Biologia de Anofelinos Amazônicos. VI. Variabilidade Enzimática em ANOPHELES DARLINGI Root. (DIPTERA, CULICIDAE).

BIOLOGIA DE ANOFELINOS AMAZÔNICOS. VI. VARIABILIDADE ENZIMÁTICA EM ANOPHELES DARLINGI ROOT. (DIPTERA, CULICIDAE). (*)

Eucleia P.B. Contei (**)

Joselita Maria Mendes dos Santos (***) Wanderli Pedro Tadei (***)

RESUMO

São milatadoò /izsuZtadoA pn.zliminanzò sobn.z o polimon^ismo pn.oteA.co dz população natunals dz

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Anophzl-ZS danlÁ.ngi, pn.oce.dzntes dz duas Localidades, da n.ZQÍão amazÔnlca-hú. quzmeò [Rondônia) ζ Rodovia PÁ-422 [PaAci). Pana at, zt>tzn.ases, boi det.zct.ada vanlaçao pa n.a o locas Eòt-2 na população dz Anlquemzi, enquanto £oi mo namorico na população áa

PA-422, òzndo vznl^icadoò nzsta última, apznaò indlvZduoò com o gznõtipozyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA EÓ Í2* F/ EA Í2* F.

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A ^nzquzncia do alzío Est2*V {oi zstimada em 0,80 na população dz Anlquzmzi,, vaJLoh. zhti

multo maio A. do quz o ob&ztvado na população da 8R-/74 {Manaus/Boa Viòta), zm estudoò ant.zfilon.zs, quz {)OÍ dz 0,48. Os nzsuítadoò pana. o òistema da leucina amino pzptldaii

( LAP) iugzAzm quz a znzima ζ controlada pon. tn.es loci, apanzntemzntz monomón^icoò m ambas αλ populações.

Anopheles darlingi, do subgenero

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Ny s s o r h y n c h u s, apresenta uma ampla distribuição geográfica, ocorrendo desde o México até ao norte da Argentina, e é o principal vetor da malária humana no Brasil (Rachou, 1958; Forattini, 1962; Ferreira, 1964).

Dados de polimorfismo cromossômico foram obtidos por Kreutzer e t a l. (1972) e

Ta-dei e t a l . (1982), os quais evidenciaram que a espécie é altamente polimórfica no

cen-tro da distribuição geográfica. 0 valor médio por indivíduos obtido por esses últimos autores em populações da Amazônia, para inversões no estado heterozigoto, foi de 4,13 -0,13 e medidas realizadas em diferentes épocas do ano nessas mesmas populações evidend aram que o índice médio oscila, porém são mantidos índices elevados de heterozigotos

(Tadei ε Santos, 1982).

Estudos isoenzímicos em A. darlingi foram realizados por Santos

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( 19 79 ) e Narang

(*) Trabalho subvencionado pela FAPESP e CNPq

(**) Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP. 14100 - Ribeirão Preto - SP

et

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a l . ( 1 9 7 9 ) em populações da Rodovia B R

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- 17 ^ (Manaus/Boa Vista).

Santos estudou a genética de um sistema esterásico na fase de larva de

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bÇ instar, controlado por dois alelos denominados Es t 2 » F e Es t 2*S sendo a freqüência desse último

estimada em 0 , 5 2 . Um dado interessante obtido e a partir do estudo desse sistema isoen z i mát i c o foi a e s t i mat i v a do nume r o de mac hos que s e ac as al am c om uma f ê me a, us ando- s e

como parâmetro as freqüências desses alelos em descendentes de uma mesma postura

(San-tos et a l . , I 9 8 I ) .

Narang et al. ( 19 7 9 ) estudaram 19 loci que controlam a síntese de diferentes enzi mas e verificaram que a proporção de l o c i polimórficos é 0 , 6 3 2 e que a proporção de in-divíduos heterozigotos por l o c u s é de 0 , 1 2 5 .

0 presente trabalho é u m relato preliminar sobre um projeto no qual se pretende estudar polimorfismos cromossômicos e proteicos, em amostras de diferentes regiões que abrangem a distribuição geográfica de A . d a r l í n g i no Brasil. Até o momento, foram cole tadas amostras de Ariquemes (Rondônia), da Rodovia P A-^ 22 (Pará) e de Cruzeiro do Sul (Acre); posteriormente, as coletas deverão ser feitas em populações do Brasil Central e da região Sudeste.

As fêmeas fecundadas, coletadas na natureza, são transportadas para o laboratório para postura, isoladamente. Quando surgem as larvas, elas são mantidas até atingir o

Ί? instar e então sao utilizadas para a preparação de lâminas dos cromossomos salivares e para analise eletroforética, inicialmente de esterases e leucina-aminopeptidases. A técnica empregada é a eletroforese em gel amido ( 11¾ ) . Nas cubas, é utilizado tampão Borato 0 , 3 M , pH 8 , 6 e o gel feito com Tris-citrato Ο,ΟδΙΜ, pH 8 , 6 (Poulik, 19 5 7 ) .

A revelação das zonas indicando atividade esterãsica é feita tanto com a-naftil propionate como com propionato de umbeliferona (substrato f1uorogênico). No primeiro .caso, os géis são incubados durante aproximadamente 3 0 minutos numa mistura contendo: 100 ml de tampão fosfato 0 , 1Μ , pH 6 , 5 ; 1 ml de solução de a-naftil propionato (ll em agua: acetona, v:v) e 20 0 m g de Fast Blue RR salt. No segundo, 1 mg de propionato de umbel iferona é dissolvido previamente em 0 , 5 ml de acetona, 10 ml de tampão acetato,

0,2M, pH 5 , 5 sao adicionados ao substrato dissolvido em acetona e colocados imediatamen

te sobre o gel, que é observado sob luz U.V.

