Síntese e avaliação da atividade antitumoral de nanogéis de fucana A da alga marrom Spatoglossum schöederi (C. Agardh) Kützing

(1)

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

SÍNTESE E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DE NANOGÉIS DE

FUCANA A DA ALGA MARROM

Spatoglossum schröederi

(C.Agardh)

Kützing

JAILMA ALMEIDA DE LIMA

(2)

SÍNTESE E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DE NANOGÉIS DE

FUCANA A DA ALGA MARROM

Spatoglossum schröederi

(

C.Agardh)

Kützing

Tese apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Ciências da Saúde da

Universidade Federal do Rio Grande do

Norte como requisito para a obtenção do

título de Doutor em Ciências da Saúde.

Orientador:

Prof. Dr. Hugo Alexandre de O. Rocha

(3)

CATALOGAÇÃO NA FONTE

L732s

Lima, Jailma Almeida de.

Síntese e avaliação da atividade antitumoral de nanogéis de fucana A da alga marrom Spatoglossum schöederi (C. Agardh) Kützing / Jailma Almeida de Lima. – Natal, 2014.

106f. : il.

Orientador: Prof. Dr. Hugo Alexandre de O. Rocha.

Tese (Doutorado) – Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde. Centro de Ciências da Saúde. Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

1. Fucanas – Tese. 2. Polissacarídeos sulfatados – Tese. 3. Atividade antitumoral – Tese. 4. Nanogéis – Tese. I. Rocha, Hugo Alexandre de O. II. Título.

(4)

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde:

(5)

JAILMA ALMEIDA DE LIMA

SÍNTESE E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DE NANOGÉIS DE

FUCANA A DA ALGA MARROM

Spatoglossum schröederi

(

C.Agardh)

Kützing

Aprovada em: 21 / 03 / 2014

Banca Examinadora:

Presidente da Banca:

Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha (UFRN)

Membros da Banca

Profa. Dra Valéria Soraya de Farias Sales (UFRN)

Prof. Dr. Artur da Silva Carriço (UFRN)

Profa. Dra. Valquíria Pereira de Medeiros (UFJF)

(6)

Dedico esta obra

A Deus.

Só tenho que agradecer-Te. Obrigada, Senhor, por tudo! Grande é a sua Bondade e Misericórdia!

A minha Mãe, Francisca (Rosa).

(7)

Dedico esta obra

A Hugo Rocha,

O meu eterno agradecimento por ser um educador nato, e por proporcionar não só a mim, mas todos ao seu redor, a possibilidade de crescimento e busca por algo melhor. Obrigada, Hugo, por tudo!

A Família BIOPOL,

Obrigada a todos àqueles que fazem ou que já fizeram parte desta história...

Dayanne (Dayn ou amigan), Mariana, Sara, Karol, Cinthia, Leandro, Diego (Popó), Ruth, Rafael, Gabriel, Moacir, Raniere, Joanna, Letícia, Kaline, Arthur, Vinicius, Max, Rony, Marília, Monique, Ajax, Fred, Larisse, Regina, Sarah (pequena), Mônica, Pablo, Danielle, Almino Afonso, Jéssica, Mariane, Fernanda (Pôia), Leonardo Nobre (Leo), Profa. Fabiana Lima, Ana Karina, Ana Karinne (Donana), Daniel, Fernando, Ivan, Nednaldo, Eduardo, Edjane, Valquíria.

(8)

Dedico esta obra

A _“amigannn_” Dayn,

Obrigada pela amizade, pelo companheirismo e por ter me proporcionado fazer parte de sua família. Obrigada também pela confiança, bem mais que isso, pelo privilégio de

ser madrinha de seu filho Heitor e suplente de Helena!

A NOSSA AMIZADE É Mais que uma mão estendida,

mais que um belo sorriso, mais do que a alegria de dividir, mais do que sonhar os mesmos sonhos

ou doer as mesmas dores, muito mais do que o silêncio que fala

ou da voz que cala para ouvir é a amizade, o alimento

que nos sacia a alma e nos é ofertado por alguém

(9)

Agradecimentos especiais

À UFRN, à Pós-graduação em Ciências da Saúde e ao Departamento de Bioquímica pela oportunidade de concluir esse curso de Pós-graduação, assim como as agências

Financiadoras CAPES e CNPq.

Agradeço novamente ao meu orientador Prof. Dr. Hugo Rocha pela oportunidade oferecida, pela atenção e auxílio prestados durante a pesquisa.

A todos os professores do CCS (UFRN), aos coordenadores do programa de pós-graduação (PPGCSa) e às secretárias do programa.

As professoras da banca de qualificação: Profa. Naisandra Bezerra e Profa. Ivonete Araújo

A todos os professores do DBQ (UFRN), em especial, a Profa. Edda Lisboa Leite, pela sua força e por toda a sua contribuição à instituição. Obrigada por sempre ter participado e me proporcionado grandes ensinamentos, principalmente de vida!

Aos meus amigos de laboratório pela colaboração e ajuda nos meus experimentos e também em tudo que precisei:

A Dayn (“amigann” e comadre) que tanto amo por me compreender e por sempre ter uma palavra amiga. Tenho por ti um enorme carinho. Obrigada por fazer parte de sua vida e de

seus flhos Helena e Heitor e daqui a alguns meses de Heloísa.

A Karol, por ser esse doce de pessoa, alguém muito especial para mim! Tenho certeza que seu futuro será brilhante e, mais que isso, queria agradecer-te por sempre estar perto nas horas mais difíceis com carinho e compreensão! Você sempre deixa o laboratório mais

alegre.

A Cinthia. Você é meu exemplo de transformação! Obrigada por tudo, obrigada por ter confiado a mim a tarefa tão importante de ser madrinha (casamento) e mais que isso, de

poder fazer parte da sua vida e de conviver com seu filho Davi. Obrigada A Ruth (Lut Lut), a “safada” que amo de paixão, a Rafael (super Rafildo), que não é o

ABC, mas é o mais querido, Leandro (Lelê) exemplo de profissional e de amigo.

Agradeço também de forma especial a Mariana e a Sara, por terem sido as primeiras a me incentivarem a vir para a Bioquímica. A Mariana, por me apoiar, por estar comigo em

tudo que preciso, por me fazer ver meus erros, por ser essa grande amiga, te adoro! A Sara, por ser nosso pilar de conhecimento “nosso Google”, aquela que nos socorre sempre e em qualquer tempo, te adoro muito. Muito obrigada, amigas, vocês são demais e

muito importantes para mim, estarão sempre no meu coração!!!

Agradeço muito a todos, todos vocês são mais que especiais nessa trajetória, a vocês o meu eterno agradecimento: Gabriel, Moacir, Joanna, Pablo, Raniere, Fernanda (Pôia), Leonardo Nobre (Leo), Letícia, Kaline, Arthur, Vinicius, Max, Rony, Marília, Monique,

Ajax, Fred, Larisse, Regina, Sarah (Pequena), Mônica, Danielle, Almino Afonso, Jéssica, Profa. Fabiana Lima, Ana Karina, Ana Karinne (Donana), Daniel, Fernando,

Ivan, Diego (Popó) e Valquíria.

Agradeço de forma especial a todos os amigos que fiz aqui no Departamento de Bioquímica: Adriana Brito, Ana Katarina, Luciana Rabêlo, Jonalson, Anderson (Negão), Paula Ivani (Paulinha), Antônio, Marina, Ingrid, Lívia, Ana Katarina, Jefferson, Rômulo, Ana

(10)

Aos amigos dos laboratórios LAMA e LBMG. Conheci pessoas maravilhosas e que me ajudaram bastante no desenvolvimento de algumas técnicas: Beatriz Mesquita, Susana, Nilmara, Paula Anastácia, Rita, Mayara, Jana, Felipe, Isabel, Dani (Pôia branca), Leonam

Agradeço a mais nova professora da genética, Susana Moreira, você superou todas as dificuldades e chegou lá, que bom que ficarás por aqui. Tu és giro!!!

