XXVII Congresso de Iniciação Científica
Estudos da interação da hemoglobina extracellular gigante Amynthas gracilis (HbAg) com o metal pesado Cobre.
Jonathan Brito Souza de Oliveira1, Patrícia Soares Santiago e Ângela Prisca Dias Linhares1. Campus Experimental de Registro, Agronomia, jbso@registro.unesp.br; 1Bolsista de Iniciação científica PIBIC/CNPq.
Palavras chaves: Hemoglobina de Amynthas gracilis, biossensor, cobre
Introdução
As hemoproteínas são um grupo de proteínas que desempenham um papel fundamental nos organismos1. Dentro desta classe podemos citar mioglobina, hemoglobina intracelular e extracelular e citocromo c, que são intensamente estudados. Uma forte motivação para estudar hemoglobinas extracelulares gigantes é devido a alta estabilidade oligomérica, resistência à oxidação, alta cooperatividade e afinidade para ligar oxigênio2, além de seu potencial uso em aplicações biotecnológicas, tais como o desenvolvimento de biossensor para contaminação ambiental.
Objetivos
O presente trabalho de iniciação científica visa determinar as propriedades da HbAg na presença de sulfato de cobre (CuSO4), a fim de observar a forma como o Cu (cobre) pode alterar as propriedades da HbAg e, consequentemente, avaliar a sua potencial utilização como biossensor de contaminação ambiental.
Material e Métodos
As amostras de HbAg foram preparadas em tampão Tris-HCl pH 7,0 com concentração de 0,1 mg / ml.
As titulações das soluções de HbAg foram feitas através da adição de alíquotas de soluções concentradas de CuSO4. A concentração de cobre utilizada foi na faixa de 0-50 µM. As amostras foram equilibradas por 1:30 h antes dos experimentos, a temperatura de 25 ° C.
Resultados e Discussão
Fig. 1A apresenta os espectros de absorção ótica da HbAg 0,1 mg/mL em função do aumento da concentração de CuSO4, onde pode-se observar que o aumento da [Cu] diminui a intensidade de absorção e desloca o máximo da banda de Soret para λ menores. Na Fig. 1B, são apresentados a intensidade de absorção monitorados em alguns comprimentos de onda em função da [Cu]. Podemos observar que para uma concentração em torno de 12 µM de CuSO4, ocorre uma diminuição drástica da intensidade de absorção. Para as concentrações de cobre acima de 12 uM foram observados os seguintes fenômenos: diminuição da intensidade das bandas de Q (500-600 nm) e surgimento da banda de transferência de carga ligante metal (LMCT) geralmente acima de 600 nm. O aumento na absorbância em 700 nm pode está associada a presença de espalhamento de luz devido a forte interação da HbAg - Cu. Considerando que 0,1 mg/ml de proteína corresponde a 10 µM de heme
presente na HbAg os dados sugerem que para uma razão de HbAg/Cu de 1:1 temos uma oxidação parcial da hemoglobina. Desta forma, estes resultados sugerem que HbAg é muito sensível à presença de metais pesados, como o cobre. Um trabalho realizado por KHAN et al. (2007)3 para HbLt (Hemoglobina de Lumbricus terrestres) foi observado um aumento dos valores de massa de suas subunidades na presença de cobre.
300 400 500 600 700
0,15 0,30 0,45
Abs
λ nm
0 µM CuSO4 1 µM 2 µM 3 µM 4 µM 5 µM 6 µM 7 µM 8 µM 10 µM 12 µM 14 µM 16 µM 18 µM 20 µM
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
0,15 0,20 0,25 0,30 0,35Maio_2015
Abs
[CuSO4] µM
400 nm 405 nm 408 nm 413 nm 415 nm 420 nm
Fig. 1. (A) Espectro de absorção óptica de HbAg para diferentes concentrações de CuSO4 (B) Espectro do máximo de absorção da banda de Soret para diferentes valores de concentração de CuSO4.
Conclusões
A presença CuSO4 causa mudanças nas características da proteína, promovendo a oxidação do grupo heme da HbAg.
Agradecimentos
Ao grupo de Biofísica Molecular/IQSC/USP coordenado pelo Prof. Dr. Marcel Tabak, à PROPE e ao CNPq.
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1Barreta, D.; Brown, G. G.; James, S.W.; Cardoso, E. J. B. N. Scientia Agricola, v. 64, p. 384-392, 2007.
2Santiago, P.S.; Moura, F.; Moreira, L.M.; Domingues, M.M.; Santos, N.C.; Tabak, M. Biophysical Journal, v. 94, p. 2228–2240, 2008.
3KHAN et al. Effect of temperature on heavy metal toxicity to earthworm Lumbricus terrestris (Annelida: Oligochaeta) Environmental Toxicology, v.22, p. 487–494, 2007.
A
B
