Passeando pela interação microrganismo-hospedeiro: responsividade inflamatória e suas implicações frente a relações mutualísticas e parasitárias

(1)

Caio Tavares Fagundes

(2)

Tese apresentada ao Programa de

Pós Graduação

em

Bioquímica

e

Imunologia do Instituto de Ciências

Biológicas, da Universidade Federal de

Minas Gerais, como requisito parcial

para a obtenção do título de doutor em

Ciências: Imunologia.

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Prof. Dr. Mauro Martins Teixeira

(Depto. de Bioquímica e Imunologia, ICB/UFMG)

Profa. Dra. Danielle da Glória de Souza

(Depto. de Microbiologia, ICB/UFMG)

()"&

Caio Tavares Fagundes

Belo Horizonte

(3)

(4)

IV

!

"

(5)

V

“Todos nós sabemos alguma coisa.

Todos nós ignoramos alguma coisa.

Por isso, aprendemos sempre.”

&

“... E, afora este mudar se cada dia,

Outra mudança faz de mor espanto,

Que não se muda já como soia.”

'

( )

*

“Understanding evolution´s inner

workings requires understanding the full

range of life´s possibilities.”

(6)

VI

Agradeço ao meu orientador Mauro, eterno Chefe, pela confiança em mim

depositada, pelo apoio e incentivo quase que contínuos e incondicionais, pela

liberdade de pensar, criar e sugerir a mim concedida e pelos competentes, práticos e

imprescindíveis ensinamentos. Com certeza, este trabalho seria bem diferente, não

fosse, ainda que ao largo, a mão condutora dele;

Agradeço à Dani, mais que orientadora e chefa, uma grande amiga.

Eesponsável por todo o meu aprendizado científico, da bancada à escrita e forma de

pensar. Caminharão sempre comigo, a confiança, o apoio, o incentivo e o interesse

constante que sempre demonstrou no dia a dia. Serei eternamente grato também pela

forma desenvolta, entusiasmada, divertida e extremamente competente de encarar a

ciência, desde o mais tenro início da minha experiência acadêmica. Sem dúvida, essa

postura foi essencial para que me sentisse tão bem no cotidiano científico. Espero

poder passar isso adiante, ainda que seja impossível reproduzir tudo, com tanta

maestria.

Um muitíssimo obrigado aos professores Jacques Nicoli, do Departamento de

Microbiologia, e Oeda Vieira, do Departamento de Bioquímica e Imunologia, pela

grande disponibilidade e ajuda, materializada em camundongos e sugestões. Ainda, à

Profa. Tarcília Silva, da Faculdade de Odontologia, pela grande ajuda com análises

histológicas. Muito obrigado também aos Dr. Bernhand Eyffel e Dra. Valerie

Quesniaux (IEM/Orléans, França), pela acolhida e pela oportunidade de conduzir

experimentos em seu laboratório. Agradeço também ao Dr. George Ignatyev e à Dra.

Alena Atrasheuskaya, que nos propiciaram o trabalho com o modelo de infecção por

Dengue. Por fim, agradeço ao Prof. Dario Zamboni (FMEP/USP, Eibeirão Preto), pela

(7)

VII

Agradeço aos membros do programa de Pós graduação em Bioquímica e

Imunologia, pelo suporte, em especial à secretária Celise, pela paciente e eficaz

disponibilidade. Ao CNPq, pelo apoio financeiro durante toda a minha formação

acadêmica, às demais agências financiadoras, FAPEMIG e INCT em dengue, pelo

suporte ao trabalho. Agradeço ainda, aos membros da banca examinadora, pelo

interesse e disponibilidade.

Muito obrigado também, com grande carinho, aos meus familiares, Carlos,

Tânia, Daniel, Pedro e Tiago, suporte e apoio incondicionais e insubstituíveis. E

também, grande exemplo de dedicação, superação e retidão. Ainda, por me trazerem,

nas mais improváveis circunstâncias, a diversão e o prazer em bem viver.

