CIDLOWSKI, J. A. Cellular machanisms for the repression of apoptosis. Annual review of pharmacology and toxicology. v.42, p.259-281, 2002.
BRASIL. Ministério da Saúde. Instituto Nacional de Câncer. Coordenação de
programas de controle de Câncer - PRO-ONCO. O Problema do Câncer no Brasil.
4ª ed. Rio de Janeiro: [S.N], 2000.
BURLACU, A.; JINGA, V.; GAFENCU, A. V.; SIMIONESCU, M. Severity of oxidative stress generates different mechanisms of endothelial cell death. Cell and tissue research. v.306, p.409-416, 2001.
CAMPOS, M. P. Avaliação da atividade antifúngica e antibacteriana de extratos e frações de Vernonia scorpioides (Lam.) Pers. Monografia (Graduação em Farmácia). Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, 2001.
CATALAN, C. A. N.; IGLESIAS, L. A.. Sesquiterpene lactones and others
constituentes of Vernonia mollissima and Vernonia squamulosa. Journal of Natural Products. v.49, p.351-353, 1986.
CAVALCANTI, B. C.; COSTA-LOTUFO, L. V.; MORAES, M. O.; BURBANO, R. R.;
SILVEIRA, E. R.; CUNHA, K. M. A.; RAO, V. S. N.; MOURA, D. J.; ROSA, R. M.;
HENRIQUES, J. A. P.; PESSOA, C. Genotoxicity evaluation of kaurenoic acid, a bioactive diterpenoid present in Copaíba oil. Food and Chemical Toxicology. v.44, p.388-392, 2006.
CHEN, X.; ZHAN, Z. J.; ZHANG, X. W.; DING, J.; YUE, J. M. Sesquiterpene lactones with potent cytotoxic activities from Vernonia chinensis. Planta Médica. v.71, n.10, p.949-954, 2005.
CHEN, C-N.; HUANG, H-H.; WU, C-L.; LIN, C. P. C.; HSU, J. T. A.; HSIEH, H-P.;
CHUANG, S-E; LAI,G-M. Isocostunolide, a sesquiterpene lactone, induces
mitochondrial membrane depolarization and caspase-dependent apoptosis in human melanoma cells. Cancer Letters. v.246, p.237-252, 2007.
CHOI, H. J.; YEE, S-B.; PARK, S. E.; IM, E.; JUNG, J. H.; CHUNG, H. Y.; CHOI, Y.
H.; KIM, N. D. Petrotetrayndiol A induces cell cycle arrest and apoptosis in SK-MEL-2 human melanoma cells through cytochrome c-mediated activation of caspases.
Cancer Letters. v.232, p.214-225, 2006.
CIOFFI, G.; SANOGO, R.; DIALLO, D.; ROMUSSI, G.; DE TOMMASI, N. New compounds from an extract of Vernonia scorpioides (LAM.) Pers. Microbiology.
v.27, p.1-6, 2004a.
CIOFFI, G.; SANOGO, R.; DIALLO, D.; ROMUSSI, G.; DE TOMMASI, N. New compounds from an extract of Vernonia colorata leaves with anti-inflammatory activity. Journal of natural products. v.67, n.3, p.389-394, 2004b.
CLARKE, P. G. H. Developmental cell death: morphological diversity and multiple mechanisms. Anatomy and Embryology. v.181, p.195-213, 1990.
COHEN, G. M. Caspases: the executioners of apoptosis. The Biochemical journal.
v.326, p.1-16, 1997.
COLLINS, A,; DUSINSKA, M.; FRANKLIN, M.; SOMOROVSKA, M.; PETROVSKA, H.; DUTHIE, S.; FILLION, L.; PANAYIOTIDIS, M.; RASLOVA, K.; VAUGHAN, N.
Comet assay in human biomonitoring studies: reliability, validation, and applications.
Environmental and Molecular Mutagenesis. v.30, p.139-146, 1997.
CORREA, M. P. Dicionário das plantas úteis do Brasil e das exóticas cultivadas. Rio de Janeiro: Imprensa Nacional, 1978.
CRUZ-CHAMORRO, L.; PUERTOLLANO, M. A.; PUERTOLLANO, E.; DE CIENFUEGOS, G. A.; DE PABLO, M. A. In vitro biological activities of magainin alone or in combination with nisin. Peptides. v.27, p.1201-1209, 2006.