A todos que me ajudaram direta ou indiretamente nesta tese: Danilo Cavalcanti, Karla (Farmácia), Priscyla (UFPE), Guiman, Marina e Haroldo.

A Lurdinha, pessoa batalhadora, de uma humildade e sabedoria enorme. Você é uma pessoa especial e que ensinou muito, não só a parte laboratorial, mas principalmente sobre a vida. Sou

muito grata pelos seus ensinamentos e pelos momentos “felizes” que compartilhamos. Muito obrigada por tudo.

Agradeço, de forma especial, àqueles que contribuíram de forma diferencial para minha formação como pessoa: aos meus grandes amigos e amigas Joanna D'arc e sua filha Joyce (que acompanhamos seu crescimento), Sara, Mariana Santana, Chrístier e Railson,

vocês foram uma das melhores conquistas, todos vocês são formidáveis e pessoas muito especiais pra mim. Muito obrigada por me aturarem e me aceitarem como sou. Muito obrigada do fundo do coração. Agradeço também a Adaíres e a Wanessa por fazerem

parte dessa história.

Agradeço à família de Dayn: Leonardo Oliveira (Leo), Dona Célia, Seu José, França, Drielle, Dmitryev, Dastaev (Patrícia e Monick), Dmetryus, Seu Abelardo, Helena, meu afihado Heitor, Heloísa e a Dona Ceiça. Muito obrigada pela força e pelo carinho. Também

dedico esta tese a vocês!

Muito obrigada a todos que fazem parte da Ong “Vida é Alegria”: Mileide, dona Neide, Sara, Mariana, Adaíres, Ricardo, Narjara, Adriana Sabiana, Adineide, Jobson, Fernando, Gian, Claudinha, Josie, Josi e todos pelos quais tenha esquecido o nome, mas que fazem

parte desse grupo pela oportunidade de ajudar a tantas crianças!

Agradeço a todos os amigos que trabalham comigo no CRI

Inês, Josinete, Patrícia, Elias, Mércia, Lúcia, Ana Tereza, Severina, Lidiane, Adriana Pinto, Sueldo, Cimária e Tarciana por compreenderem e me apoiarem nessa batalha que foi o

doutorado.

Agradeço a Tarciana, minha companheira do coração, muito obrigada pelo apoio e por ser tão especial para mim. Agradeço também a todos da sua família: Taísa, Vanessa, Rosa,

Maria, Seu Tarcísio e Antônio.

Agradeço também de forma especial aos grandes amigos Eutália e André. Vocês são dois anjos que Deus colocou no mundo, não tenho palavras para descrever

como sou feliz por ter vcoês como amigos!

Agradeço a minha “mãe” Vivi e a Mari também por, apesar de longe, estarem tão perto de mim.

Como foi difícil escrever essa parte! Por mais que eu possa agradecer, ainda assim seria muito pouco, não há como agradecer pelas alegrias, pelo apoio, pelo carinho, pelo consolo nas frustações. São muitas as pessoas a quem gostaria de agradecer, mas poderá ser que ao longo dos agradecimentos a memória possa esquecer de uma ou outra pessoa, mas

(11)

“

Talvez não tenha conseguido fazer o melhor, mas lutei para que o melhor fosse feito. Não sou o que deveria ser, mas Graças a Deus, não sou o que era antes”.

(12)

RESUMO

Fucanas são polissacarídeos sulfatados encontrados em algas marrons

e equinodermos. Tem sido demonstrado que uma fucana denominada de

fucana A, obtida da alga marrom

Spatoglossum schröederi

, apresenta uma

série de efeitos biológicos, em particular, a atividade antitumoral. Com intuito

de se potencializar essa atividade, foram adicionados grupamentos tióis a

estrutura da fucana A. Posteriormente, os nanogéis foram sintetizados pela

formação de nanocomplexos entre a fucana A tiolada e o polietileno glicol

(PEG) em várias relações 2.5, 5.0, 10, 15 e 30. Os nanogéis com as relações

de 10 e 15 (FucA:PEG10 e FucA:PEG15) foram os que se apresentaram com

os menores tamanhos, mais esféricos, com diâmetro em torno de 186,95 ±

10,62 nm e carga de superfície ligeiramente negativa. Após a síntese dos

nanogéis, estes foram submetidos aos ensaios antiproliferativos com células da

linhagem tumoral 786-0 nas concentrações 8,0 a 64 µg/mL. As células foram

analisadas durante um período de 24, 48 e 72 horas. Os dados mostraram que

em todas as concentrações de nanogéis de fucana A, a atividade

antiproliferativa foi tempo e dose dependente, o mesmo não sendo observado

para a fucana A avaliada isoladamente. O nanogel de FucA:PEG15 também

induziu apoptose por mecanismos dependentes e independentes de caspases.

Posteriormente, FucA:PEG15 também foi marcado com FITC sendo

completamente incorporado pelas células 786-0 após 1 hora. Quando a

endocitose celular foi parada, o FucA:PEG15 teve o seu efeito antiproliferativo

reduzido. Apesar de FucA:PEG15 não possuir efeito anticoagulante por aPTT e

PT (até 100 µg/mL), ele apresesentou efeito antioxidante e angiogênico. Esses

dados mostram que o nanogel de fucana A exibe várias efeitos

(antiproliferativa, antioxidante e antiangiogênica) e, portanto, o seu potencial

para a terapia do câncer deve ser investigada.

(13)

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

µL Microlitros

786-0 Linhagem de células derivadas de adenocarcinoma renal aPTT Tempo de tromboplastina parcialmente ativada

B16-F10 Linhagem de células de melanoma murino CAT Capacidade antioxidante total

CO2 Dióxido de carbono DAPI _4′,6′-diamino-2-fenilindol DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole DLS Dynamic light scattering

DMEM Meio de cultura sintético complexo –Dubelcco’s Modified Eagle’s Medium DMSO Dimetilsulfóxido

DPPH 2,2-difenil-1-picrilhidrazila ECs Células endoteliais ativadas EHS Tumor Engelbreth-Holm-Swarm

F0.5 Fração precipitada com 0,5 volumes de acetona F0.6 Fração precipitada com 0,6 volumes de acetona F0.7 Fração precipitada com 0,7 volumes de acetona F0.9 Fração precipitada com 0,9 volumes de acetona F1.1 Fração precipitada com 1,1 volumes de acetona F1.3 Fração precipitada com 1,3 volumes de acetona F2.0 Fração precipitada com 2,0 volumes de acetona FITC Isotiocianato de fluoresceína

Fuc A Fucana A

g Grama

G0 Fase do ciclo celular em que a célula permanece indefinidamente na intérfase HeLa Linhagem de células de carcinoma cervical humano

HepG2 Linhagem de Células de hepatocarcinoma humano HS-5 Linhagem de células estromais da medula óssea humana kDa Kilodalton

M Molar

MEV Microscópio eletrônico de varredura mg Miligrama

Mili-Q Água ultrapura Min. Minutos mL Mililitros mM Milimolar mm Milímetros

(14)

MW Peso molecular nm Nanômetros PA Para análise

Panc-1 Linhagem de células de adenocarcinoma de pâncreas PBS Solução tampão de salino fosfato

PDA Tampão 1,3 diamino propano acetato PEG Polietileno glicol

pH Potencial de hidrogênio PI Iodeto de propídio PT Tempo de protrombina

RAEC Linhagem de células endoteliais de aorta de coelho

(15)

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Alga marrom S. schröederi (C. Agardh) Kützing. A) em exsicata (Foto:

(16)

