DISS. ETH Nr. 18985
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Unraveling Yeast’s Response to its Environment by Novel Metabolomics
Approaches
A dissertation submitted to the Swiss Federal Institute of Technology
(ETH Zürich)
for the degree of Doctor of Science Dr. sc. ETH Zürich
presented by
Jennifer Christina Ewald Dipl.-Biol. (t.o.), Universität Stuttgart
born April 26th 1981 Citizen of Germany
Accepted on recommendation of Prof. Uwe Sauer
Prof. Matthias Peter Dr. Nicola Zamboni
2010
Abstract
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Abstract
Metabolism is the backbone of life, providing building blocks and energy for all cellular processes. Understanding metabolism is a prerequisite for tackling metabolic diseases or for successfully exploiting microbes in biotechnological production. The enzymatic reactions comprising the metabolic network have been extensively characterized. However, unraveling the regulation governing their activity remains an ongoing endeavor. In this work we set out to enhance our quantitative understanding of the condition-dependent metabolic regulation and how it manifests in a remodeling of metabolism in response to perturbations.
Obtaining a comprehensive view of metabolic regulation requires multiple perturbation experiments together with sensitive functional read-outs of metabolism.
In Chapter 2 we present a workflow for quantitative metabolomics in yeast which allows the cultivation and sample preparation in a multi-well format, thereby dramatically increasing throughput. We applied the new approach in Chapter 3 in a large-scale study on metabolic mutants to investigate how genes and environment jointly affect growth rate and the core metabolism of Saccharomyces cerevisiae.
Specifically, we characterized the response to single enzyme knockouts of central carbon metabolism during aerobic growth on glucose, galactose, or ethanol. We find that central carbon metabolism is globally determined by the environment, while enzyme deletions do not provoke compensatory responses. The environmentally determined regulation is hard-wired and imposes constraints on metabolism, even when enzyme deletions interfere with metabolic activity. This leads to unexpectedly severe growth phenotypes or even lethality. These sick phenotypes can be relieved by modifying other environmental parameters such as oxygen availability. Overall,
7 of their isoforms, but do not do so during exponential growth in vivo. In search of an activating environmental condition, we found that nqm1 and tkl2 deletion strains exhibit a stress-sensitive phenotype when exposed to oxidative agents. We therefore hypothesize that the main function of nqm1 and tkl2 is to increase catalytic capacity of the non-oxidative PPP in response to stress, in face of a sudden high NADPH demand.
Understanding yeast’s response to the environment not only requires high- throughput but also read-outs of metabolism with high temporal and spatial resolution. Since standard metabolomics protocols require extraction of metabolites from cells, information on subcellular distribution is lost. In Chapter 5 we employed genetically-encoded fluorescent nanosensors based on Förster resonance energy transfer (FRET) to tackle the problem of compartment specific metabolite dynamics.
We developed a series of fluorescence nanosensors for citrate, a molecule with catabolic, anabolic and regulatory functions in the cell. The insertion of the sensor domain of a histidine kinase between CFP and YFP yielded a sensor highly specific for citrate. By further engineering the protein we were able to enhance the FRET signal sixfold and obtain sensors with different affinities spanning three orders of magnitude. In a first in vivo application, we monitored the yeast diauxic shift, a naturally occurring transition from consuming glucose to metabolizing ethanol, in cytosol and mitochondria.
This work provides two novel, complementary, and highly versatile tools for the study of metabolism and its regulation. Applying these tools, we demonstrate for several examples that yeast's metabolism has evolved great flexibility in the face of environmental changes, but cannot actively respond to loss of gene functions.
Abstract
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Zusammenfassung
Stoffwechsel bildet das Rückgrat des Lebens, da er die nötigen Bausteine und die Energie für all Prozesse der Zelle bereitstellt. Den zellulären Stoffwechsel und seine Regulation zu verstehen, ist Voraussetzung um metabolische Krankheiten zu bekämpfen und Mikroben erfolgreich für die biotechnologische Produktion einzusetzten. Die enzymatischen Reaktionen, die zusammen das metabolische Netzwerk darstellen, sind umfassend beschrieben worden. Die Regulation, die den Stoffwechsel kontrolliert, wird jedoch erst fortwährend entschlüsselt. Mit dieser Arbeit streben wir nach einem besseren quantitativen Verständis der metabolischen Regulation und wie sie aufgrund veränderter Bedingungen zu einer Anpassung des Stoffwechsels führt.