DALAZEN, P.; MOLON, A. Estudo morfológico experimental da influência da Vernonia scorpioides na resposta cutânea em camundongos. 2002. Monografia (Graduação) – Curso de Farmácia, Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, 2003 DALAZEN, P.; MOLON, A.; BIAVATTI, M. W.; KREUGER, M. R. O. Effects of the topical application of the extract on Vernonia scorpioides on excisional wounds in mice. Brazilian Journal of Pharmacognosy. v.15, p.82-87, 2005.
DIASYS. Diagnostic reagent for quantitative in vitro determination of lactate
dehydrogenase (LDH) in serum or plasma on photometric systems. DiaSys. 2006.
ELDIN, S.; DUNFORD, A. Fitoterapia na atenção primária à saúde. São Paulo : Manole, 2001.
ENIKUOMEHIN, O. A.; IKOTUN, T.; EKPO, E. J. Evalution on ash from some tropical plants of Nigeria for the control os Sclerotium rolfsii Sacc. on wheat (Triticum
aestivum L.). Mycopathologia. v.142, n.2, p.81-87, 1998.
FREIRE, M. F. I.; ABREU, H. S.; CRUZ, L. C. H.; FREIRE, R. B. Inhibition of fungal growth by extracts of Vernonia scorpioides (LAM.) Pers. Revista de Microbiologia.
v.27, n.1, p.1-6, 1996.
GALLIN, J. L.; SNYDERMAN, R. Inflammation. 3ª ed. New York: Lippincott Williams
& Wilkins, 1999.
GRAMBONE-GUARATINI, M. T.; SILVA-BRANDAO, K. L.; SOLFERINI, V. N.;
SEMIR, J.; TRIGO, J. R. Sesquiterpene and polyacetylene profile of the Bidens pilosa complex (Asteraceae: Heliantheae) from Southeast of Brazil. Biochemical Systematics and Ecology. v.3, p.479-486, 2005.
GUILLET, G.; PHILOGENE, B. J. R.; O'MERA, J.; DURST, T.; ARNASON, J. T.
Multiple modes of insecticidal action of three classes of polyacetylenes derivatives from Rudbeckia hirta. Phytochemistry. v.46, p.495-498, 1997.
GUPTA, M.; MAZUMDER, U. K.; MANIKANDAN, L.; HALDAR, P. K.;
BHATTACHARYA, S.; KANDAR, C. C. Antibacterial activity of Vernonia cinerea.
Fitoterapia. v.74, p.148-150, 2003a.
GUPTA, M.; MAZUMDER, U. K.; MANIKANDAN, L.; HALDAR, P. K.;
BHATTACHARYA, S.; ROY, S. Evalution of antipyretic potential of Vernonia cinerea extract in rats. Phytotherapy research. v.17, n.7, p.804-806, 2003b.
HARBORME, J.; BAXTER, H. Phytochemical Dictionary. London: Taylor & Francis, 1993.
HEINRICH, M.; BARNES, J.; GIBBONS, S.; WILLIAMSON, E. M. Fundamentals of Pharmacognosy and Phytotherapy. UK: Churchil Livingstone, 2004.
HENTY, P. H.; LONGO, D. L.; BRAUNWALD, E.; FAUCI, A. S.; KAPSER, D. L.;
LONGO, D. L.; JAMESON, J. L. Harrison’s – principles of internal medicine. 15ª ed. Rio de Janeiro: McGraw Hill Companies, 2001.
HILMI, F.; GERTSCH, J.; BREMNER, P.; VALOVIC, S.; HEINRICH, M.; STICHER, O.; HEILMANN, J. Cytotoxic versus Anti-inflammatory effects in Hela, Jurkat T and Human peripheral blood cells caused by guaianolide-type sesquiterpenes lactones.
Bioorganic & Medicinal Chemistry. v.11, p.3659-3663, 2003.
HÖBOLD, W.; RADEGLIA, R.; KLOSE, D. Inkrementen-Berechnung von 13C- chemischen Verschiebungen in n-Alkinen. Journal für Praktische Chemie. v.318, p.519-522, 1976.
HOWARD, C. B.; STEVENS, J.; IZEVBIGIE, E. B.; WALKER, A.; McDANIEL, O.