Agradeço à Oanda, minha co orientadora extra oficial preferida, imprescindível

durante meus primeiros passos científicos. À Vanessa, tão importante também neste

início. Ao amigo Flávio, irmão de vida acadêmica e de sofrimento alvinegro. Obrigado

pelas incontáveis ajudas e pelas estórias únicas e hilariantes. Ainda, obrigado à Angel,

Kátia, Oívia Barroso, Cristiano, à Juliana e Oouisa, e ao Daniel, não só pelo auxílio

diário, mas pelos melhores “terceiros turno” e ,- da história científica

contemporânea. Ao mesmo Daniel e, mais recentemente, ao Fernando, pela

oportunidade de aprender ensinando. Ainda, um agradecimento especial à Vívian, de

capacidade e dedicação inspiradoras, que foi essencial para que boa parte desse

trabalho se completasse. Também agradeço à minha prima Oívia, pela grande ajuda e

por trazer um quê “caseiro” e familiar pro laboratório.

Agradeço também ao . / imunofar, Eemo, Eodrigo, Cris, Flávio

Oopes, Dani Sachs, Fernanda Coelho, Tiça, Adriano, Oucíola, Oetícia, Ester, Hélton,

Adriana, Carol, Eafael Soares, Antônio Oúcio, Norinne, David, Márcia e Marina, e aos

integrantes mais recentes do grupo, também essenciais, Mila, Celso, Thiago, Deborah,

(8)

VIII

Adaliene, Zélia, Eaquel, Eenata, Talles, Paty Campi, Sílvia, Oívia, Fernanda Ferraz,

Ouana, Oísia e Fátima, e tantos outros bons amigos que fizeram tanto e tornaram o dia

a dia no laboratório tão intenso e enriquecedor. Agradeço ainda à presença prestativa

e amiga de Valdinéria, Gilvânia, Ilma, Frank e Mirla. Por fim, obrigado à Érica Oeandro,

Tatjana Keesen e Diogo Magnani, do departamento de Bioquímica e Imunologia, por

me abrirem os caminhos da citometria de fluxo.

Enfim, um muito obrigado a todos, lembrados ou não aqui, pela colaboração

(9)

IX

ácido araquidônico

,- – acentuação da infecção dependente de

anticorpos

camundongo deficiente para os receptores de interferon gama, alfa e beta

ácido lisofosfatídico

receptor de anexina 1 e lipoxina

anexina 1

alanina aminotransaminase

- – célula apresentadora de antígenos

0 1 – proteína adaptadora contendo

domínio pirina e domínio de recrutamento e ativação de caspases

apartato aminotransferase

adenosina trifosfato

bacilo de Calmette Guérin

2 3 4proteína externa putativa N de 2

– albumina de soro bovino

6 O butanoyl castanospermine

– proteína do capsídeo

! fator 5 do sistema complemento

""

íon cálcio

, - , , 4 síndrome da resposta

anti inflamatória compensatória

#$ quimiocina da fmília CC ()

#$ receptor de quimiocina da família CC ()

#$ () – cluster de diferenciação ()

%& centimetro – unidade de comprimento

dióxido de carbono

! - , , 5 – membro A da família do domínio

de lecitina do tipo C

receptor do tipo lecitinas do tipo C

(10)

X

animal convencional

animal GF convencionalizado

#$ quimiocina da família CXC ()

#$ receptor de quimiocina CXC ()

- 4padrão molecular associado a dano

tecidual

3 6- 78 $ – proteína ativadora de DNAX de

12 kilodaltons

– células dendríticas

-

– molécula de adesão intracelular 3 ligada a não integrina específica de células dendríticas

#$ Dengue vírus sorotipo ()

febre do dengue

' febre hemorrágica do dengue

- : ; : < – meio de Eagle modificado por

Dulbecco

ácido desóxirribonucléico

( deoxinojirimicina

) ENA de fita dupla

4proteína do envelope

, 4 ácido etilenodiamino tetra acético

), $ ,– ensaio imunosorvente ligado a enzima

erro padrão da média

retículo endoplasmático

espécies reativas de nitrogênio

%γγγγ receptor de porção Fc de imunoglobulina G

febre do dengue

' febre hemorrágica do dengue

*+ – peptídeo Bβ15 45

, grama – unidade de massa

complexo de golgi

(11)