Eine umfassende Sicht der metabolischen Regulation zu erhalten, erfordert viele verschiedene Perturbationsexperimente, da die Aktivität des Stoffwechsels von den äusserden Bedingungen abhängt. In Kapitel 2 stellen wir daher eine neue Hochdurchsatzmethode für quantitative Metabolomics vor, die die Kultivierung und Probenprozessierung im Plattenformat erlaubt. Im Kapitel 3 verwendeten wir diese neue Methode, um den gemeinsamen Einfluss von Genen und Umwelt auf das Wachstum und den zentralen Stoffwechsel von Saccharomyces cerevisiae zu bestimmen. Wir charakterisierten die Auswirkungen von Enzymdeletionen während des Wachstums auf Glukose, Galaktose oder Ethanol. Wir beobachteten, dass der zentrale Kohlenstoff-Stoffwechsel global durch die Umwelt bestimmt wird, während Enzymdeletionen keine kompensatorischen Reaktionen herbeiführen. Die durch die Umweltbedingungen ausgelöste Regulation ist starr und schränkt den Stoffwechsel ein, auch wenn eine Enzyzmdeletion die metabolische Funktion beeinträchtigt. Dies
9 Isoenzyme, um ihre Funktion in der Zelle zu entschlüsseln. Wir untersuchten die Transaldolase- und Transketolasereaktionen im Pentosephosphat-Weg. Bislang waren nur die Hauptenzyme Tal1p und Tkl1p charakterisiert. Wir konnten zeigen, dass die Isoenzyme Nqm1 und Tkl2 zwar in der Lage sind, die Funktion von Tal1 und Tkl1 zu ersetzen, aber bei exponentiellem Wachstum diese Funktion nicht ausüben.
Auf der Suche nach aktivierenden Umweltbedingung endeckten wir, dass die Deletionsmutanten nqm1 und tkl2 sensitiv auf Oxidationsmittel reagieren. Wir stellen daher die Hypothese auf, dass Nqm1 und Tkl2 für die schnelle Erhöhung des Flusses durch den Pentosephosphat-Weg bei oxidativen Stress zuständig sind, wenn viel NADPH benötigt wird.
Um Reaktion der Hefezelle of Umweltbedingungen zu untersuchen, sind nicht nur Hochdurchsatzmethoden, sondern auch Methoden mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung erforderlich. Da Metabolomics-Standardprotokolle die Extraktion von Metaboliten aus Zellen erfordern, wird sämtliche Informtation über deren räumliche Aufteilung verloren. In Kapitel 5 gehen wir dieses Problem an, in dem wir auf FRET (Förster-Resonanz-Energie-Transfer)-basierende fluoreszierende Nanosensoren entwicklen. Wir entwickelten Sensoren für Citrat, einem Molekül mit metabolischer und regulatorischer Funktion. Die Insertion einer Sensordomäne einer Sensorkinase zwischen ein gelbes und ein blaues Fluoreszenzprotein ergab einen für Citrat hochspezifischen Sensor. Durch Modifizieren des Proteins konnten wir das Signal verbessern und eine Reihe von Sensoren mit verschiedenen Affinitäten bereitstellen. In einer ersten Anwendung untersuchten wir Diauxie in Hefe, einem natürlich auftretenden Wechsel von Glukose- zu Ethanolverstoffwechselung, mit kompartiment-spezifischer Auflösung.
Diese Arbeit stellt zwei neue, sich ergänzende Methoden zur Untersuchung von Stoffwechsel und dessen Regulation bereit. Mit diesen Methoden konnten wir anhand mehrerer Beispiele zeigen, dass der Stoffwechsel der Hefe hochgradig flexibel auf die Umwelt, nicht aber auf genetische Veränderungen reagieren kann.