Time and dose-dependent modulation of phase 1 and phase 2 gene expression in response to treatment of MCF-7 cells with a natural anti-cancer agent. Cellular and molecular biology. v.49, n.7, p.1057-1065, 2003.
HUANG, Y.; DING, Z. H.; LIU, J. K. A new highly oxygenated flavone from Vernonia saligna. Z. Naturforsch. v.58, p.347-350, 2003.
HWANG, D. R.; WU, Y. S.; CHANG, C. W.; LIEN, T. W.; CHEN. W. C.; TAN, U. K.;
HSU, J. T. HSIEH, H. P. Synthesis and anti-viral activity of a series os
sesquiterpenes lactones and analogues in the subgenomic HCV replicon system.
Bioorganic & medicinal chemistry. v.14, n.1, p.83-91, 2006.
IWALEWA, E. O.; ADEWUNMI, C. O.; OMISORE, N. O.; ADEBANJI, O. A.; AZIKE, C. K.; ADIGUN, A. O.; ADESINA, O. A.; OLOWOYO, O. G. Pro- and antioxidant effects and cytoprotective potentials of nine edible vegetables in southwest Nigeria.
Journal of medicinal food. v.8, n.4, p.539-544, 2005.
IZEVBIGIE, E. B.;BRYANT, J. L.; WALKER, A. A novel natural inhibitor of extracellular signal-regulates kinases and human breast cancer cell growt.
Experimental Biology and Medicine. v.229, p.163-169, 2004.
JAKUPOVIC, J.; SCHMEDA-HIRSCHAMANN, G.; SCHUSTER, A.; ZDERO, C.;
BOHLMANN, F.; KING, R. M.; ROBINSON, H.; PICKARDT, J. Hirsutinolides, glaucolides and sesquiterpene lactone from Vernonia species. Phytochemistry.
v.25, p.145-158, 1985.
JOLY, A. B. Botânica: Introdução à taxonomia vegetal. 12ª ed. São Paulo:
Câmara Brasileira do Livro, 1998.
KHALILZADEH, A.; WANGOO, K. T.; MORRIS, D. L.; POURGHOLAMI, M. H.
Epothilone-paclitaxel resistant leukemic cells CEM/dEpoB300 are sensitive to
albendazole: Involvement of apoptotic pathways. Biochemical Pharmacology. v.74, p.407-414, 2007.
KIM, J. H.; LIU, L.; LEE, S. O.; KIM, Y. T.; YOU, K. R.; KIM, D. G.; Susceptibility of cholangiocarcinoma cells to parthenolide-induced apoptosis. Cancer research. v.65, n.14, p.6312-6320, 2005.
KONISH, T.; SHIMADA, Y.; NAGAO, T.; OKABE, H.; KONOSHIMA, T.
Antiproliferative sesquiterpene lactones from the roots os Inula helenium. Biological
& Pharmaceutical Bulletin. v.25, p.1370-1372, 2002.
KOS, O.; CASTRO, V.; MURILLO, R.; POVEDA, L.; MERFORT, I. Ent-kaurane glycosides and sesquiteroene lactones of the hirsutinolide type from Vernonia triflosculosa. Phytochemistry. v.67, p.62-69, 2006.
KOUL, J. L.; KOUL, S.; SINGH, C.; TANEJA, S. C.; SHANMUGAVEL, M.; KAMPASI, H.; SAXENA, A. K.; QAZI, G. N. In vitro cytotoxic elemanolides from Vernonia
lasiopus. Planta Médica. v.69, p.164-166, 2003.
KRISHNA-KUMARI, G. N.; MASILAMAMI, S. GANASH, M. R.; ARAVIND, S.;
SRIDHAR, S. R. Zaluzanin D: a fungistatic sesquiterpene from Vernonia arbórea.
Fitoterapia. v.74, p.164-166, 2003.
KUO, Y. H.; KUO. Y. J.; YU, A. S.; WU, M. D.; ONG, C. W.; YANG, K. L. M.; HUANG, J. T.; CHEN, C. F.; LI, S. Y. Two novel sesquiterpene lactones, cytotoxic vernolide-A and –B, from Vernonia cinerea. Chemical & pharmaceutical bulletin. v.51, p.425- 426, 2003.
LAZZAROTO, F. Estufo fitoquímico biomonitorado das frações do extrato de Vernonia scorpioides (Lam.) PERS., ASTERACEAE, no modelo antitumoral.