XI

receptor acoplado à proteína G

-./ 0 =>-$ - ? - –

proteína regulada por glucose de 78 kilodaltons/proteína ligadora de imunoglobulina

guanina trifosfato

1 hora – unidade de tempo

' vírus da hepatite C

' – vírus da imunodeficiência humana

' , 2 @ 7 4proteína do @ 1 do grupo de alta

mobilidade

' peróxido de hidrogênio

' 2 ácido sulfúrico

' #$- $ 4Proteína de choque térmico ()

' – @ , , – brometo de haxadeciltrimetilamônio

#$ receptor de interferon gamma ()

γ γ γ

γ/ββββ – receptor de interferon alfa e beta

γ γ γ

γ interferon alfa

β ββ

β interferon beta

γγγγ interferon gamma

, imunoglobulina A

, imunoglobulina G

, imunoglobulina M

#$ Interleucina ()

* receptor de IO 10

β β β

β#$ cadeia beta () do receptor de IO 12

. receptor de IO 18

03%3 intracerebral

03)3 intradermal

03 3 intraperitoneal

/ isquemia e reperfusão intestinal

03 3 intra traqueal

0343 intravenoso

(12)

XII

5 $ $- – geneticamente deficient para determinado gene

5 A

– lipopolissacarídeo

? , -

ácido lipoteicóico

– lipoxina

2 lipoxina A4

molar – unidade de medida de concentração

4proteína de membrana

- 4padrão molecular associado a

microrganismos

proteína quimioatraente de monócitos (CCO2)

; : meio de Eagle modificado

' #$ complexo principal de histocompatibilidade ()

fator inibidor da migração de macrófagos

&0& minutos – unidade de tempo

#$ proteína inflamatória de monócitos ()

& mililitro – unidade de volume

&& milímetro quadrado – unidade de área

mieloperoxidase

– receptor de manose

ministério da saúde

6 metiltransferase

difosfato de mevalonato descarboxilase

7 .. , , B>>C 4gene de resposta

primária a diferenciação mielóide 88

8 número de repetições

núcleo

9 cloreto de sódio

' nicotinamida adenina dinucleótido fosfato

(13)

XIII

nucleocapsídeo

não detectável

animal não infectado

5 $ – assassina natural

receptor do tipo NOD

: 3'1 , , 9 4proteína da família NOE

contendo domínio pirina 3

8& nanômetro – unidade de comprimento

inibidores de transcriptase reversa não nucleosídeos

@ 4óxido nitrico

nível de efeito adverso não observado

) 4domínio de oligomerização a nucleotídeo

#$4 @ , 4 Dxido nítrico sintase

#$ - BC – proteína não estrutural ()

grau Celsius, escala de medida de temperatura

optical density – densidade óptica

organização mundial da saúde

- , – diidrocloreto de o fenilenediamina

/4 peso por volume – unidade de medida de concentração

fator de agregação plaquetária

receptor de fator de agregação plaquetária

- – padrão molecular associado a

patógenos

- - – salina tamponada por fosfato

- 4unidade formadora de placas

, picograma – unidade de massa

0– post infection

proteína ligante de cauda poli adenina

; - – proteína pré membrana

4receptor de reconhecimento de padrões

(14)

XIV

8 – gene ativador de recombinação 2

) 13 13 , – ENA polimerase dependente de ENA

retículo endoplasmático

:γγγγ r - 9- – proteína derivada de ilhotas em

regeneração 3 gama

r 4 E 4gene I induzido por ácido retinóico

receptor do tipo EIG I

ácido ribonucleíco

rede trans golgi

- , – reação em cadeia de

transcriptase reversa polimerase

** #$ %7FF BC 4proteína S100 ligante de cálcio A ()

síndrome de choque do dengue

– - , imunodeficiencia severa combinada

, – duodecilsulfato de sódio

– soro fetal bovino

0 pequeno ENA de interferência

s, , , 4síndrome da resposta inflamatória

sistêmica

artéria mesentérica superior

ENA de fita simples

#$ s BC – proteína

transdutora de sinal e ativadora de transcrição ()

secretaria de vigilância sanitária

trato gastro intestinal

1#$ linfócitos T auxiliares do tipo ()