SUMÁRIO

RESUMO... x

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS... xi

LISTA DE FIGURAS... xiii

1. INTRODUÇÃO... 15

2. JUSTIFICATIVA... 18

3. OBJETIVOS... 19

3.1. OBJETIVO GERAL... 19

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS... 19

4. MÉTODOS... 20

4.1. MATERIAIS BIOLÓGICOS... 21

4.1.1. Algas... 21

4.1.2. Linhagens e culturas celulares... 22

4.2. EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DA FUCANA A... 22

4.2.1. Obtenção do pó cetônico... 22

4.2.2. Proteólise... 22

4.2.3. Fracionamento do extrato bruto com concentrações crescentes de acetona... 23

4.2.4. Cromatografia em coluna de troca iônica... 23

4.3. SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DOS NANOGÉIS... 24

4.3.1. Síntese das fucanas tiolada... 24

4.3.2. Caracterização físico-química dos nanogeis de fucanas... 24

4.3.3. Transmitância dos nanogéis... 24

4.3.4. Dynamic Light Scattering (DLS)... 25

4.3.5. Estabilidade... 25

4.3.6. Microscopia eletrônica de varredura (MEV)... 25

4.3.7. Microscopia confocal... 25

4.3.8. Espectroscopia de infravermelho... 26

4.3.9. Atividade antiproliferativa... 26

4.3.10. Conjugação da fucana A com fluoresceína (FITC)... 27

4.3.11. Avaliação da viabilidade e morte celular por anexina V-FITC/ iodeto de propídio (PI)... 27

4.3.12. Atividade antioxidante... 28

4.3.13. Atividade anticoagulante... 28

4.3.14. Ensaio de formação de tubo de matrigel... 28

4.4. ANÁLISE ESTATÍSTICA... 29

5. ARTIGOS PRODUZIDOS... 30

5.1. ARTIGO 1 (SUBMETIDO)... 32

5.2. CAPÍTULO DE LIVRO... 55

5.3. ARTIGO 2... 77

5.4. ARTIGO 3... 83

6. COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E SUGESTÕES... 91

7. REFERÊNCIAS... 93

8. ANEXOS... 96

8.1. NORMAS PARA FORMATAÇÃO DA TESE (CCS)... 97

8.2. NORMAS DA REVISTA PARA SUBMISSÃO (MARINE DRUGS)... 100

8.3. DECLARAÇÃO... 105

(17)

1. INTRODUÇÃO

O câncer é um dos problemas mais complexos que os sistemas de saúde

mundial enfrentam e essa doença está prestes a se tornar uma das maiores

causas de mortalidade nas próximas décadas. Segundo a Organização

Mundial de Saúde (WHO) o número de casos de câncer no mundo deverá

aumentar em 75% até 2030. E segundo esta mesma pesquisa, essa taxa pode

ser ainda mais alta e chegar a 90% em países mais pobres [1, 2].

Para o tratamento do câncer, os três principais tratamentos atuais são a

cirurgia, a radioterapia e a quimioterapia, cuja escolha depende do tipo de

tumor e do estágio de seu desenvolvimento [3]. Embora esses tratamentos

sejam de grande valor, podem apresentar desvantagens e limitações, como

complicações pós-cirúrgicas e toxicidade sistêmica. Por essa razão, pesquisas

que buscam métodos alternativos e/ou complementares de tratamento estão

em evidência e visam sempre ser mais eficientes em relação às terapias

convencionais [4].

Atualmente, a nanotecnologia exibe um indispensável papel

especialmente no campo da medicina (nanomedicina) e vem sendo apontada

como uma das grandes promessas do futuro. As abordagens nanoterapêuticas

têm tratado diferentes tipos de câncer e têm tornado possível uma nova era na

quimioterapia, já que vários tipos de nanoestruturas (dendrímeros,

nanossondas magnéticas, nanoesferas, nanopartículas, hidrogéis, lipossomos,

dentre outros) têm sido sintetizados para atingir as células cancerosas, tanto

para o diagnóstico quanto para terapias específicas [5, 6], já que esses

sistemas nanométricos oferecem a vantagem de reduzir ou eliminar efeitos

colaterais da quimioterapia por atuarem diretamente nas células cancerosas e

não permanecerem livres na via sistêmica.

(18)

Além disso, eles têm atraído crescente interesse devido o seu potencial como

nanocarreadores de vários compostos, dentre eles os biopolímeros [7, 8].

Entre a numerosa quantidade de biopolímeros que tem sido proposta para

a preparação de nanogéis, polissacarídeos têm inúmeras vantagens sobre os

polímeros sintéticos por serem não tóxicos, biocompatíveis, biodegradáveis e

solúveis em água [9]. Ao longo dos últimos anos, um polímero em especial tem

chamado a atenção na área dos polissacarídeos, é conhecido como fucana.

Fucana é um termo utilizado para denominar uma família de polissacarídeos

sulfatados cujo açúcar mais representativo é a

α

-

L

-fucose sulfatada. Elas são

encontradas em algas marrons e em equinodermas (ouriço e pepino do mar)

[10, 11].

Ao longo de algumas décadas nosso grupo de pesquisa (localizado no

Laboratório de Biotecnologia de Polímeros Naturais

–

BIOPOL

–

UFRN, sob a

responsabilidade do Prof. Dr. Hugo Rocha) tem intensificado os estudos com

os polissacarídeos extraídos da alga marrom

Spatoglossum schröederi

(Dictyotaceae). Essa alga sintetiza três tipos de fucanas e a obtida em maior

quantidade foi nomeada de fucana A [12, 13]. A disponibilidade permanente

desse organismo em grandes quantidades tornou-a uma excelente escolha

para a prospecção de compostos bioativos.

Em estudos anteriores, Barroso e colaboradores trabalhando com a

fucana A da

S. schröederi

observaram que esse polímero não apresentava

atividade anticoagulante

in vitro

, porém, demonstrou atividade antitrombótica

in

vivo

, sendo observado um efeito dose-dependente alcançando a saturação ao

redor de 20 µg/g de peso de rato. A fucana A também apresentou um efeito

tempo-dependente, alcançando a saturação por volta de 16h após a sua

administração [13].

(19)

genotoxicidade [15] foram realizados e não mostraram nenhum efeito danoso

provocado pela fucana A, mesmo utilizando altas concentrações. Ainda neste

mesmo trabalho, a atividade citotóxica da fucana A foi testada contra várias

linhagens tumorais, onde foi observado que esse polímero inibiu a proliferação

celular em torno de 43,7% para as células Panc-1 e HeLa (0,05 a 1 mg/mL) e

que ele não matou células normais.

A citotoxicidade para células tumorais também foi encontrada para a

heparina (polissacarídeo sulfatado de origem animal com estrutura química

semelhante a da fucana). Esse polímero demonstrou atividade antiproliferativa

frente a uma gama de linhagens celulares [16, 17].

Esse grande interesse pelas fucanas de algas pode estar relacionado

com a sua semelhança estrutural com a heparina, o que daria a esse

polissacarídeo atividades semelhantes às deste glicosaminoglicano. Além

disso, por serem de origem vegetal, elas poderiam apresentar menores riscos

de contaminações e são encontradas em abundância na natureza, já que são

recursos naturais renováveis.

No caso da heparina, têm sido desenvolvidos sistemas de nanogéis que

são resistentes ao ambiente extracelular e que não se degradam no interior

celular, promovendo a liberação controlada da heparina no interior das células

tumorais e, por conseguinte, a morte celular por apoptose induzida pela

heparina. Assim, quando Bae e colaboradores, utilizando nanogéis de

heparina, trataram células tumorais B16-F10, observaram que a proliferação

celular foi inibida em cerca de 50%, enquanto que a heparina sozinha inibiu o

crescimento celular em aproximadamente 10% [18].