Monografia. (Graduação em Farmácia). Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, 2006.
LEE, J-Y.; HWANG, W-I.; LIM, S-T. Antioxidant and anticancer activities of organic extracts from Playcodon grandiflorum A. De Candolle roots. Journal of
Ethnopharmacology. v.93, p.409-415, 2004.
LEIST, M.; SINGLE, B.; CASTOLDI, A. F.; KUHNLE, S.; NICOTERA, P. Intracellular adenosine triphosphate (ATP) concentration: a switch in the decision between apoptosis and necrosis. The Journal of experimental medicine. v.185, p.1484- 1486, 1997.
LI, L. Y.; LUO, X.; WANG, X. Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondrial. Nature. v.412, 95-99, 2001.
MANTLE, D; LENNARD, T. W. J.; PICKERING, A. T. Therapeutic applications of medicinal plants in the treatment of breast cancer: a review of their pharmacology, efficacy and tolerability. Adverse drug reactions and toxicological reviews. v.19, p.223-240, 2000.
McCARTHY, N. J.; EVAN, G. I. Methods for detecting and quantifying apoptosis.
Current topics in developmental biology. v.36, p.269-265, 1998.
McCONKEY, D. J. Biochemical determinants of apoptosis and necrosis. Toxicology Letters. v.99, p.157-168, 1998.
MONTEIRO, M. H. D.; GOMES-CARNEIRO, M. R.; FELZENSZWALB, I.;
CHAHOUD, I.; PAUMGARTTEN, F. J. R. Toxicological evalution of a tea from leaves of Vernonia condensate. Journal of Ethnopharmacology. v.74, p.149-157, 2001.
MOSMANN, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to ploriferation and cytotoxicity assay. Journal of Immunological Methods. v.65, p.55-63, 1983.
MULLER, N.; PRITCHARD, D. E. C13 splittings in proton magnetic resonance spectra Hydrocarbons. Journal of Chemical Physics. v.31, p.768-771, 1959a.
MULLER, N.; PRITCHARD, D. E. C13 splittings in proton magnetic resonance spectra. II. Bonding in substituted methanes. Journal of Chemical Physics. v.31, p.1471-1476, 1959b.
NERGARD, C. S.; DIALLO, D.; MICHAELSEN, T. E.; MALTERUD, K. E.;
KIYOHARA, H.; MATSUMOTO, T.; YAMADA, H.; PAULSEN, B. S. Isolation, partial characterization and immunomodulation activitics of polysaccharides from Vernonia kotschyana Sch. Bip. ex Walp. Journal Ethnopharmacology. v.91, p.141-152, 2004.
NERGARD, C. S.; MATSUMOTO, T.; INNGJERDINGEN, M.; INNGJERDINGEN, K.;
HOKPUTSA, S.; HARDING, S. E.; MICHAELSEN, T. E.; DIALLO, D.; KIYOHARA, H.; PAULSEN, B. S.; YAMADA, H. Structural and immunological studies of a pectin and a pectic arabinogalactan from Vernonia kotshyana Sch. Bip. Ex Walp.
(Asteraceae). Carbohydrate research. v.340, n.1, p.115-130, 2005a.
NERGARD, C. S.; KIYOHARA, H.; REYNOLDS, J. C.; THOMAS-OATES, J. E.;
MATSUMOTO, T.; YAMADA, H.; MICHAELSEN, T. E.; DIALLO, D.; PAULSEN, B. S.
Structure-immunomodulating activity relationships of a pectic arabinogalactan from Vernonia kotshyana Sch. Bip. Ex Walp. Carbohydrate research. v.340, n.11, p.1789-1801, 2005b.
NEVIN, K. G.; VIJAYAMMAL, P. L. Effect of Aerva lanata on solid tumor induced by DLA cells in mice. Fitoterapia v.74, n.6, p.577-581, 2003.
NEWMAN, D. J.; CRAGG, G. M. Natural Products as sources of new drugs over the last 25 years. Journal Natural Products. v.70, p.461-477, 2007.
NIERO, R.; MALHEIROS, A.; BITTENCOURT, C. M. S.; BIAVATTI, M. W.; LEITE, S.
N.; CECHINEL-FILHO, V. IN: BRESOLIN, T. M. B.; CECHINEL-FILHO, V. Ciencias Farmacéuticas: Contribuição ao Desenvolvimento de Novos Fármacos e Medicamentos. Itajaí: UNIVALI, 2003. p.11-56.