$ -7 4 receptor toll interleucina 1

#$ receptor do tipo ()

γ γ γ

γ - – fator de necrose tumoral alfa

/& unidade por mililitro, unidade de medida de concentração

=' – organização mundial da saúde

= " , selvagem

(15)

XV

microlitro – unidade de volume

(16)

XVI

Hospedeiros e microrganismos se associam numa miríade de relações que

variam ao longo de um amplo contínuo, estabelecendo, num extremo, relações de

cooperação mútua, até relações conflituosas, muitas vezes patogênicas, no outro

extremo. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da microbiota indígena na

responsividade inflamatória do hospedeiro e os possíveis resultados dessa

responsividade durante o encontro com microrganismos patogênicos. Mais

especificamente, o trabalho demonstra que a colonização por uma microbiota indígena

é acompanhada da mudança da responsividade do hospedeiro a estímulos

inflamatórios, passando de um estado caracterizado pela produção inata de

mediadores anti inflamatórios para a rápida liberação de mediadores inflamatórios e

mobilização de leucócitos. Esta mudança é essencial para que o hospedeiro seja

capaz de controlar um insulto infeccioso. Ainda, o trabalho demonstra que a produção

de determinados mediadores inflamatórios é essencial para a resistência do

hospedeiro à infecção pelo Dengue vírus, um importante patógeno humano. Em

contrapartida, determinados mediadores inflamatórios produzidos pelo hospedeiro em

resposta à infecção pelo Dengue vírus acabam por exercer um papel patogênico,

levando ao agravamento da doença e acentuando a susceptibilidade do hospedeiro à

infecção. Assim, a colonização do hospedeiro por microrganismos indígenas confere a

ele a capacidade de responder a estímulos inflamatórios. Essa capacidade é essencial

para que o hospedeiro possa lidar com microrganismos parasitas. No entanto, essa

capacidade de produzir mediadores inflamatórios e mobilizar leucócitos representa

também o potencial em causar dano tecidual durante o encontro com agentes

infecciosos. Portanto, a responsividade inflamatória do hospedeiro está diretamente

associada ao resultado dos diversos tipos de relações ecológicas estabelecidas entre

(17)

XVII

Microorganisms and their host interact in myriad of states along a continuum,

ranging from mutualistic relationships, in one extreme, to conflictuous, frequently

pathogenic relationships, in the other edge. The aim of the present work was to

evaluate the relevance of indigenous microbiota for host inflammatory responsiveness

and the potential outcomes of this inflammatory responsiveness during encounters with

pathogenic microorganisms. Specifically, results presented here demonstrate that, after

colonization by indigenous microbiota, there is a shift in host responsiveness upon

inflammatory stimuli, from innate anti inflammatory mediator production to rapid release

of inflammatory mediators and leukocyte mobilization. This altered pattern of

inflammatory mediator production is essential for the host ability to control an infectious

insult. In addition, the work presented here shows that production of some

inflammatory mediators is indispensable for host resistance to infection by Dengue

virus, an important human pathogen. On the other hand, some inflammatory mediators

released during host response to Dengue virus infection play a pathogenic role, leading

to more severe disease manifestation and to increased host susceptibility to infection.

Therefore, host colonization by indigenous microorganisms enables its responsiveness

to inflammatory stimuli. This gained ability is essential for the host to deal with parasitic

microorganisms. However, the capacity of producing inflammatory mediators and

mobilizing leukocytes confers the potential to cause tissue damage upon interaction

with infectious agents. Thus, host inflammatory responsiveness is directly associated to

the outcome of the several ecological relationships established between a host and any

(18)

XVIII

?