Para revelar isoenzimas da 1eucima-aminopeptida se a parte homóloga do gel acima é incubada em 10 0 ml de Tris-maleato 0 , 0 5 M , pH 6 , 0 contendo 2 5 mg de L-Ieucil β-naftila mida (previamente dissolvidas em 0 , 5 ml de dimeti1-sulfóxido) e 50 mg de Fast Garnet GBC Salt.

Resultados preliminares quanto ã análise do polimorfismo cromossômico já foram obtidos nas amostras da rodovia PA-422 e de Cruzeiro do Sul e os mesmos evidenciaram, também para essas populações, altos índices de inversões no estado heterozigoto (Tadei em desenvolvimento).

c o d i f i c a d a s p o r e s s e s l o c í f o r a m d e n o mi n a d a s d e LAP - ] a L AP - 3 , a p a r t i r d a ma i s el et r o

n e g a t i v a , c o n f o r me e s t á mo s t r a d o n a F i g u r a I .

Em r e l a ç ã o ã s e s t e r a s e s ( F i g u r a 2 ) , c o n f i r ma mo s a p r e s e n ç a d e d u a s r e g i õ e s pr i

n-c i p a i s d e a t i v i d a d e d e t e n-c t a d a s n e s s a f a s e d o d e s e n v o l v i me n t o , Es t

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- 1 e Es t - 2 , q u e j á

h a v i a m s i d o d e s c r i t o s n u ma p o p u l a ç ã o d a B R

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- 17 4 ( Ro d o v i a Ma n a u s / Bo a Vi s t a ) p o r Sant os

( 1 9 7 9 ) .

Es t- 1 mo s t r o u - s e mo n o mó r f i c a n a s d u a s p o p u l a ç õ e s a n a l i s a d a s , n o p r e s e n t e t r abal ho,

Co n t u d o , s ã o o b s e r v a d a s d u a s b a n d a s p a r a e s t e l o c u s ( F i g u r a 2 ) i n d i c a n d o q u e , pos s i ve l

-me n t e , p o s s a s e r p r o d u t o d e d o i s a l e l o s . En t r e t a n t o , o n ú -me r o d e i n d i v í d u o s a na l i s a dos

a i n d a ê p e q u e n o p a r a o b s e r v a ç ã o d e v a r i a b i l i d a d e n e s s a r e g i ã o e o s d a d o s s e r ã o a mpl i a

-d o s p a r a e s t u -d o -d e s t a e s t e r a s e . Qu a n t o a Es t - 2 , -d a me s ma ma n e i r a c o mo r e l a t a -d o para

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I

a mo s t r a s d a BR- 1 7 4 , mo s t r o u - s e p o l i mó r f i c a , ma s s o me n t e n a p o p u l a ç ã o d e Ar i q u e me s onde

e n c o n t r a mo s s e g r e g a ç ã o d o s d o i s a l e l o s Es t 2 * S e Es t 2 * F ( F i g u r a 3 ) . Na p o p u l a ç ã o da

Ro-d o v i a P A- 4 2 2 , e n c o n t r a mo s s o me n t e i n Ro-d i v í Ro-d u o s c o m g e n õ t i p o Es t 2 * F / Es t 2 * F e n q u a n t o que a

f r e q ü ê n c i a d o a l e l o Es t 2 * F n a p o p u l a ç ã o d e Ar i q u e me s f o i e s t i ma d a e m 0 , 8 0 . Es s e val or

r e v e l o u - s e mu i t o ma i o r q u e o e s t i ma d o p a r a a BR- 1 7 ^ o q u a l , c o n f o r me j á r e l a t a d o no

i n í c i o d e s s a c o mu n i c a ç ã o , f oi d e 0, 4 8 .

ABSTRACT

We

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have, rzlatzá przUminary rzsults on protzln polymorphism in two natural popuh

tlonò oi Anophelzs darltngl iòrom thz Amazon rzgion [Arlqumzs, òtatz oíò Rondônia, and

thz Highway PA- 4 2 2 , in thz òtat-z oi

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 ΡΟΛΆ ), for thz zMerahzs there MAC. obòzrvzd VOAÁ& I 

tlons in thz tocai

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tòt-l in thz krlquzmes population, wkilz tiiis locub was ntoyiomoiphic \ in thz Highway PA- 4 2 2 population. In thz latzr population we ^ o i md individuais s howi ng

thz gznotypz E6t2-=¥/E6t2*f. Thz aJULzlz irzquzncy

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E4-tZ*F has b e e n zstimatzd at 0,80 in

thz population of, Ariquemes, this valuz bzlng much hlghzr than thz. onz fizlatzd to om

pMviouA òtudy on thz Highway BR-174 (ManauS/Boa Vista) which wa-i 0,48. Thz titetdto

concerning Izuclnz-aminopeptidases (LAP) mggzst that this e.nzymz is controlled bij

( LAP- I )

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nune zfovari

( L AP

I) dar Ungi

L AP - 2

L AP - 3

2 3

Figura 1. Isoenzimas de LAP (leucina-aminopeptidases) de larvas de Anopheles darling (amostras 1,3 e 4) e de nuneztovarí. Notar a identidade de migração enti LAP-2 e LAP-3 nas duas espécies. Gel de amido, pH 8.6. Migração segundo

seta.

1 2 )

b e d e t ς α b c d e t g

( 2 )

4

2 3 4 5 6 7

p H 8, 6 9 10 II 12 13 14

Figura 3. Perfil comparativo das esterases de larvas de

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Anopheles darlíngi usando-se a mido (1) e poliacrilamida (2) como meio suporte. As amostras 3 e 5 no gel

Referencias bibliográficas

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