(20)

(21)

2. JUSTIFICATIVA

O Estado do Rio Grande do Norte possui uma grande diversidade de

espécies de macroalgas marinhas, organismos estes que são potências

produtores de compostos com grande potencial farmacológico e biotecnológico.

Dentre eles, destacam-se os polissacarídeos sulfatados. Apesar do potencial

dos polissacarídeos sulfatados encontrados em nossa região, esses compostos

ainda não são conhecidos, o que faz com que esses recursos naturais não

sejam aproveitados.

Recentemente, foram encontradas fucanas com alta atividade

antitumoral, sintetizadas por algas do litoral potiguar e o nosso grupo de

pesquisa vem se dedicando a pesquisar as fucanas dessas algas. Mas, apesar

da forte atividade antiproliferativa já encontrada em algumas fucanas de algas

marrons, há um empecilho que dificulta os avanços dos estudos com fucanas

antiproliferativas que é o seu caráter iônico, elas podem assim se ligar a uma

gama de proteínas extracelulares antes de entrarem no interior celular, o que

exige uma elevada concentração de fucanas para que elas possam

desempenhar o seu efeito.

Devido a isso, a síntese de nanogéis de fucana foi o recurso utilizado

neste trabalho para intensificar os estudos de suas atividades biológicas,

especialmente, o seu efeito antitumoral, já que os nanogeís são liberados

(introduzidos) diretamente dentro das células tumorais, sem s

erem “perdidos

na circulação”

. Para tal, uma parceria foi estabelecida com a Universidade do

(22)

3. OBJETIVOS

3.1. GERAL

 Sintetizar um nanogel de fucana A pela adição de grupos tióis e avaliar seu efeito antiproliferativo e apoptótico frente a linhagem tumoral 786-0, como também seu efeito antioxidante, anticoagulante e angiogênico.

3.2. ESPECÍFICOS

 Extrair os polissacarídeos sulfatados da alga marrom

S. schröederi

por

fracionamento cetônico;

 Obtenção da fucana A por cromatografia de troca iônica da fração

cetônica F0.6v;

 Sintetizar nanogéis a partir da fucana A obtida;

 Caracterizar físico-quimicamente os nanogéis de fucana A;

 Avaliar as atividades antiproliferativa, anticoagulante, antioxidante e

antiangiogênica dos nanogéis produzidos e da fucana A livre;

 Avaliar a capacidade dos nanogéis de fucana em induzir apoptose em

células tumorais;

(23)

4. MÉTODOS

4.1. MATERIAIS BIOLÓGICOS

4.1.1. Algas

A alga marinha marrom

Spatoglossum schröederi

(C. Agardh) Kützing

(Figura 1) foi coletada na Praia de Búzios, município de Nísia Floresta (litoral

sul do Rio Grande do Norte), em marés baixas entre 0,0 a 0,2 metros a uma

temperatura situada entre 28-30°C. As algas foram recolhidas quando já

desprendidas do substrato, mas permanecendo flutuando nas águas de

maré-baixa.

As algas foram trazidas ao laboratório no mesmo dia da coleta e

acondicionadas em sacos de polietileno, lavadas em água corrente,

examinadas cuidadosamente para remoção de epífitas, inclusões calcárias e

sais, sendo postas para secar em estufa aerada a 45°C. Em seguida foram

trituradas, pesadas e guardadas em frascos de vidro hermeticamente fechados.

Figura 1 – Alga marrom S. schröederi (C. Agardh) Kützing. A) em exsicata (Foto:

(24)

4.1.2. Linhagens e culturas celulares

As linhagens celulares de adenocarcinoma renal (786-0) e de endotélio

da aorta de coelho (RAEC) foram mantidas em meio RPMI e HAM-F12,

respectivamente. Todas as células foram cultivadas a 37°C em uma incubadora

umidificada na presença de 5% CO2, com os meios suplementados com 10%

de soro fetal bovino (SFB) e antibióticos (100 U/mL de penicilina e

100 μg/m

L

de estreptomicina). As células 786-0 foram doadas pela Profa. Dra. Carmen

Ferreira (Departamento de Bioquímica, UNICAMP, Brasil) e as RAEC pela

Profa. Dra. Helena Nader (Departamento de Bioquímica, UNIFESP, Brasil).

4.2. EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DA FUCANA A

4.2.1. Obtenção do pó cetônico

A alga seca e pulverizada foi suspensa em dois volumes de acetona PA

para despigmentação e delipidação do material. Essa solução ficou a

temperatura ambiente durante um período de 24 horas. Posteriormente, a

mistura foi decantada e o resíduo colocado para secar a 45°C sob aeração e

denominado de

“

pó cetônico

”

. Esse pó foi utilizado em seguida na proteólise.

4.2.2. Proteólise

(25)

4.2.3. Fracionamento do extrato bruto com concentrações crescentes de

acetona

O extrato polissacarídico bruto obtido foi fracionado com volumes

crescentes de acetona, obtendo-se as frações polissacarídicas. Os valores de

acetona adicionados foram determinados pela turvação da solução, que

caracteriza a precipitação de polissacarídeos devido à adição desse solvente

polar. Adicionou-se um volume de acetona, sob agitação leve, necessário para

que se visualizasse uma turvação da solução, essa solução foi mantida em

repouso a 4ºC durante 18h, o precipitado foi coletado por centrifugação a 8.000

x g por 15 minutos a 4ºC e seco a pressão reduzida.

Em seguida, esse procedimento foi repetido até que não se visualizasse

mais a formação de precipitado. As frações obtidas foram denominadas

conforme o volume de acetona no qual foram precipitadas (F0.5, F0.6, F0.7,

F0.9, F1.1, F1.3 e F2.0).

4.2.4. Cromatografia em coluna de troca iônica

A fração cetônica F0.6 (que contém a fucana A) foi submetida à

complexação com a resina de troca iônica Lewatite (10 mg de material para

cada 1,0 mL de resina) e a eluição foi realizada passo a passo utilizando-se

molaridades crescentes de NaCl, como descrito por Dietrich e colaboradores

[20]. Foram coletadas frações, com volume total de três vezes o volume da

resina, para cada molaridade de sal (0.3, 0.5, 0.7, 1.0, 1.5, 2.0, e 3.0 M), as

quais foram separadas pela ausência de positividade para o método de

fenol-ácido sulfúrico [21]. O fluxo de coleta foi de 1 mL/min, sendo o volume de

eluição igual para todas as molaridades coletadas.

(26)

4.3. SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DOS NANOGÉIS

4.3.1. Síntese das fucanas tiolada

As fucanas inicialmente foram dissolvidas em tampão citrato (0,1 M, pH

3.0) e postas para reagir com periodato de sódio por 2h a 4°C. Após esse

procedimento, as fucanas, agora tioladas, foram conjugadas com cisteamina

por aminação redutiva. Para tal, após diálise contra água destilada, as fucanas

modificadas reagiram com a cisteamina por duas horas em PBS. Após esse

período, foi acrescido à solução boridreto de sódio 0,1 M lentamente, sendo a

solução agitada por 1h a 4°C. Essa solução foi então dialisada sob atmosfera

de nitrogênio par minimizar a oxidação dos grupos tiois e posteriormente

liofilizada [18].

4.3.2. Caracterização físico-química dos nanogeis de fucanas

As fucanas tioladas foram em seguida misturadas com polietileno glicol

(PEG) em diferentes proporções (2.5, 5.0, 10, 15 e 30), o que permitiu

posteriormente escolher qual a melhor proporção para a síntese do nanogel. A

mistura seca de fucana tiolada e PEG foi solubilizada em DMSO e incubada

por 6h a 37°C. A complexação entre a fucana e o PEG ocorreu através de

pontes de hidrogênio. Após esse período, a solução foi sonicada por 3 minutos

gerando pontes dissulfeto entre as moléculas de fucana tioladas. O nanogel

resultante foi exaustivamente dialisado e assim ficando livre das moléculas de

PEG e DMSO residuais.