... VI

... IX

... XVI

... XVII

... XX

3 @

... 21

1.1

Interações Microrganismo Hospedeiro ... 22

1.2

A interação mutualística com a microbiota indígena intestinal e as alterações fisiológicas advindas do estado não colonizado ... 25

1.3

- _{Interações com microrganismos patogênicos e a infecção pelo vírus da}

Dengue ... 33

1.4

A resposta inflamatória ... 46

1.5

O controle da responsividade inflamatória do hospedeiro pela microbiota indígena e a Síndrome da resposta inflamatória sistêmica em infecções ... 56

3 (

(

... 61

3 '

... 64

3.1

The required role of endogenously produced lipoxin A4 and annexin 1 for the production of IO 10 and inflammatory hyporesponsiveness in mice VVVV.. 65

3.2

Transient TOE activation restores inflammatory responsiveness and ability to

control pulmonary bacterial infection in germ free mice

VVVVVVVV.. 77

3.3

Control of host inflammatory responsiveness by indigenous microbiota reveals an adaptive component of the innate immune system VVVVVVVVV.. 88

3.4 IFN γ Production Depends on IO 12 and IO 18 combined action and Mediates Host Eesistance to Dengue Virus Infection in a Nitric Oxide Dependent Manner

VVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVV. 101

3.5

Essential role of platelet activating factor receptor in the pathogenesis of Dengue virus infection VVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVV. 114

3.6

Therapeutic opportunities in Dengue infection VVVVVVVVVVVV. 121

(19)

XIX

(20)

XX

0, ; 3 Distribuição sítio específica dos filos bacterianos em humanos saudáveis

... 25

0, ; 3 Visão esquemática dos benefícios advindos da relação mutualística entre

um hospedeiro mamífero e sua microbiota intestinal indígena ... 29

0, ; :3Presença da dengue ao redor do globo terrestre ... 37

0, ; 23Ciclo de transmissão do vírus da Dengue ... 38

0, ; !3 Eepresentação esquemática do ciclo de vida do DENV em uma célula de

mamífero ... 41

0, ; +3Curso temporal dos sinais clínicos sintomas das formas de manifestação da

infecção pelo DENV ... 43

0, ; -3 Eepresentação esquemática dos componentes da resposta inflamatória

... 46

0, ; .3 Eepresentação esquemática da indução da produção de IFN γ por outras

citocinas ... 53

0, ; 3 Eepresentação esquemática da ação de mediadores anti inflamatórios e

pró resolutivos ... 55

0, ; *3 O controle da responsividade inflamatória do hospedeiro pela microbiota

(21)

(22)

22

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(66)

The Required Role of Endogenously Produced Lipoxin A

₄

and

Annexin-1 for the Production of IL-10 and Inflammatory

Hyporesponsiveness in Mice

1 Danielle G. Souza,*

†

Caio T. Fagundes,*

†

Flavio A. Amaral,*

†

Daniel Cisalpino,*

†

Lirlaˆndia P. Sousa,* Ange´lica T. Vieira,* Vanessa Pinho,*

‡

Jacques R. Nicoli,

†

Leda Q. Vieira,*

Iolanda M. Fierro,

§

and Mauro M. Teixeira

2

*

The appropriate development of an inflammatory response is central for the ability of a host to deal with any infectious insult. However, excessive, misplaced, or uncontrolled inflammation may lead to acute or chronic diseases. The microbiota plays an important role in the control of inflammatory responsiveness. In this study, we investigated the role of lipoxin A4and annexin-1 for the IL-10-dependent inflammatory hyporesponsiveness observed in germfree mice. Administration of a 15-epi-lipoxin A₄ analog or an annexin-1-derived peptide to conventional mice prevented tissue injury, TNF-␣ production, and lethality after intestinal ischemia/reperfusion. This was associated with enhanced IL-10 production. Lipoxin A₄and annexin-1 failed to prevent reperfusion injury in IL-10-deficient mice. In germfree mice, there was enhanced expression of both lipoxin A4and annexin-1. Blockade of lipoxin A₄synthesis with a 5-lipoxygenase inhibitor or Abs against annexin-1 partially prevented IL-10 production and this was accompanied by partial reversion of inflammatory hyporesponsiveness in germfree mice. Administration of BOC-1, an antagonist of ALX receptors (at which both lipoxin A₄and annexin-1 act), or simultaneous administration of 5-lipoxygenase inhibitor and anti-annexin-1 Abs, was associated with tissue injury, TNF-␣production, and lethality similar to that found in conventional mice. Thus, our data demonstrate that inflammatory responsiveness is tightly controlled by the presence of the microbiota and that the innate capacity of germfree mice to produce IL-10 is secondary to their endogenous greater ability to produce lipoxin A₄and annexin-1. The Journal of Immunology,2007, 179: 8533– 8543.

