The effect of the polymerization time on the chromatographic properties of the prepared monolithic capillary columns was studied with both reversed phase CLC and CEC. The results indicate the possibility of using the prepared monolithic columns also in ion exchange mode.
Úvod
Seznam použitých zkratek a symbolů
Teoretická část
- Počátky monolitů v analytické chemii
- Monolitické stacionární fáze – vlastnosti a struktura
- Příprava kapilárních monolitických kolon na bázi organického polymeru
- Kapilární separační techniky
- Kapilární kapalinová chromatografie
- Kapilární elektrochromatografie
- Monolitické kolony na bázi styrenu
Monolitické kolony na bázi organického polymeru tvořeného kopolymerem styrenu a divinylbenzenu byly úspěšně použity pro separaci široké škály analytů jak v CLC, tak v CEC. Ukázkový snímek stacionární fáze na bázi kopolymeru styrenu a divinylbenzenu ze skenovacího mikroskopu a schematické znázornění monolitu připraveného v křemenné kapiláře se silanizovanou vnitřní stěnou jsou na Obr.
Experimentální část
- Použité chemikálie a materiály
- Přístrojové vybavení
- Postup přípravy směsí standardů a mobilních fází
- Příprava monolitických kolon
- Modifikace vnitřní stěny kapiláry
- Příprava polymerizační směsi a polymerizace
- Vyhodnocení, používané veličiny a vzorce
Monomery pro přípravu polymerační směsi byly zváženy na analytických vahách APX-100 od Denver Instrument (USA). Testování připravených monolitických kolon pro CLC v reverzním režimu bylo provedeno na mikrofluidním chromatografu pomocí pístového čerpadla mobilní fáze MHPP 20 od firmy Laboratorní přístě (Praha, Česká republika). Tento lineární dávkovač mobilní fáze je připojen k dávkovacímu ventilu Valco C6W od Valco Europe (Schenkon, Švýcarsko) s dávkovací smyčkou 100 nl.
Řízení mikrofluidního chromatografu, sběr a vyhodnocení naměřených dat bylo provedeno pomocí softwaru Clarity od DataApex (Praha, Česká republika). Pro přípravu mobilních fází byl použit pH metr Orion Model 370 od Thermo Fisher Scientific (Waltham, USA) s kombinovanou skleněnou elektrodou od Metrohm (Herisau, Švýcarsko). Mobilní fáze byla před použitím filtrována přes membrány Nylon 66 s velikostí pórů 0,45 μm od firmy (Supelco, Bellefonte, PA, USA) a odplyňována vždy 15 min v ultrazvukové lázni Ultrasonic LC30H, Elma (Česká republika).
Koncentrace jednotlivých analytů byly 0,5 mg ml-1 pro thiomočovinu, fenol, benzen, toluen, ethylbenzen, propylbenzen a butylbenzen a 0,2 mg ml-1 pro anilin, pokud není uvedeno jinak. Silanizační činidlo bylo poté z kapilár vymyto toluenem a kapiláry byly znovu sušeny proudem dusíku po dobu 10 minut. Chromatogramy získané metodou CLC a CEC byly zaznamenány a vyhodnoceny pomocí programu Clarity od společnosti DataApex (Praha, Česká republika) a programu Chemstation od společnosti Agilent (Santa Clara, USA).
Výsledky a diskuze
Monolity na bázi styrenu a divinylbenzenu pro CLC malých molekul
10., všechny sloučeniny ve směsi se eluovaly společně v mrtvém čase v jediném vysokém a postupně mizejícím píku. 10 Chromatogram ukazující separaci směsi thimočoviny (1), fenolu (2), anilinu (3), benzenu (4), toluenu (5), ethylbenzenu (6), propylbenzenu (7) a butylbenzenu (8) metodou CLC v monolitu. močovina ze směsi alkylbenzenů, která se eluovala na špičce ocasu.