NOBRE JUNIOR, H. V.; CUNHA, G. M. A.; MORAES, M. O.; LUCIANA, M. F. D.;
OLIVEIRA, R. A.; MAIA, F. D.; NOGUEIRA, M. A. S.; LEMOS, T. L. G.;RAO, V. S.
Quebrachitol (2-O-methyl-L-inositol) attenuates 6-hydroxydopamine-induced
cytotoxicity in rat fetal mesencephalic cell cultures. Food and Chemical Toxicology.
Article in press, 2006.
OHNO, T.; NAGATSU, A.; NAKAGAWA, M.; INOUE, M.; LI, Y-M.; MINATOGUCHI, S.; MIZUKAMI, H.; FUJIWARA, H. New sesquiterpene lactones from water extract of the root of Lindera strychnifolia with cytotoxicity against the human small cell lung cancer cell, SBC-3. Tatrahedrom Letters. v.46, p.8657-8660, 2005.
OLIVEIRA, A.B.; BRAGA, F. C. Produtos naturais bioativos de plantas brasileiras e sua contribuição para o desenvolvimento da química medicinal. Arquivos
Brasileiros de Fitoquímica Científica. v.1, p.49-58, 2003.
PAGNO, T. Estudos da atividade antineoplásica da fração diclorometano (DCM) da planta Vernonia scorpioides (Lam.) Pers. em modelo animal. 2004.
Monografia (Graduação em Farmácia). Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, 2004.
PENGELLY, A. The Constituents of Medicinal Plants. 2ª ed. Cambridge: CABI Publishing, 2004.
PILLAY, P.; VLEGGAAR, R.; MAHARAJ, V. J.; SMITH, P. J.; LATEGAN, C. A.;
CHOUTEAU, F.; CHIBALE, K. Antiplasmodial hirsutinolides from Vernonia staehelinoides and their utilization towards a simplified pharmacophore.
Phytochemistry. v.68, p.1200-1205, 2007.
POSMANTUR, R.; WANG, K. K. W.; GILBERTSEN, R. B. Caspase-3 like activity is necessary for IL-2 relase in activated Jurkat T cells. Experimental Cell Research.
v.244, p.302-309, 1998.
QUINTERO, A.; PELCASTRE, A.; SOLANO, J. D.; GUZMAN, A.; DIAZ, E.
Antitumoral activity of new pyrimidine derivaties of sesquiterpenes lactones. Journal Pharmacology Pharmaceutic Science. v.2, p.108-112, 1999.
RASKIN, I.; RIBNICKY, D. M.; KOMARNYTSKY, S.; ILIC, N.; POULEV, A.;
BORISJUK, N.; MORENO, D. A.; RIPOLL, C.; YAKOBY, N.; O’NEAL, J. M.;
CORNWELL, T.; PASTOR, I.; FRIDLENDER, B. Plants and human health in the twenty-first century. Trends in Biotechnology. v.20, n.1, p.522-531, 2002.
RAVAGNAN, L.; ROUMIER, T.; KROEMER, G. Mitochondria, the killer organelles and their weapons. Journal of cellular physiology. v.192, p.131-136, 2002.
RAVICHANDRAN, K. S. “Recruitment signals” from apoptotic cells: invitation to a quiet meal. Cell. v.113, p.817-822, 2003.
REIS, M. S. R.; MARIOT, A.; STEENBOCK, W. IN: SIMÕES, C. M. O.
Farmacognosia da planta ao medicamento. 5ª ed. POA: UFRGS, 2004.
REITZ, R. Flora Ilustrada Catarinense. Itajaí: Herbário Barbosa Rodrigues, 1980.
RIVERO, A.; QUINTANA, J.; EIROA, J. L.; LÓPEZ, M.; TRIANA, J.; BERMEJO, J.;
ESTÉVEZ, F. Potent induction of apoptosis by germacranolide sesquiterpene lactones on human myeloid leukemia cells. European Journal of Pharmacology.
v.482, p.77-84, 2003.
ROBBERS, J. E.; SPEEDIE, M. K.; WARRS, E. T. Farmacognosia e Biotecnologia. Colômbia: Premier, 1997.