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he appropriate development of an inflammatory response is central for the ability of a host to deal with any infec-tious insult. Indeed, leukocyte recruitment and activation are essential for Ag processing and presentation, for lymphocyte priming and for the effector functions (such as Ab production and cell-mediated immunity) of any immune response (1). In the ab-sence of inflammation, lethality is the usual outcome after an in-fectious challenge. In contrast, excessive, misplaced, or uncon-trolled inflammation is commonly the cause of death after infection. Inflammation does not only occur in the presence of an infectious insult, but is also a common denominator of the tissue response to stressful stimuli of diverse nature (chemical, mechan-ical, infectious, etc.). In fact, the list of human diseases associated with inappropriate or uncontrolled inflammation in response to stimuli of known or unknown origin is growing and include isch-emia and reperfusion injury, rheumatoid arthritis, asthma, chronic

obstructive pulmonary disease, multiple sclerosis, and atheroscle-rosis (2– 4). In the latter conditions, tissue inflammation is clearly deleterious and inhibition of the inflammatory response may be of therapeutic benefit.

In mice, reperfusion of the ischemic superior mesenteric artery is followed by severe local (intestine) and remote (lungs) tissue pathology, characterized by marked neutrophil influx, edema for-mation, hemorrhage, and tissue destruction (5). Not only is there tissue damage, but also marked systemic inflammation, as assessed by the elevation in the serum concentration of proinflammatory cytokines and chemokines (5). In contrast to these findings, germ-free mice, which have no detectable bacteria (and indeed, no other known pathogen) in their gut, presented little evidence of local or systemic injury after intestinal ischemia and reperfusion (6). The inability of germfree mice to inflame in response to systemic LPS or reperfusion-induced injury was largely because of the innate capacity of these mice to produce IL-10 and, possibly, other anti-inflammatory molecules (6). Indeed, blockade of IL-10 production in germfree mice was accompanied by reversal of inflammatory hyporesponsiveness and significant inflammatory responses to in-testinal reperfusion or LPS administration. Moreover, reposition of the microbiota was accompanied by loss of the ability to produce IL-10 and regained ability to inflame in response to diverse stim-ulation (6). Thus, the latter results suggested that the lack of mi-crobiota was accompanied by a state of active IL-10-mediated in-flammatory hyporesponsiveness.

There is growing evidence that, during an inflammatory re-sponse, there are active processes and mediators which prevent excessive inflammation, the so-called “mechanisms of anti-inflammation” (7), and that may induce resolution of inflammation (8). There has been much recent interest in a series of mediators of *Departamento de Bioquı´mica e Imunologia;†_{Departamento de Microbiologia;}‡

De-partamento de Morfologia, Instituto de Cieˆncias Biolo´gicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Brazil; and§_{Departamento de Farmacologia, Instituto}

de Biologia, Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil

Received for publication October 16, 2006. Accepted for publication October 9, 2007.

The costs of publication of this article were defrayed in part by the payment of page charges. This article must therefore be hereby markedadvertisementin accordance with 18 U.S.C. Section 1734 solely to indicate this fact.

1_{This work was supported by Fundac¸a˜o de Amparo a` Pesquisa do Estado de Minas}

Gerais and Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnolo´gico.

