XXVIII Congresso de Iniciação Científica
SÍNTESE DE PEPTÍDEOS COM SEQUÊNCIAS CONTENDO CISTEÍNA PARA OTIMIZAÇÃO DO TESTE IN CHEMICO DPRA
Rafael Shoiti Souza Yokoo, Carolina Gomes Benevenuto Moreira, Júlia Pinto Piccoli, Lorena Rigo Gaspar Cordeiro, Eduardo Festozo Vicente. Campus de Tupã, curso de Engenharia de Biossistemas, rafael_shoiti@hotmail.com.
Palavras Chave: DPRA, modificações, peptídeos.
Introdução
Hoje em dia há uma crescente demanda para a redução do uso de animais nos testes de cosméticos.
Uma alternativa a esses ensaios é o teste in chemico DPRA (Direct Peptide Reactivity Assay), que consiste em utilizar um peptídeo para mimetizar as reações ocorridas entre agentes sensibilizantes cutâneos e as proteínas constituintes do tecido epitelial. Porém, esta técnica contém alguns desafios a serem superados: a dificuldade de solubilidade de alguns agentes que são muito hidrofóbicas, como as encontradas nos filtros solares, e a sobreposição de picos nestas análises, já que são feitas via HPLC.
Objetivos
Este trabalho teve como objetivo realizar modificações na sequência do peptídeo original Ac- RFAACAA-COOH (um dos peptídeos padrões usados no teste DPRA), substituindo o aminoácido alanina (A) por valina (V) no intuito de melhorar a solubilização de moléculas-teste hidrofóbicas e a substituição da fenilalanina por triptofano e tirosina, para habilitar a análise no HPLC no = 280 nm (devido à absorção dos aminoácidos aromáticos neste comprimento de onda), assim facilitando a interpretação dos dados e minimizar possíveis interações no comprimento de onda de 220 nm.
Material e Métodos
Para a realização dos estudos, o trabalho foi dividido em duas partes: na primeira, os peptídeos foram obtidos através da técnica de síntese de peptídeos em fase sólida (SPFS) pela estratégia Fmoc, purificados e caracterizados via HPLC e espectrometria de massas. Na segunda etapa, os peptídeos foram utilizados para a realização do teste DPRA, analisado em HPLC, com duas substâncias- testes como controles positivos o dinitroclorobenzeno (DNCB) e o aldeído cinâmico (AC). Neste ensaio é analisada a depleção do peptídeo: se esse valor ultrapassar o número de 13,89% isso indica um resultado positivo, ou seja, a substância submetida ao ensaio é um sensibilizador da pele.
Resultados e Discussão
Os peptídeos foram obtidos com sucesso via SPFS e utilizados com pureza acima de 95%. A partir dos resultados do teste DPRA via HPLC (Tabela 1) com os controles positivos, as modificações nos
peptídeos produziram resultados diferentes, em relação ao controle DNCB e AC.
Tabela 1: Ensaio de depleção com peptídeos modificados.
Para o controle DNCB, o peptídeo que mais se destacou foi o AY-Cys devido ao fato de que, neste controle, foi o que melhor conseguiu mimetizar os resultados do peptídeo original. Já para o controle AC, de acordo com os resultados, nenhuma modificação obteve êxito em simular os resultados do peptídeo original, produzindo resultados abaixo dos valores dispostos na orientação fornecida pela OECD. Para o peptídeo AY-Cys os dados foram inconclusivos devido à sobreposição dos picos. No HPLC. Posteriores análises, além da depleção, serão necessárias para verificar a viabilidade das modificações do peptídeo original.
Conclusões
O peptídeo AY-Cys obteve os melhores resultados para o controle DNCB, seguido do peptídeo AW-Cys e VY-Cys, o que demonstram que as modificações otimizaram os resultados do teste DPRA. Para o controle AC, os valores foram inconclusivos, devido à sobreposição de picos, ainda que, em = 220 nm os peptídeos mostraram valores de depleção abaixo dos de referência. Portanto, conclui-se que os resultados foram promissores, pois, apesar da necessidade de testes complementares, as modificações peptídicas mostraram-se uma forma eficiente de otimização do teste DPRA.
Agradecimentos
Agradecemos ao Laboratório de Tecnologia de Cosméticos da FCF-RP/USP, à Profª. Drª. Lorena Rigo Gaspar Cordeiro e Drª. Carolina Gomes Benevenuto Moreira pelo auxílio nos experimentos.
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¹ VICENTE, Eduardo F. et al. Dynamics and conformational studies of TOAC spin labeled analogues of Ctx (Ile21)-Ha peptide from Hypsiboas albopunctatus. PloS one, v. 8, n. 4, p. e60818, 2013.
2OECD. Test No. 442C: In Chemico Skin Sensitisation Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA). ed. Paris: OECD Publishing, 2015. 19 p.
Peso molecular (g/mol)
Substância teste (controles
positivos extremos)
Análise em 220 nm
Análise em 280 nm
Valores de referência de
depleçãob
AW-Cys 789,9 DNCB 89,7 90,8 90-100
AC 18,4 a 60,8-100
AY-Cys 766,87 DNCB 100 100 90-100
AC a a 60,8-100
VY-Cys 879,08 DNCB 77,6 62,4 90-100
AC 18,9 a 60,8-100