4.3.3. Transmitância dos nanogéis

(27)

4.3.4. Dynamic Light Scattering

(DLS)

O diâmetro e o potencial zeta dos nanogéis foram medidos por

espectroscopia de correlação de fótons usando o equipamento DLS da

Brookhaven 90 Plus (Brookhaven Instruments Corporation, New York, USA).

Os nanogéis de fucana A foram preparados em água a 25°C a uma

concentração de 1 mg/mL.

4.3.5. Estabilidade

A estabilidade foi avaliada analisando o nanogel, solubilizado em água,

para a sua distribuição de tamanho. A análise foi realizada semanalmente, até

42 dias, conforme descrito anteriormente. A solução nanogel foi mantida a 4°C

durante o estudo e removidos para análise 24 horas antes de cada medição,

sempre realizada a 25°C.

4.3.6. Microscopia eletrônica de varredura (MEV)

Tamanho e forma dos nanogéis A fucana foram avaliados por

microscopia eletrônica de varredura. Para ambas as experiências, 50 µL da

solução de nanogel foi depositado sobre uma superfície limpa de mica, deixado

a secar a 25ºC e, em seguida, observada em microscópio de varredura

Shimadzu, modelo SSX550 (Shimadzu Scientific Equipment, UK).

4.3.7. Microscopia confocal

As células 786-0 (1 × 10

5

) foram colocadas em lamínulas de vidro de 12

mm de diâmetro em placas de 24 wells (Nunc; Naperville, IL, USA). Após 3 dias

em cultura, as células foram lavadas três vezes com PBS (0,1 M, pH 7,4), e,

em seguida, tratadas com a fucana A ou com o nanogel de fucana marcado

com fluoresceína em meio RPMI isento de soro por 15, 30 ou 60 min a 37°C.

(28)

vezes em PBS novamente e em seguida adicionado Fluoromount-G (EM

Sciences; Ft. Washington, WA, EUA) e colocado uma lamínula de vidro e

examinadas com um microscópio confocal ou de fluorescência (Zeiss Axio

Examiner LSM 710, Jena, Alemanha).

4.3.8. Espectroscopia de infravermelho

A espectroscopia de infravermelho foi realizada em espectrômetro

Perkin-Elmer de 4400 a 400 cm

-1

_{no Departamento de Química da}

Universidade Federal do Rio grande do Norte. A fucana A e os nanogéis de

fucana A (~5 mg) foram analisados após secagem em aparelho de

Abdenhalden sob a forma de pastilha de KBr contendo P2O5 a 60ºC.

4.3.9. Atividade antiproliferativa

A atividade antiproliferativa dos nanogéis obtidos foi avaliada pelo ensaio

colorimétrico do MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenil tetrazolium

bromide) [22]. Esse método é baseado na redução do MTT a cristais de

formazan pelas células vivas.

(29)

4.3.10. Conjugação da fucana A com fluoresceína (FITC)

A fim de visualizar a incorporação celular do nanogel (FucA:PEG15) e da

fucana A, ambas foram marcadas com sal de sódio de fluoresceína (Sigma).

Resumidamente, 5 mg de fucana A ou nanogel foram colocados para reagir

com 1 mg de fluoresceína em solução 0,1 M de PBS (pH 7,0), sendo agitada

durante 1 hora, protegida da luz, a temperatura ambiente. A solução foi

dialisada contra água destilada (MW 12 kDa) e, em seguida, liofilizada.

4.3.11. Avaliação da viabilidade e morte celular por anexina V-FITC/ iodeto

de propídio (PI)

(30)

4.3.12. Atividade antioxidante

Quatro testes foram realizados para analisar a atividade antioxidante do

nanogel e da fucana A; foram eles: poder redutor, DPPH, sequestro de radicais

superóxido e capacidade antioxidante total. A metodologia foi seguida de

acordo com o descrito por Costa e colaboradores [23] e Vinayak, Sabu e

Chatterji [24].

4.3.13. Atividade anticoagulante

Os ensaios de tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT) e tempo

de protrombina (PT) foram realizados seguindo o protocolo fornecido pelos

“kits” comerciais adquiridos. Para esses ensaios foi utilizada uma massa de

100 µg para o nanogel (FucA:PEG15) e para a fucana A, sendo considerado o

possuidor de atividade aquela amostra capaz de prolongar em duas vezes o

tempo normal de coagulação. Foram utilizadas como meio de comparação da

atividade anticoagulante, a clexane (heparina de baixo peso molecular). Os

tempos de coagulação foram determinados utilizando-se um coagulômetro

automático.

4.3.14. Ensaio de formação de tubo de matrigel

(31)

4.4. ANÁLISE ESTATÍSTICA

(32)

5. ARTIGOS PRODUZIDOS

5.1. Artigo 1 (SUBMETIDO)

Evaluation of potential antitumor activity of fucan nanogel

Periódico: Marine Drugs

Nanotechnology (The reference number for the article is NANO-102955)

Fator de impacto: 3.978

ISSN: 1660-3397 (Printed version)

ISSN: 1660-3397 (Online version)

Qualis: Medicina II

–

A2

Indexada: PubMed

–

indexado por MEDLINE

5.2. Capítulo de livro

Chapter 6 –

Application of Marine Polysaccharides in Nanotechnology

Periódico: Marine Medicinal Glycomics

Biotechnology in Agriculture, Industry and Medicine Biochemistry

Research Trends

In: Vitor Hugo Pomin. (Org.). Marine Medicinal Glycomics. 1ed.New York: Nova

Science, 2013, v. 01, p. 65-114.

Binding: ebook

ISBN: 978-1-62618-649-1

5.3. Artigo 2

Evaluation of acute and subchronic toxicity of a non-anticoagulant, but

antithrombotic algal heterofucan from the

Spatoglossum schröederi

in

Wistar rats

Periódico: Brazilian Journal of Pharmacognosy

Rev. Bras. Farmacogn. Braz. J. Pharmacogn. 21(4): Jul./Aug. 2011

Fator de impacto: 0.68

(33)

Indexada: SCOPUS, SciELO, EMBASE e GEOBASE

5.4. Artigo 3

Evaluating the possible genotoxic, mutagenic and tumor cell

proliferation-inhibition effects of a non-anticoagulant, but antithrombotic algal

heterofucan

Periódico: Journal of applied toxicology : JAT.

J Appl Toxicol. 2010 Oct;30(7):708-15. doi: 10.1002/jat.1547.

Fator de impacto: 2.597

ISSN: 0260-437X (Printed version)

ISSN: 1099-1263 (Online version)

Qualis: Medicina II

–

B1

(34)

5.1. ARTIGO 1 (SUBMETIDO)

Mar. Drugs 2014, 12, 1-x manuscripts; doi:10.3390/md120x000x

marine drugs

ISSN 1660-3397

www.mdpi.com/journal/marinedrugs

Article

Evaluation of potential antitumor activity of fucan

nanogel

Jailma Almeida-Lima

1,2

, Arthur Anthunes Jacome Vidal

1

, Dayanne Lopes

Gomes

1,2

, Ruth Medeiros Oliveira

1

, Leonardo Thiago Duarte Barreto Nobre

3

,

Mariana Santana Santos Pereira Costa

1

, Nednaldo Dantas-Santos

2

, Helena

Bonciani Nader

3

, Francisco Miguel Gama

4

, Edda Lisboa Leite

1

, Hugo Alexandre

Oliveira Rocha

1,2*

1

Laboratory of Biotechnology of Natural Polymers (BIOPOL), Department of

Biochemistry, Federal University of Rio Grande do Norte (UFRN), Natal-RN

59078-970, Brazil; E-Mails: biolottus23@yahoo.com.br (J.A.-L.); arthur_bio@hotmail.com

(A.A.J.V.); dayanne_gomes@hotmail.com (D.L.G.); rmo_85@hotmail.com

(R.M.O.); marispc_bio@yahoo.com.br (M.S.S.P.C); eddaleite@cb.ufrn.br (E.L.L);

hugo@cb.ufrn.br (H.A.O.R)

2

Graduate Program in Health Sciences, Federal University of Rio Grande do Norte

(UFRN), Natal-RN 59078-970, Brazil; E-Mails: nednaldod@hotmail.com (N.D.-S.)