ROBBINS, S. T.; COTRAN, R. S. Patologia. Bases patológicas das doenças. Rio de Janeiro: Elsevier, 2005.
RODRIGUEZ, E.; TOWERS, G.; MITCHELL, J. Biological activities of sesquiterpene lactones. Phytochemistry. v.15, p.1573-1580, 1976.
SALVESEN, G. S.; DUCKETT, C. S. IAP proteins: blocking the road to death’s door.
Nature reviews. Molecular cell biology. v.3, p.401-409, 2002.
SAUNDERS, P. A.; COOPER, J. A.; ROODELL, M. M.; SCHROEDER, D. A.;
BORCHERT, C. J.; ISAACSON, A. L.; SCHENDEL, M. J.; GODFREY, K. G.;
CAHILL, D. R.; WALZ, A. M.; LOEGERING. R. T.; GAYLORD, H.; WOYNO, I. J.;
KALUYZHNY, A. E.; KRZYZEK, R. A.; MORTARI, F.; TSANG, M.; ROFF, C. F.
Quantification of active caspase 3 in apoptotic cells. Analytical Biochemistry. v.284, p.114-124, 2000.
SAVIL, J.; FADOK, V. Corpse clearing defines the meaning of cell death. Nature.
v.407, p.784-791, 2000.
SCORRANO, L.; KORSMEYER, S. J. Mechanisms of cytochrome release by proapoptotic BCL-2 family members. Biochemical and biophysical research communications. v.304, p.437-446, 2003.
SINGH, N. P.; McCOY, M. T.; TICE, R. R.; SCHEIDER, E. L. A simple technique for quantification of low levels of DNA damage in individual cells. Expperimental Cell Research. v.175, p.184-191, 1988.
STAVRI, M.; FORD, C. H. J.; BUCAR, F.; STREIT, B.; HALL, M. L.; WILLIAMSON, R. T.; MATHEW, K. T.; GIBBONS, S. Bioactive constituents of Artemisia
monosperma. Phytochemistry. v.66, p.233-239, 2005.
STENNICKE, H. R.; SALVESEN, G. S. Properties of the caspases. Biochimica et Biophysica Acta. v.1387, p.17-31, 1998.
SY, G. Y.; CISSE, A.; NONGONIERMA, R. B.; SARR, M.; MBODJ, N. A.; FAYE, B.
Hypoglycaemic and antidiabetic activity of acetonic axtract of Vernonia colorata
leaves in normoglycaemic and alloxan-induced diabetic rats. Journal of ethnopharmacology. v.98, p.171-175, 2005.
TAVARES, W. Manual de antibióticos e quimioterápicos antiinfecciosos. 2ª ed.
São Paulo: Atheneu, 1996.
TCHINDA, A.; TSOPMO, A.; TANE, P.; AYAFOR, J. F.; CONNOLLY, J. D.;
STERNER, O. Vernoguinosterol and vernoguinoside, trypanocidal stigmastane derivates from Vernonia guineesis (Asteraceae). Phytochemistry. v.59, p.371-374, 2002.
THOME, M.; TSCHOPP, J. Regulation of lymphocyte proliferation and death by FLIP.
Nature reviews. Immunology. v.1, p.50-54, 2001.
TICE, R. R.; AGURELL, E.; ANDERSON, D.; BURLINSON, B.; HARTMAN, A.;
KOBAYASHI, H.; MIYAMAE, Y.; ROJAS, E.; RYU, J. C.; SASAKI, Y. F. Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing.
Enviromental and Molecular Mutagenesis. v.35, p.206-221, 2000.
VALDÉS, D. A.; BARDÓN, A.; CATALÁN C. A. N.; GEDRIS, T. E.; HERZ, W.
Glaucolides, piptocarphins and cadinanolides from Lepidaploa remotiflora.
Biochemical Systematics and Ecology. v.26, p.685-689, 1998.
VAUX, D.; SILKE, J. Mammalian mitochondrial IAP-binding proteins. Biochemical and Biophysical Research Communications. v.203, p.449-458, 2003.
VERMES, I.; HAANEN, C.; REUTELINGSPERGER, C. Flow cytometry of apoptotic cell death. Journal of Immunological Methods. v.243, p.167-190, 2000.
VIEIRA, S. Introdução à bioestatística. 2ª ed. Rio de Janeiro: Campus, 1991.