2_{Address correspondence and reprint requests to Dr. Mauro Martins Teixeira,}

De-partamento de Bioquı´mica e Imunologia, Instituto de Ciencias Biologicas, Univer-sidade Federal de Minas Gerais, Av. Antonio Carlos, 6627 – Pampulha, Brazil. E-mail address: mmtex@icb.ufmg.br

The Journal of Immunology

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the inflammatory process which possess significant anti-inflammatory actions when given exogenously, including lipoxin A4 (LXA4)3 and annexin-1 (ANXA-1, previously referred to as

lipocortin-1) (9 –12). The mechanisms by which these molecules modulate the inflammatory response are not clearly shown and a recent study suggested that control of SOCS-2 activation might be relevant for the action of LXA4under certain conditions (13). It

has been demonstrated that activation of the LXA4receptor

down-regulates polymorphonuclear (PMN) responses in vitro and pro-motes resolution of inflammation through up-regulation of NAB1, a transcriptional corepressor identified previously as a glucocorti-coid-responsive gene (14). It is also possible that the effects of LXA4and ANXA-1 may be mediated by the release of molecules

with anti-inflammatory effect. For example, ANXA-1 may func-tion via the release of IL-10 (15). Less is known about the possi-bility that “mediators of anti-inflammation” are capable of con-trolling the inflammatory process when released endogenously (16). In this regard, germfree mice could provide a powerful tool for a better understanding of the mechanisms and mediators in-volved in the control of inflammation. In the present study, using a mixture of immunological, biochemical, and pharmacological approaches, we evaluated the functional relevance of LXA4 and

ANXA-1 release and activation of their shared ALX receptor for IL-10 production and the inflammatory hyporesponsiveness ob-served in germfree mice.

Materials and Methods

Animals

Germfree Swiss/NIH mice were derived from a germfree nucleus (Taconic Farms) and maintained in flexible plastic isolators (Standard Safety Equip-ment) using classical gnotobiology techniques (17). Conventional Swiss/ NIH mice are derived from germfree matrices and considered conventional only after two generations in the conventional facility. All experimental procedures in germfree mice were conducted under aseptic conditions to avoid infection of animals. C57BL/6 or IL-10-deficient mice (8 –10 wk), obtained from the Bioscience Unit of Instituto de Cieˆncias Biolo´gicas (Bra-zil), were housed under standard conditions and had free access to com-mercial chow and water. All animals were 8- to 10-wk-old males and females, and the experimental protocols used were approved by the animal ethics committee of Universidade Federal de Minas Gerais.

Treatment protocols

To evaluate the role of LXA4and ANXA-1 in intestinal ischemia and reperfusion model several experimental protocols were performed. 1) To reproduce the action of LXA4 and ANXA-1, conventional mice were treated with their respective mimetics, the 15-epi-LXA4analog ATL-1 (5

␮g/mouse—a generous gift from Brigham and Women⬘s Hospital, Harvard

Medical School, Boston, MA) (18) or the peptide Ac2–26 (10 mg/kg) (19), i.v. 10 min before reperfusion. 2) To prevent the action of LXA4and ANXA-1, mice were treated with the ALX antagonist BOC-1 (2.0 mg/kg) (20), the 5-lipoxygenase inhibitor ZM230487 (5 mg/kg) (21) or the BLT1/2 antagonist CP-105696 (3 mg/kg) (22) i.v. 10 min before reperfusion, or with anti-ANXA antiserum (0.2 ml of hyperimmune serum/animal), or the Cys-LT antagonist Montelukast (5 mg/kg,) (23) s.c. 30 min before fusion. As nonimmune serum had no effect on the injury induced by reper-fusion of the ischemic superior mesenteric artery (SMA) (data not shown), results in nonimmune serum- and vehicle-treated animals were pooled for presentation.

Ischemia and reperfusion

Mice were anesthetized with urethane (1400 mg/kg, i.p.) and laparotomy was performed. The SMA was isolated and ischemia was induced by to-tally occluding the SMA for 60 min. For measuring percentage of surviving mice, reperfusion was re-established, and mice were monitored for the indicated time periods. For the other parameters, reperfusion was allowed to occur for the indicated period of time before sacrifice. Sham-operated animals were used as controls.

Evaluation of changes in vascular permeability

The extravasation of Evans blue dye into the tissues was used as an index of increased vascular permeability, as previously described (24, 25). Briefly, Evans blue (20 mg/kg) was administered i.v. (1 ml/kg) via a tail vein 2 min before reperfusion of the ischemic artery. Thirty min-utes after reperfusion, a segment of the duodenum (⬃3 cm) or the flushed left lung were cut in small pieces and Evans blue extracted using 1 ml of formamide. The amount of Evans blue in the tissue (␮g

of Evans blue per 100 mg of tissue) was obtained by comparing the extracted absorbance with that of a standard Evans blue curve read at 620 nm in an ELISA plate reader.

