XXVIII Congresso de Iniciação Científica
Identificação Genômica em Larga-escala de Novos MicroRNAs e seus Genes Alvos na tilápia do Nilo
Lucas Di Pietro¹, Danillo Pinhal¹, Arthur Casulli de Oliveira¹, Pedro Nachtigall¹, Luiz Augusto Bovolenta2,
1 UNESP, Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Botucatu, SP, Brasil.
2 UNESP, Departamento de Física e Biofísica, Instituto de Biociências, Botucatu, SP, Brasil.
dipietroneves@gmail.com.br
key-words: microRNAs, Tilápia do Nilo, PCR
Introdução
MicroRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs (~22 nucleotídeos) que regulam a atividade gênica de forma pós-transcricional. Muitos estudos já mostraram que miRNAs são necessários para o desenvolvimento correto e homeostase de animais vertebrados.
Objetivos
O presente estudo tem como objetivos:
(i) identificar novos miRNAs de Tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus);
(ii) validar experimentalmente a expressão das moléculas recém descobertas como miRNAs funcionais;
(iii) caracterizar a organização genômica dos loci de microRNAs.
(iv) determinar por predição bioinformática os potenciais genes alvo dos novos miRNAs
Material e Métodos
Dezesseis bibliotecas genômicas de pequenos RNAs da tilápia do Nilo foram sequenciadas em larga escala (NGS, Illumina). As reads geradas foram processadas (miRdeep2, miRproof e miRcat), e analisadas para a identificação e quantificação de centenas de miRNAs novos e conhecidos. Os loci gênicos dos novos miRNAs foram caracterizados (i.e., intronico, exonico or intergenico) por programação Python. A predição de alvos foi executada com a ferramenta TargetScan. Primers foram desenvolvidos para os testes de PCR e qPCR para validação funcional dos novos miRNAs por análise de expressão gênica.
Resultados e Discussão
Os dados de sequenciamento mostraram 90 possíveis novos miRNAs e muitos aparentavam ser expressos em vários tecidos. Até agora, nove dos novos miRNAs foram escolhidos para mais testes.
Sete dos novos miRNAs escolhidos foram localizados como intrônicos, e dois como intergênicos. O grande número de miRNAs intrônicos já era esperado, visto que é mais fácil para o surgimento de um novo miRNA onde já existe uma região promotora funcional. A existência dos loci de 5 novos miRNAs foi confirmada por PCR
convencional. Esses miRNAs são: oni-miR-n797, oni-miR-n456, oni-miR-n334, oni-miR-n836 e oni- miR-n659. Um miRNA (miR-n941) foi validado por qPCR. Genes alvo foram atribuídos para os nove novos miRNAs, e vias biológicas enriquecidas foram encontradas para dois deles (Tabela 1). Para o miR- n941, as vias biológicas foram: hipopigmentação, assimetria cranial e anormalidades na estrutura dentária. Com isso, podemos inferir que esse novo miRNA pode ter um papel importante no desenvolvimento correto da cabeça do peixe. A via encontrada para o miR-n456 estava relacionada à acidúria devida ao 3-metil-glutárico. Este termo representa uma condição patológica que interfere com a habilidade da mitocôndria de produzir energia. Sendo assim, esse miRNA pode ser importante no controle de vias metabólicas envolvidas com a produção de energia para o organismo.
Tabela 1. Predição de alvos de novos miRNAs
Nome do miRNA Número de alvos
Vias Biológicas Enqriquecidas
miR-n437 16 Não
miR-n941 11 Sim
miR-n692 25 Não
miR-n456 18 Sim
miR-n965 1 Não
miR-n659 8 Não
miR-n334 50 Não
miR-n797 14 Não
miR-n836 31 Não
Conclusões
As vias biológicas encontradas para os dois novos miRNAs podem ajudar a aprimorar o conhecimento da atuação dos miRNAs no desenvolvimento embrionário e manutenção do corpo. Além disso, o papel do miR-n456 pode ser melhor estudado com o objetivo de compreender os processos envolvidos em mecanismos pós-transcricionais mediados por miRNAs em resposta a patologias.