VONGVANICH, N.; KITTAKOOP, P.; CHAROENCHAI, P.; INTAMAS, S.;
SRIKLUNG, K.; THEBTARANONTH, Y. Antiplasmodial, antimycobacterial, and cytotoxic principles from Camchaya calcarea. Planta Medica. v.72, p.1427-1430, 2006.
WATERS, S. L.; SARANG, S. S.; WANG, K. K. W.; SCHNELLMANN, R. G. Calpains mediate calcium and chloride influx during the late phase of cell injury. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. v.283, p.1177-1184, 1997.
WEN, J.; YOU, K-R.; LEE, S-Y.; SONG, C-H.; KIM, D-G. The anticancer effect of the sesquiterpene lactone parthenolide. Journal of Biological Chemistry. v.277,
p.38954-38964, 2002.
WILLIAMS, R. B.; NORRIS, A.; SLEBODNICK, C.; MEROLA, J.; MILLER, J. S.;
ANDRIANTSIFERANA, R.; RASAMISON, V. E.; KINGSTON, D. G. Cytotoxic sesquiterpene lactones from Vernonia pachyclada from the Madagascar rainforest.
Journal of natural products. v.68, n.9, p.1371-1374, 2005.
WON, Y. K.; ONG, C. N.; SHI, X.; SHEN, H. M. Chemopreventive activity of parthenolide against UVB-induced skin cancer and its mechanisms.
Carcinogenesis. v.25, n.8, p.1449-1458, 2004.
ZHANG, S.; ONG, C. N.; SHEN, H. Involvement of proapoptotic Bcl-2 family membrs in parthenolide-induced mitochondrial dysfunction and apoptosis. Cancer Letters.
v.211, p.175-188, 2004.
ZHANG, S.; WON, Y. K.; ONG, C. N.; SHEN, H. N. Anti-cancer potential os
sesquiterpene lactones: bioactivity and molecular mechanisms. Current medicinal chemistry. Anti-cancer agents. v.5, p.239-249, 2005.
ZHANG, C-X.; HUANG, K-X. Mechanism of apoptosis induced by a polysaccharide, from the loach Misgurnus anguillicaudatus (MAP) in human hepatocellular caicinoma cells. Toxicology and Applied Pharmacology. v.210, p.236-245, 2006.
ANEXO A
Espectros de RMN das substancias estudadas
Hirsutinolídeo (Fração 15): (lS*,4R*,8S*,10R*)-1,4-epoxi-l3-etoxi-1,10-diidroxi-8- acetoxi-germacra-5E,7(11)-dien-6, 12-olideo, ou 8-Acetil-13-etoxipiptocarfol
O O
OCOCH3 O
H OH
O
O
1 4
8
13 10
14
15
11 12
ppm (t2)10.0 5.0 0.0
5.0
10.0 ppm (t1)
Figura 1: Mapa de correlação Homonuclear COSY (400 MHz, CDCl3) do Hirsutinolídeo (Fração 15).
ppm (t2)8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 0
50
100
ppm (t1)
Figura 2: Mapa de correlação heteronuclear HSQC (400 MHz para 1H, CDCl3) do Hirsutinolídeo (Fração 15).
ppm (t2)7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0
0
50
100
150
ppm (t1)
Figura 3: Mapa de correlação heteronuclear HMBC (400 MHz para 1H, CDCl3) do Hirsutinolídeo (Fração 15).
Mistura de lactonas sesquiterpênicas (Fração 19-21):
O O
OCOCH3
OCOCH3
O O
O H
OH 1
4
8
13 10
14
15
11
12 O
OCOCH3 OCOCH3
O O H
O H
O
O
1
4
8
13 10
15 11
12 14
ppm (f2)8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0 ppm (f1)
Figura 4: Mapa de correlação Homonuclear COSY (400 MHz, CDCl3) da Mistura de lactonas sesquiterpênicas (Fração 19-21).
ppm (t2) 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 0
50
100
ppm (t1)
Figura 5: Mapa de correlação Heteronuclear HSQC (400 MHz para 1H, CDCl3) da Mistura de lactonas sesquiterpênicas (Fração 19-21).
ppm (t2)7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0
0
50
100
150
200 ppm (t1)
Figura 6: Mapa de correlação Heteronuclear HMBC (400 MHz para 1H, CDCl3) da Mistura de lactonas sesquiterpênicas (Fração 19-21)