Při použití zesíťovaného monolitu však dosáhly zvýšení měrného povrchu až na více než desetinásobek původní hodnoty a všechny sloučeniny ve směsi byly separovány na bázi s dobou analýzy do deseti minut. Zároveň bylo cílem vytvořit monolit na bázi styrenu, který by se dal ideálně použít jak pro CLC v reverzním a iontoměničovém režimu, tak i pro CEC. Proto jsme se v dalším průběhu naší práce inspirovali přípravou kolon na bázi polystyrenu určených pro CEC, při jejichž přípravě se přímo do polymerační směsi přidává zatěžovací monomer pro zajištění generování elektroosmotického proudu.
Monolitické kolony na bázi kopolymeru styrenu, divinylbenzenu a kyseliny
- Strukturní charakteristika připravených monolitických stacionárních fází
- Vliv doby polymerizace
- Aplikace Waltersova testu pro reverzní stacionární fáze
- Opakovatelnost a reprodukovatelnost připravených kolon
- Tlaková odolnost
- Shrnutí přípravy a separačních charakteristik monolitických kolon na bázi
Proto jsme připravili dvě řady kolon, a to kolony bez kyseliny methakrylové (směs 1) a s kyselinou methakrylovou (směs 2), s dobou polymerace 1, 2 a 6 h.11 Je patrné, že na koloně připravené bez přídavku kyseliny methakrylové nedošlo k separaci testovaných sloučenin a všechny látky byly eluovány v jediném širokém píku. Naproti tomu kolona připravená s přídavkem kyseliny methakrylové do polymerační směsi (směs 2) poskytla účinnou separaci všech osmi testovaných analytů na základní úrovni, kdy průměrná účinnost kolony dosáhla 28 000 teoretických vrstev na metr kolony pro všechny testované látky (obrázek 12).
Naproti tomu materiál připravený z polymerační směsi 1 bez kyseliny methakrylové (tabulka 1) představoval kompaktní pevný polymer s téměř žádnými propojenými póry. Zároveň jsme v případě monolitu bez polymerované kyseliny methakrylové nepozorovali mikrometrické póry, které by umožňovaly průtok monolitem. Na základě těchto výsledků předpokládáme, že v případě monolitu připraveného bez přídavku kyseliny methakrylové mobilní fáze neprotékala samotným materiálem monolitu, ale skrz něj.
Pro vyhodnocení závislosti separační účinnosti monolitických kapilárních kolon pro CLC na době polymerace byly použity kapilární kolony na bázi kopolymeru styrenu, divinylbenzenu a kyseliny methakrylové s i.d. Retenční faktory benzenu a anthracenu, stanovené v mobilní fázi acetonitril:voda 65:35 % obj., byly použity pro výpočet indexu hydrofobnosti HI (vzorec uvedený v části 4.5) monolitu připraveného na bázi kopolymeru styrenu, divinylbenzenu a kyseliny methakrylové. Kolona byla připravena jako v předchozích případech z polymerační směsi 2 s přídavkem kyseliny methakrylové (tabulka 1) podle postupu popsaného v pododdíle 4.4.2.
Monolitické kolony na bázi kopolymeru styrenu, divinylbenzenu a kyseliny
- Vliv doby polymerizace
- Optimalizace vloženého napětí při CEC analýze
Předchozí studie ukázaly, že účinnost separace lze zvýšit zkrácením doby polymerace monolitických kolon na bázi polystyrenu, ve kterých byla jako monomer nesoucí náboj použita kyselina methakrylová89. Na základě znalosti vlivu doby polymerace na separaci CLC, popsané v pododdíle 5.2.2, byly pro přípravu monolitických kolon zvoleny doby polymerace 3 a 6 hodin.
17 Chromatogramy znázorňující separaci směsi thiurey (1), fenolu (2), anilinu (3), benzenu (4), toluenu (5), ethylbenzenu (6), propylbenzenu (7) a butylbenzenu (8) metodou CEC na poly(styren-co-divinylbenzen) koloně připravené z poly(benzen-co-divinylbenzen)-sloupce připravené z poly(styren-divinylbenzen)-číslo separační účinnosti pomocí poly(styrenu) 5. hodin teoretických vrstev N na metr kolony a retenční časy tR pro jednotlivé látky v testovací směsi získané metodou CEC na poly(styren-co-divinylbenzen-co-methakrylové) monolitické koloně připravené polymerací po dobu 3 a 6 hodin. Zkrácením doby polymerace na polovinu (3 hodiny) se doba analýzy více než zdvojnásobila, protože všech "analytů bylo porovnáno pouze šest" s původní analýzou za 1 hodinu. 6 minut.
