XXVI Congresso de Iniciação Científica
ESTUDOS FUNCIONAIS DA TIROSINA QUINASE FGFR2 E DA ADAPTADORA Grb2.
SANCHES, K., SOUZA, F. P., MELO, F. A., Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, São José do Rio Preto/SP, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, Física,
karolsanches.unesp@hotmail.com, PROPe.
Palavras Chave:FGFR2, Grb2, interação, Fluorescência, ITC, RMN.
Introdução
As vias de sinalização celular são reguladas por atividades enzimáticas dependentes da fosforilação da cadeia lateral de aminoácidos. Neste sentido, a proteína tirosina quinase FGFR2 desempenha um papel fundamental neste processo. Quando fosforilada, esta faz o recrutamento de proteínas do citosol para formar complexos de sinalização primários, que posteriormente irão ativar vias de sinalização especificas dentro da célula. Aberrações no processo de sinalização mediado por FGFR2 causam variedades de displasias humanas como câncer e má formação fetal. Estudos recentes mostram que a proteína adaptadora Grb2 é uma importante reguladora de FGFR2, prevenindo sua atividade quinase antes de estímulos extracelulares.
Desta maneira, tanto FGFR2 quanto Grb2 são alvos em potencial para o desenvolvimento de fármacos, e a caracterização das bases de interação entre estas proteínas são de suma importância para o entendimento dos processos que levam ao desenvolvimento de câncer.
Objetivos
- Expressar e purificar a proteína FGFR2 e Grb2;
- Caracterizar o processo de interação entre FGFR2 e Grb2 pelas técnicas de ITC, NMR e Fluorescência.
Materiais e Métodos
As bactérias cresceram a 37°C em meio contendo 50μg/ml de Kanamicina, induzidas com 0,2mM de IPTG, centrifugadas e lisadas com tampão (50mM de Tris pH 8,0, 1mM 2-Mercaptoetanol, 100mM de NaCl, contendo inibidor de protease P2714-1BT.
Após 20min a amostra foi sonicada e o extrato coletado por centrifugação durante 40 min, a 16.637xg e 4°C. O sobrenadante foi filtrado e purificado por cromatografia de afinidade por cobalto imobilizado em resina de Sepharose IMAC HP HiTrap™ equilibrada com tampão 50mM de Tris pH 8,0, 1mM de 2-β-mercaptaetanol, 100mM de NaCl e eluída com 200mM imidazol. A purificação em resina de troca iônica foi realizada com o método de “step”, sendo que a proteína foi eluída em uma
concentração na faixa de 500-600mM de NaCl. A terceira purificação foi por gel filtração por exclusão molecular onde a coluna foi equilibrada com tampão NaPO4 50mM e pH 7,0. A análise da purificação foi feita em gel de poliacrilamida 15% (SDS-PAGE).
Resultados e Discussão
O gel a seguir mostra o resultado das 3 etapas de purificação, onde é possível identificar a proteína FGFR2 com aproximadamente 40kDA (vide figura 1).
Figura 1: Bandas em gel de poliacrilamida da purificação da proteína FGFR2. Figura A: Purificação por cromatografia de afinidade por Cobalto imobilizada em resina IMAC HP HiTrap™.
Figura B: Purificação em resina de troca iônica fraca com 1M NaCl nota-se FGFR2 nas bandas B2, B3, B4 e B5. Figura C:
Purificação por gel filtração por exclusão molecular observando que FGFR2 aparece mais evidente nas bandas A5 e A6.
Conclusões
Nesta primeira etapa, o resultado da purificação de FGFR2 mostra que ainda existem contaminantes na amostra. Então, novas purificações serão realizadas com o intuito de maximizar o protocolo de purificação. Posteriormente a caracterização físico- química da interação entre FGFR2 e Grb2 será realizada.
Agradecimentos
À Pro Reitoria de Pesquisa.
1 Chi-Chuan Lin, Fernando A. Melo, Ragini Ghosh, Kin M.
Suen, Loren J. Stagg, John Kirkpatrick, Stefan T. Arold, Zamal Ahmed, John E. Ladbury.