Myeloperoxidase concentrations

The extent of neutrophil accumulation in the intestine and right lung tissues was measured by assaying myeloperoxidase activity, as previously de-scribed (25, 26). Briefly, a portion of duodenum and the flushed right lungs of animals that had undergone ischemia/reperfusion injury were removed and snap frozen in liquid nitrogen. Upon thawing and processing, the tissue was assayed for myeloperoxidase activity by measuring the change in OD at 450 nm using tetramethylbenzidine. Results were expressed as total number of neutrophils by comparing the OD of tissue supernatant with the OD of casein-elicited murine peritoneal neutrophils processed in the same way.

Measurement of hemoglobin concentrations

The determination of hemoglobin concentrations in tissues was used as an index of tissue hemorrhage. After washing and perfusing the intes-tines to remove excess blood in the intravascular space, a sample of

⬃100 mg of duodenum was removed and homogenized in Drabkin’s color reagent according to instructions of the manufacturer (Analisa). The suspension was centrifuged for 15 min at 3000 ⫻gand filtered using 0.2␮m filters. The resulting solution was read using an ELISA

plate reader at 520 nm and compared against a standard curve of hemoglobin.

Measurement of mRNA expression by real-time RT-PCR

Total RNA was isolated from intestine using RNeasy mini kit (Qiagen). The RNA obtained was resuspended in diethylpyrocarbonate-treated water and stocked at⫺70°C until use. Real-time RT-PCR was performed on an ABI PRISM 7900 sequence detection system (Applied Biosystems) using SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) after reverse tran-scription reaction of 2␮g of RNA using M-MLV reverse transcriptase

(Promega). The relative level of gene expression was determined by the comparative threshold cycle method as described by the manufacturer, whereby data for each sample were normalized to hypoxanthine phospho-ribosyltransferase and expressed as a fold change compared with naive animals. The following primer pairs were used: for hypoxanthine phos-phoribosyltransferase, 5⬘-TTGGTTACAGGCCAGACTTTGTTG-3⬘ (for-ward) and 5⬘-GAGGGTAGGCTGGCCTATAGGCT-3⬘(reverse); foril-10 5⬘-GCTCTTACTGACTGGCATGAG-3⬘ (forward) and 5⬘ -CGCAGCT-CTAGGAGCATGTG-3⬘(reverse).

Western blot

One hundred milligrams of duodenum of sham-operated and reperfused animals were homogenized in 1 ml of cell lysis buffer (1% Nonidet P-40, 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 20% glycerol, 0.2 mM EDTA, 1 mM NaPO3, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 200 mM NaCl, leupeptin, and apro-tinin). The samples were then centrifuged for 10 min at 3000⫻gand the supernatant was collected, and total protein concentration was de-termined according to the instructions of Bio-Rad assay kit. To detect ANXA-1, protein extracts (30␮g) were loaded onto a 10% SDS-PAGE

for electrophoresis together with the appropriate m.w. markers and transferred to ECL Hybond nitrocellulose membrane. Reversible pro-tein staining of the membranes with 0.1% Ponceau S in 5% acetic acid was used to verify even protein transfer. Membranes were incubated for 1 h at room temperature in 5% nonfat dry milk in PBS with 0.1% Tween 20 (PBST). The membranes were washed three times for 5 min with PBST and incubated overnight with rabbit hyperimmune serum anti-ANXA-1 (1:100) in PBST with 5% BSA. After new washing, the mem-branes were incubated for 60 min at room temperature with peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (1:600), and immunoreactive proteins were detected using an ECL kit (Amersham Biosciences). Relative band intensity was quantified using NIH image software 1.63.

3_{Abbreviations used in this paper: LXA}

4, lipoxin A4; ANXA-1, annexin-1; SMA,

superior mesenteric artery; PMN, polymorphonuclear; LT, leukotriene.