Toto pozorování je v souladu s předchozím výzkumem [17], ve kterém autoři dospěli k závěru, že kratší doba polymerace (1–2 h) poskytla nejvyšší účinnost separace v CEC, zatímco účinnost separace postupně klesala při delších dobách polymerace (testováno až 24 h). 18 Porovnání chromatogramů zkušební směsi získané metodou CEC na poly(styren-co-divinylbenzen-co-methakrylové) monolitické koloně připravené polymerací po dobu 3 hodin při různých hodnotách aplikovaného napětí na elektrody, základní zkušební směs obsahující thiomočovinu (1), fenol (2), benzen (87), benzen (87), butylenethyl (4), propylenethyl. 19 Vliv přiloženého napětí na separační účinnost poly(styren-co-divinylbenzen-ko-methakrylové) monolitické kolony v CEC módu vyjádřený počtem teoretických pater N na metrů kolony obsahuje testovací směs thiomočovinu (1), fenol (2), anilin (3), benzen (4), ethylbenzen (6), propylbenzen (6), propylbenzen (6), propylenbenzen (5) a propylenbenzen (5).
Porovnání CLC a CEC – vliv doby polymerizace na výslednou retenci a separační
6 Porovnání separačních účinností vyjádřených počtem teoretických podlaží N na metrová kolona a retenční časy tR pro jednotlivé látky ve zkušební směsi pro CLC a CEC separace na poly(styren-co-divinylbenzen-co-methakrylových) monolitických kolonách připravených polymerací po dobu 3 a 6 h. Je zřejmé, že zachování separační účinnosti a retence polymeru se liší ve vztahu k účinnosti polymerace a CLC účinnosti separace a CLC módu separace. Separační účinnost v CEC se zvyšuje u kolon vyrobených polymerací trvající 3 hodiny ve srovnání s 6 hodinami, s výjimkou propylbenzenu a butylbenzenu.
U CLC se retenční časy tolik neliší, zatímco účinnost separace na koloně připravené polymerací 6 hodin je více než dvojnásobná oproti polymeraci trvající 3 hodiny. 100 µm polymerační směs, stejně jako dodatečná příprava detekčního okénka pro UV detekci, je náročnější než u kapilárních kolon pro CLC (i.d. 320 µm).
Vliv elektrostatické interakce v CLC
Ze zachování a tvaru píku, který lze popsat poměrně značnou šířkou v poloviční výšce a vzplanutím, lze usoudit, že interakce bazické skupiny histidinu s kyselinou methakrylovou v monolitu je poměrně silná. Svědčí o tom i skutečnost, že při použití kyseliny octové (pH = 3,8) došlo ke společné eluci všech aminokyselin testované směsi (obr. 22). Proto, jak ukazují tyto výsledky, měly elektrostatické interakce zásadní vliv na separaci směsi ve vodě, zejména v případě histidinu.
Po zablokování elektrostatických interakcí s ionty sodíku se jeho retenční čas posunul z 6,5 min na přibližně 4,0 min. Aby bylo možné jednoznačně potvrdit existenci elektrostatických interakcí mezi aminokyselinami a kyselinou methakrylovou, bylo nutné elektrostatické interakce obnovit. Kolona byla proto promyta kyselinou octovou pH = 3,8 a jako mobilní fáze byla při další analýze směsi opět použita deionizovaná voda.
23, je zcela zřejmé, že elektrostatické interakce již byly obnoveny a všechny složky směsi byly zcela uspokojivě odděleny. 23 Chromatogram ukazující separaci směsi kyseliny asparagové (1), leucinu (2), thiomočoviny (3) a histidinu (4) pomocí CLC po promytí kyselinou octovou (pH = 3,8) před analýzou. Elektrostatické interakce mezi analytem a kyselinou methakrylovou byly také potvrzeny analýzou s použitím diethylaminu jako analytu.