3

Department of Molecular Biology, Department of Biochemistry, Federal University

of São Paulo - UNIFESP, São Paulo-SP, 04044-020, Brazil; E-Mails:

leo.dnobre@gmail.com (L.T.D.B.N); hbnader.bioq@epm.br (H.B.N)

4

IBB

—

Institute for Biotechnology and Bioengineering, Centre for Biological

Engineering, Minho University, Braga 4704-553, Portugal; E-Mails:

fmgama@deb.uminho.pt (F.M.G.)

* Author to whom correspondence should be addressed; E-Mail: hugo@cb.ufrn.br;

Tel.: +55-84-3215-3416 (ext. 207); Fax: +55-84-3211-9208.

Received: / Accepted: / Published:

(35)

Abstract: Fucan is a term that defines a family of homo- and

heteropolysaccharides containing sulfated L-Fucose. In this work a

heterofucan (Fucan A) from seaweed Spatoglossum schröederi was

thiolated and treated by ultrasonication, giving rise to intermolecular

disulfide bonds and to the formation of fucan A nanogels. Fucan A nanogel

decorated with polyethylene glycol (FucA:PEG15) was stable for over one

month and showed an average diameter of 187 ± 11 nm in aqueous solution

and a zeta potential of -23.1 ± 2.0 mV, as measured by dynamic light

scattering. This nanogel inhibits the proliferation of 786-0 renal

adenocarcinoma cells in a dose-dependent way. Flow cytometric analysis

showed that FucA:PEG15 induces apoptosis through caspase and

caspase-independent mechanisms. The nanogel labeled with FITC was completely

taken up by 786-0 cells after 1 hour. When we stopped the cell endocytosis,

the FucA:PEG15 antiproliferative effect was abolished. In additon,

FucA:PEG15 has antioxidant activity and also exhibits antiangiogenic

activity . These data show that fucan A nanogel exhibits several activities

(antiproliferative, antioxidant, and antiangiogenic) and therefore its potential

for cancer therapy should be further investigated.

Keywords: fucan; sulfated polysaccharide; brown seaweed; nanogel;

cytotoxicity

1. Introduction

The term cancer is used to refer to more than one hundred different types of diseases

that have in common the characteristic uncontrolled proliferation of anaplastic cells.

These cells, at some point, will invade other tissues and organs. It is estimated that more

than 21 million people will contract cancer and 13 million deaths are expected by 2030.

Although cancer accounts for around 13% of all deaths in the world, more than 30%

could be prevented by modifying or avoiding key risk factors [1].

The use of chemotherapy for the treatment of cancer raises concerns about the

debilitating side effects of this form of treatment; on the other hand, poor cellular

internalization and insufficient intracellular drug release reduces its efficacy [2].

The development of nanomedicine aims to solve the issues associated with the

systemic administration of toxic pharmaceuticals. Thus, chemotherapeutic agents have

been encapsulated, conjugated, entrapped, or loaded into nanoformulations, resulting in

the site-specific drug delivery, thereby reducing the systemic toxicity [3].

(36)

self-assembly processes. An increased interest has been witnessed recently for smart

nanogels allowing site-specific and controlled drug release, paving the way for the

development of improved cancer therapeutic formulations [5].

Among the numerous polymers that have been proposed for the preparation of

nanogels, polysaccharides have a number of advantages over the synthetic polymers,

which were initially employed in the field of pharmaceutics [6]. Fucans are

polysaccharides containing substantial amounts of L-fucose and sulfate ester groups,

expressed by brown seaweed [7] and some marine invertebrates (sea urchins and sea

cucumbers) [8]. Algal fucans showed several biological/pharmacological activities such

as antithrombotic, antiviral, anticoagulant, antioxidant, and anti-inflammatory

[9,10,11,12]. In addition, fucan anti-cancer activities have been reported frequently in

recent years, and the potential mechanisms of action were also investigated

[13,14,15,16].

Among the seaweed fucans, we can highlight those extracted from Spatoglossum

schröederi (Dictyotaceae). This brown seaweed is found along almost the entire

Brazilian coast (about 8000 km). The permanent availability of this organism in large

amounts makes it an excellent choice for prospecting bioactive compounds. It

synthesizes three fucans and the one obtained in the larger quantity was named fucan A.

We showed that fucan A is not toxic in vivo [17], but it demonstrated antiproliferative

activity against several tumor cell lines [18]. However, this activity was observed only

for high concentrations, probably because fucan A, due its ionic nature, binds onto a

great variety of proteins, becoming unavailable to perform the bioactivity of interest.

Another kind of sulfated polysaccharide known as heparin binds several proteins [19]

including extracellular matrix proteins [20]. In order to diminish this inactivating

effect, Bae and colleagues synthesized a heparin nanogel cross-linked with disulfide

linkages. When B16-F10 tumor cells were treated with heparin nanogel, their

proliferation was inhibited by about 50%, whereas free heparin alone inhibited the cell

growth to a much smaller extent (~10%) [21].

Previously, we chemically modified fucan A by grafting hexadecylamine to the

hydrophilic backbone. The obtained amphiphilic material self-assembled into fucan A

nanogel, which showed antiproliferative activity against human renal tumor cells (786-0

cells) [22]. In this study fucan A was covalently linked to thiol groups and then

cross-linked with disulfide linkages to produce fucan A nanogel for efficient cellular uptake.

This way, a fully hydrophilic nanogel is obtained. In addition, we investigated the

antiproliferative effect of the newly developed fucan A nanogels using 786 tumor cell

lines. The data obtained indicated that the fucan A nanogel exhibits high stability and is

a more powerful inhibitor of cell growth than free fucan A.

2. Results and Discussion

2.1. Synthesis of the fucan A nanogels

(37)

cysteamine by reductive amination, yielding thiolated fucan A. Then, the nanogels

were synthesized by a method that comprises two steps: Thiolated fucan was initially

co-dissolved in DMSO with PEG, enabling the interaction between the two polymers,

presumably by hydrogen bonding, resulting in the spontaneous formation of nanosized

complex particles in the DMSO phase. In the second step, thiolated fucan A monomers

within the inner core of the complexes were covalently linked together by disulfide

linkages. This was achieved by ultrasonic treatment, which promotes the formation of

free radicals, which in turn accelerate the oxidation reaction of the thiol groups of the

cysteamine linked to fucan A. The crosslinked fucan nanogels were finally obtained by

withdrawing the DMSO and free PEG through exhaustive dialysis (Figure 1A).

Figure 1. A) Scheme of the synthesis of fucan A nanogels. B)

Transmittance of solution containing nanogels of fucan A prepared using

various weight ratios of PEG (0, 2.5, 5.0, 10, 15, 30) at 400 nm.

