XXVIII Congresso de Iniciação Científica
Identificação e análise in silico de genes de Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii tipo C implicados na patogênese.
Jéssica Alcimari Ferreira Mello, Iashilei Cassieli Pasquini, Estevão Henrique Cangussu de Souza, Helen Alves Penha, Jesus Aparecido Ferro. Faculdade de Ciências agrárias e Veterinárias, campus Jaboticabal, Ciências Biológicas, je_fmello@hotmail.com, Programa Institucional de Bolsas de Iniciação Científica (PIBIC)/CNPq.
Palavras Chave: Cancro cítrico, mutação aleatória, patogenicidade.
Introdução
A citricultura é um dos setores mais competitivos e de maior potencial de crescimento do agronegócio no Brasil, entretanto, essa cultura enfrenta problemas relacionados à susceptibilidade a doenças e, dentre elas, está o cancro cítrico. A cancrose tipo C tem como agente causal a bactéria Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii tipo C (XauC), e restringe sua patogênese à Citrus aurantifolia – lima ácida ‘Galego’ e Citrus paradisi Macf. X Poncirus trifoliata - citrumelo “Swingle”.
Quando inoculada em folhas de outras espécies cítricas, XauC causa uma Resposta de Hipersensibilidade (HR)[1,2]. Esta é responsável pela contenção do patógeno no sítio de infecção, conferindo resistência. A hipótese do trabalho é que XauC secreta uma proteína efetora que é reconhecida pelo sistema de defesa da maioria dos citros, desencadeando a HR. Assim, a identificação do gene responsável por esta resposta, assim como de outros genes relacionados ao processo de patogenicidade é de grande importância e podem levar, futuramente, ao desenvolvimento de um método de controle do cancro cítrico.
Objetivos
O objetivo foi testar in planta clones oriundos de uma biblioteca de mutantes de XauC desenvolvida por meio da inserção aleatória de transposon Tn5 (Mello et al, 2015), visando a identificação de clones que apresentem fenótipo alterado em laranjeira
‘Pêra’ e/ou em lima ácida ‘Galego’, e sequenciamento e identificação dos genes mutados.
Material e Métodos
Os mutantes da biblioteca foram testados in planta através de inoculação por infiltração e o DNA daqueles que apresentaram sintoma alteradao foi isolado e amplificado via PCR inversa [3] e enviados para sequenciamento na plataforma ABI3730XL.
Análises in silico para determinar qual gene foi interrompido foram realizadas utilizando-se os programas BLASTn, BLASTx e InterProScan.
As curvas de crescimento bacteriano in planta e in vitro foram feitas de acordo com os protocolos de Laia (adaptado) [4].
Resultados e Discussão
Dos 288 mutantes testados in planta, 2 apresentaram fenótipo alterado: os mutantes P1G1 e P1B2 apresentaram sintomatologia reduzida, tanto nos sintomas de cancro na espécie susceptível, como nos sintomas de HR na espécie resistente.
Análises in silico das sequências do mutante P1G1demonstraram que o transposon se inseriu no gene pilJ, o qual faz parte de um cluster gênico envolvido na biossíntese dos pili e mobilidade. Já no mutante P1B2 a inserção do transposon ocorreu em um gene que codifica uma proteína da superfamília de alfa-beta hidrolases, as quais possuem diversas funções catalíticas. Ambos os genes mutados são relacionados, na literatura, com o processo de patogenicidade. Uma limitação no crescimento destes mutantes in planta, comparado com o crescimento em meio de cultura rico corroboram a hipótese destes genes estarem relacionados a processos de instalação e patogenicidade de XauC.
Conclusões
O screening in vivo de uma biblioteca de mutantes aleatórios é de grande significância na identificação de genes-alvo e elucidação de fatores envolvidos no estabelecimento do patógeno na planta, podendo representar um avanço inédito e essencial para as pesquisas sobre formas de controle do cancro cítrico causado por XauC.
Agradecimentos
Agradecemos ao Centro de Recursos Biológicos (CREBIO) pelo sequenciamento, e ao bacharelando Danyel F. Contilliani e Prof. Alessandro de Mello Varani pela valiosa contribuição ao trabalho.
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¹ Namekata, T. Estudo comparativo entre Xanthomonas citri (Hasse) Dow., agente causal do cancro cítrico e Xanthomonas citri (Hasse) Dow., N.F. SP. aurantifolii, agente causal da cancrose do limoeiro Galego. Piracicaba, 1971.
² Jaciani, F.J. et al. Detection of a New Bacterium Related to Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii Infecting Swingle Citrumelo in Brazil. Plant Disease, v.93, n.10, p.1074, 2009.
³Ochman H, Gerber AS, Hartl DL. Genetic Applications of an Inverse Polymerase Chain Reaction. Genetics. 1988;120(3):621-623.
Laia, Marcelo Luiz de. Análise funcional de genes de Xanthomonas axonopodis pv. citri implicados na patogênese. 2007.
Mello, Jéssica Alcimari Ferreira et al. Congresso de Iniciação Cientifica da Unesp, 28., 2015, Jaboticabal, Construção de uma biblioteca de mutantes de Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii Tipo C (XauC).