Optimalizace podmínek přípravy kolon na bázi kopolymeru styrenu, divinylbenzenu a
- Vliv přídavku kyseliny methakrylové
- Vliv doby polymerizace na kolony připravené s různým přídavkem kyseliny
- Chromatografická permeabilita a separační impedance
- Morfologie a SEM
Naproti tomu kolona připravená z polymerační směsi 5 s maximálním přídavkem kyseliny methakrylové (125 ul) vykazovala několikanásobně vyšší tlak (145 bar). 8 Hodnoty zpětného tlaku (v barech) během CLC separace v závislosti na době polymerace a množství kyseliny methakrylové přidané do polymerační směsi. 9 Porovnání hodnot retenčních časů tR, rozlišení R a separační účinnosti vyjádřené počtem teoretických vrstev N na metr kolony pro jednotlivé látky ve zkušební směsi pro různé přídavky kyseliny methakrylové do polymerační směsi (doba polymerace 3 h).
10 Porovnání hodnot retenčních časů tR, rozlišení R a separační účinnosti vyjádřené počtem teoretických vrstev N na metr kolony pro jednotlivé látky ve zkušební směsi pro různé přídavky kyseliny methakrylové do polymerační směsi (doba polymerace 6 hodin). 11 Porovnání hodnot retenčních časů tR, rozlišení R a separační účinnosti vyjádřené počtem teoretických vrstev N na metr kolony pro jednotlivé látky ve zkušební směsi pro různé přídavky kyseliny methakrylové do polymerační směsi (doba polymerace 12 hodin). 12 Porovnání hodnot retenčních časů tR, rozlišení R a separační účinnosti vyjádřené počtem teoretických vrstev N na metr kolony pro jednotlivé látky ve zkušební směsi pro různé přídavky kyseliny methakrylové do polymerační směsi (doba polymerace 24 hodin).
13 jsou uvedeny hodnoty vypočtené chromatografické permeability K a separační impedance E jednotlivých kolon, které se liší přídavkem kyseliny methakrylové do polymerační směsi a dobou polymerace. 13 Vypočtená chromatografická permeabilita K a separační impedance E pro jednotlivé kolony lišící se přídavkem kyseliny methakrylové do polymerační směsi a dobou polymerace. Na OBR.
Závěr
Všechny výše uvedené výhody spolu s dosahovanými výtěžky separace, velmi nízkými náklady na přípravu a také možností přípravy a regulace stacionární fáze podle aktuálně řešeného analytického problému mohou být důvodem pro použití těchto monolitických stacionárních fází místo komerčně dostupných kolon.
Literatura
Journal of Chromatography A Minakuchi, H.; Nakanishi, K.; Soga, N.; Ishizuka, N.; Tanaka, N.: Octadecylsilylated porous silica rods as separation media for reversed-phase liquid chromatography. Lee, K.- P.: New method to prepare monolithic polystyrene-based columns for chromatographic and electrophoretic separations by means of microwave irradiation. On the separation of small molecules by nano-liquid chromatography with methacrylate-based macroporous polymer monoliths.
J.; Viklund, C.; Irgum, K.: Control of porous properties and surface chemistry in "cast" porous polymer monoliths prepared by polymerization in the presence of TEMPO. Optimization of binary porogenic solvent composition for the preparation of butyl methacrylate monoliths in capillary liquid chromatography. 106) Moravcová, D.; Jandera, P.; Urban, J.; Planeta, J.: Characterization of polymer monolithic stationary phases for capillary HPLC. A new approach to fabricate high surface area poly(styrene-co-divinylbenzene) monoliths via knitting loose chains using external cross-linkers and using these monolithic columns for small molecule separation. 132) Svobodová, A.: Monolitické kolony pro kapilární kapalinovou chromatographii.
Seznam publikací a prezentací
- Odborné články související s tématem práce
- Další odborné články
- Přednášky
- Plakátová sdělení
Monolith as a stationary phase, 16th International Symposium on Separation Science, Recent Advances in Chromatography and Capillary Electromigration Techniques, Řím, Italy.
Přílohy
Prohlášení o spoluautorství