(38)

2.2. Characterization of the nanogels

The average hydrodynamic diameters of nanogels were measured at a concentration

of 1 mg/mL in water by dynamic light scattering (DLS). The effect of various fucan

A:PEG weight ratios on nanogel size, polydispersity (PDI), and zeta potential was

analyzed. As we can see in Table 1, a weight ratio of FucA:PEG of 30, originates a very

large nanogel (917.18 ± 83.12 nm), whereas the others showed a size ranging from

186.95 ± 10.62 to 301.44 ± 2.26. Bae and colleagues [21], using the same method to

obtain heparin nanogels, elected a weight ratio of heparin:PEG of 15 as the best one

because it would favor stronger interactions between PEG and heparin, leading to the

formation of compact nanogels. This observation is in agreement with ours, since

FucA:PEG15 showed the smaller size (186.95 ± 10.62 nm) among the tested

combinations. However, the size of FucA:PEG15 colloidal micelles is in the same order

of magnitude of other nanogels obtained with fucan A using a different synthetic route

[22], and of others obtained using different acidic polysaccharides and the same

synthesis approach. For instance, heparin nanogels resulted in a stable structure with an

average diameter of 248.7 ± 26.8 nm [21] and acetylated hyaluronic acid gave rise to

nanogels ranging from 275 ± 4 to 447 ± 8 nm [23].

The size of nanomaterials is an extremely important factor determining its fate in

vivo

—

biodistribution and pharmacokinetics

—

since it affects namely the phagocytosis

and ability to cross biological barriers. According to Dong and Mumper [24],

nanoparticles with a size around 220 nm are ideal targets for passive targeting of tumors

since the majority of solid tumors exhibit vascular pore cut-offs between 380 and 780

nm. Thus, using the size as a parameter of choice, all fucan A nanogels, except

FucA:PEG30, have potential application against tumor cells. However, other parameters

should be evaluated to confirm this statement.

Table 1. Physicochemical characteristics of nanogels obtained using

different ratios of the polyethylene glycol (PEG) determined by DLS.

Samples

Diameter

(nm)

Polydispersity

(PDI)

Conductance

(µS)

Zeta

Potencial

(mV)

FucA:PEG2.5

301.44 ± 2.26

0.69 ± 0.03

193 -28.12 ± 1.55

FucA:PEG5.0

297.15 ± 30.97

0.48 ± 0.09

254 -28.61 ± 0.15

FucA:PEG10

277.10 ± 17.41

0.49 ± 0.03

548 -26.11 ± 0.05

FucA:PEG15

186.95 ± 10.62

0.54 ± 0.06

347 -23.08 ± 1.96

(39)

the zeta potential values found in previous studies for nanoparticles prepared with other

fucans [25], and with chitosan with a blend dextran sulfate [26].

Furthermore, nanogel, as evidenced by the polydispersity index (PDI), ranged

between 0.48 ± 0.09 to 0.84 ± 0.09. The PDI is dimensionless and scaled such that

values smaller than 0.05 are rarely seen other than with highly monodisperse standards.

Values greater than 0.7 are indicative of samples with a very broad size distribution and

probably not suitable for analysis using the dynamic light scattering (DLS) technique

[27,28]. Thus, the best nanogels regarding the heterogeneity of size distribution were

FucA:PEG5.0, FucA:PEG10, and FucA:PEG15.

Size and surface morphology of fucan A nanogels were evaluated by SEM. Figure 2

shows that not all formulations presented a spherical shape, in the case of FucA:PEG2.5

nanoparticles were not detected, while in the case of FucA:PEG30 particles with a

fibrous shape were observed. It can be speculated that some phase transition may have

occurred during the drying of the samples, since in the case of FucA:PEG2.5 nanosized

particles were detected by DLS. Nonetheless, these results demonstrate the critical

relevance of the balance of fucan A vs PEG, suggesting that the arrangement of the two

polymers determines the organization of the nanogel. On the other hand, FucA:PEG5.0,

FucA:PEG10, and FucA:PEG15 showed a spherical shape with an average diameter of

113.33 ± 0.23 nm, 101.85 ± 0.43 nm, and 98.25 ± 1.69 nm, respectively (Figure 2F).

The diameter measured by DLS was slightly larger than the one obtained from SEM,

presumably due to the swelling of fucan A nanogels in water (taking into account that

carbohydrate polymers are highly hygroscopic), since the samples needed to be dried

for analysis by SEM, as noted by other authors [21,23].

Figure 2. SEM photograph of nanogels with various weight ratios of

(40)

2.3. FTIR of the fucan A nanogels

FTIR spectra of fucan A, FucA:PEG10, and FucA:PEG15 are depicted in Figure 3.

Characteristic sulfate absorptions were identified in the FTIR spectra: bands around

1265 cm

−1

for asymmetric S=O stretching vibration and around 1041 cm

−1

for

symmetric C

–

O vibration associated with a C

–

O

–

SO

3

group [18]. The bands at 813

–

850 were caused by the bending vibration of C

–

O

–

S. At 3200

–

3500 cm

−1

, fucan A and

fucan A nanogels showed bands from the stretching vibration of O

–

H [9]. The band

around 2900 cm

−1

corresponds to stretching vibrations of CH

2

, which is higher in fucan

nanogel spectra due to the presence of stretching vibrations of CH

2

in cysteamine

residues [29], as further confirmed by the band at 1468 cm

−1

, featuring a higher

intensity in fucan nanogel spectra. This band corresponds to C

–

H symmetric

deformation vibration [30]. A band around 1410 cm

−1

was identified in all spectra and

was assigned to symmetric vibration of COO

−

of glucuronic acid. The presence of

glucuronic acid was also confirmed by the antisymmetric stretching vibration of COO

−

at 1618 cm

−1

[31], which overlaps with the vibration of water. The H

2

O molecule has

strong IR absorbance with three prominent bands around 3400 (O

–

H stretching), 2151

(water association), and 1618 cm

−1

(H-O-H bending) [32] in the fucan A spectrum.

However, the band intensity decreases in fucan nanogels. The absorption band due to S

–

H stretching vibrations of the thiol group was also observed at 2600

–

2550 cm

−1

[33].

Figure 3. Infrared of fucan A and nanogels FucA:PEG10, FucA:PEG15,

Fuc:PEG30.

2.4. Nanogel Stability

(41)

DLS. As presented in Figure 4, the fucan A nanogels were highly stable in aqueous

solution, suggesting that their structural integrity was preserved.

Figure 4. Stability of fucan A nanogels FucA:PEG10 and FucA:PEG15

accessed by DLS. The nanogels were stored at 4 °C for up to 42 days and

analyzed in DLS at temperature 25°C.

2.5. Cytotoxicity assay

The cytotoxic of FucA:PEG10, FucA:PEG15, and Fucan A upon 786-0 cells was

investigated for 24 h using a colorimetric MTT-based assay (Figure 5). Fucan A

displayed a dose-dependent inhibitory effect, which was quite expressive (by about 3

fold) in the case of nanogels. FucA:PEG10 and FucA:PEG15 also showed a

dose-dependent effect, reaching saturation at around 0.04 and 0.06 mg/mL respectively. In

addition, the data also indicate that FucA:PEG15 is slightly more efficient as an

antiproliferative compound than FucA:PEG10.

(42)

Figure 5. Inhibition of proliferation of 786 cells incubated with Fucan A,

FucA:PEG10, or FucA:PEG15 nanogels at various concentrations for 24

hours. Data are expressed as means ± standard deviation. a,b,c,d,e The

different letters indicate significant difference between the concentrations

of the same compound (p < 0.05).

2.6. Apoptotic effect of fucan A nanogels

Since FucA:PEG15 was the most potent cell growth inhibitor, it was chosen for

mechanistic studies, namely to determine whether cell death for apoptosis was

responsible for the observed effect. For this purpose, 786-0 cells were treated with

FucA:PEG15 (64 µg/mL) for 24 hours, followed by flow cytometric analysis.

Cell apoptosis features the exposure of phosphatidylserine on the external side of the

cell membrane, which can be recognized by annexin V. On the other hand, necrotic

cells can be identified using propidium iodide (PI), which stains only necrotic cells

bearing a compromised, porous cell membrane. Generally, cells stained with annexin V

are indicative of early apotosis and stained cells with PI, indicative of necrosis, while

double labeling is indicative of late apoptosis [34].

(43)

In order to determine the role of caspases in the FucA:PEG15 nanogel-induced

apoptosis, 786-0 cells were incubated with ZVAD-FMK. As can be seen in Figure 6B,

in the presence of this pan-caspase inhibitor, the percentage of cells positive for annexin

decrease from 39 to 27%. Additionally, in the presence of E64 (cysteine peptidase

inhibitors, mainly cathepsin and calpains specific) the effect also decreased to about

10% of inhibition (Figure 6D). These data indicate that FucA:PEG15 has a complex

mechanism of apoptosis induction.

Several fucans have been shown to induce apoptosis in different types of tumor cells,

an event often related to caspase activation [35,36,37]; however, other proteins involved

in cell survival pathways may be affected by the presence of fucans in the culture

medium, such as proteins from ERK1/2MAPK pathway [16,38] and PI3K/AKT

pathway [13], apoptosis-inducing factor (AIF) [10], JNK/c-Jun/AP-1 pathways, and

death receptor-mediated and mitochondria-mediated apoptotic pathways [14].

The analysis of the aforementioned data suggests that the mechanism of apoptosis

induction by fucans is very complex, in agreement with the results obtained in this work

using the fucan A nanogel. Further work will be dedicated to identifying mainly the cell

proteins involved in the FucA:PEG15 mechanism of action to induce apoptosis.

Figure 6. Cytometry with cells 786-0. A) Control (Anexin + PI); B)

(44)

2.7. FucA:PEG15 intracellular uptake

The intracellular uptake of nanogels was investigated by confocal microscopy and

flow cytometry. For this purpose, the nanogel was conjugated with FITC and used as

fluorescence probe, allowing the observation of its interaction with the 786-0 cells.

The antiproliferative effect (around 40% for a concentration of 0.06 mg/mL) was not

affected by the FITC labeling. It is important to mention that FITC alone has no activity

on 786-0 cell proliferation (data not shown). The confocal observation of 786-0 cells

after incubation with FucA:PEG15+FITC for 1 h allowed the detection of internalized

fucan nanogel (Figure 7B). In addition, the nanogel is observed in the perinuclear space

(Figure 7C). The free FITC was also assayed under the same conditions and did not

show any binding to cells or extracellular matrix (data not shown).

The internalization kinetics was analyzed by flow cytometry (Figure 7). As can be

seen in Figure 7D, 15 min suffice for the cells to become labeled with

FucA:PEG15+FITC. Furthermore, the incubation of the cells in the presence of an

excess of fucan A (ten times more) prevented the entry of the nanogel into the cell,

probably because the same cell receptor/endocytic pathway was used.

Lira and colleagues [25] assigned a similar antiproliferative activity against J774

macrophages and NIH-3T3 fibroblasts to fucan nanoparticles. These authors also

showed that the fucan nanogels need to be internalized in order to exert their

antiproliferative activity. In order to confirm this hypothesis, the cells were exposed to

FucA:PEG15 nanogels (from 0.01 to 0.1 mg/mL) for 2 hours at 4 °C (condition in

which the endocytosis is substantially inhibited). After washing and addition of medium

without nanogel, the cell proliferation was measured after 24 hours. In another set of

experiments the 786-0 cells were incubated with FucA:PEG15 nanogels (from 0.01 to

0.1 mg/mL) for 6, 12, 18, and 24 hours at 4 °C. In both set of experiments,

FucA:PEG15 nanogels did not demonstrate an antiproliferative effect (data not shown).

Figure 7. Confocal microscopy and flow cytometry of 786-0 cells treated

(45)

2.8. Antioxidant activity of the nanogel

Antioxidants are substances that are useful for fighting cancer and other processes

that potentially lead to various diseases; antioxidants act by preventing the onset of

cancer during carcinogenesis, and they are generally beneficial to cells [39].

In this work, the antioxidant activity was evaluated in different assays: reducing

power, DPPH radical-scavenging assay, superoxide radicals, and total antioxidant

capacity (TCA). The results are shown in Table 2. The FucA:PEG15 nanogel and fucan

A did not show antioxidant activity in power reducing, superoxide anion scavenging,

and DPPH radical-scavenging assays. However, in the total antioxidant activity assay,

both the nanogel and fucan A were positive.

Table 2. Antioxidants activities with nanogel and fucan A.

Antioxidant activity

Fucan A

FucA:PEG15

Reducing power (%)

nd

DPPH (%)

nd

Superoxide radical (%)

0.0

1.6 TCA (mg/g ascorbic acid equivalents)

26.20

a

36.31

b

(46)

2.9. Anticoagulant activity of the nanogel

Fucans from various seaweeds, including different Dictyotales [31,40], possess

anticoagulant activity. In this way, we evaluated the anticoagulant activity of

FucA:PEG15 using the PT and aPTT test. But in all conditions evaluated (from 10 to

100 µg/mL), FucA:PEG15 showed no anticoagulant activity (data not shown).

2.10. FucA:PEG15 inhibits the angiogenesis

Using the matrigel assay, we investigated whether FucA:PEG15 can inhibit

angiogenesis in vitro. This matrigel is composed mainly of laminin, TGF-

, and

entactin, and has been used to study angiogenesis in vivo and in vitro [41]. As shown in

Figure 8 (B, C, and D), the nanogels inhibit the formation of capillary-like tubes by

endothelial cells. The FucA:PEG15 significantly inhibited capillary tube formation with

increasing concentration of nanogel, 12.5 µg/mL (Figure 8B) to 100 µg/mL (Figure

8D), compared to the control group (Figure 8A). In addition, the nanogels did not show

any cytotoxic effect against RAEC cells, even when they were incubated on the matrigel

(data not shown).

(47)

Figure 8. Effects of nanogel on capillary tube formation of rabbit aortic

endothelial cells (RAEC). The cells were non-treated (A-control group)

and treated with different concentrations of FucA:PEG15 (B- 12.5

g/mL, C

-

50 g/mL, and D

-

100 g/mL). 50x magnification.

3. Experimental Section

3.1. Materials

(48)

Spatoglossum schröederi was obtained as described by Almeida-Lima and colleagues

[18].

3.2. Synthesis of fucan A nanogels

Fucan A (10 mg, 50 µmol) dissolved in 0.1 M citrate buffer (pH 3.0) was reacted

with sodium periodate (112 mg, 523 µmol) for 2 h at 4 ºC. After dialysis against

distilled water (Mw cutoff of 6 kDa), the oxidized fucan A was reacted for 2 h with

cysteamine hydrochloride (60 mg, 523 µmol) in 0.1 M phosphate-buffered saline (PBS,

pH 7.0). Then, 10 ml of 0.1 M NaBH

4

solution was slowly added, and the mixture was

stirred for 1 h at 4 ºC. The solution was dialyzed and then lyophilized. Thiolated fucan

A was solubilized in DMSO. Five milligrams of thiolated fucan was mixed with PEG in

distilled water at different weight ratios of PEG to thiolated fucan A, and then

lyophilized. The dried mixture of thiolated fucan A and PEG was solubilized in 10 mL

of DMSO with incubation for 4 h at 37 ºC. The solution was sonicated for 3 min using a

Sonicator Sonics Vibra-Cell (20 kHz, output control 3) to facilitate the oxidation

reaction of thiol groups. The resultant fucan A nanogels were purified by extensive

dialysis against distilled water (Mw cutoff of 12 kDa). The degree of thiolation was

estimated as approximately 24%, by comparing the relative peak intensity ratio found in

2600

–

2550 cm

−1