Revista da Socie dade B rasileira de M edicina Tropical Í7 (3 ):l43-148, ju l-s e t, 1994.
HEMOCULTURA: TÉCNICA SENSÍVEL NA DETECÇÃO DO
TRYPANOSOM A CRUZI
EM PACIENTES CHAGÁSICOS NA
FASE CRÔNICA DA DOENÇA DE CHAGAS
Zélia M .P. Luz, Micheli G. Coutinho, J. Romeu Cançado e Antoniana U . Krettli
A s ensibilidade de hemoculturas, realizadas um a ou três vezes, f o i estudada em 52pacie nte s na fa s e crônica da doença de Chagas. M odificações fo ra m introduzidas na técnica tais como, dim in uição do p erío do de processam ento do sàngue, hom ogeneização suave e exam e até 120 dias d o cultivo. Os resultados m ostram alto pèrcentu al de positividade, ou seja, 79% e 94% d o s p a c ie n te s fo ra m positivos, respectivam ente, com um ou três testes. A ju lg a r p e la núm ero de tubos positiv os, em cada paciente, a parasitem ia fo i baixa em 59% deles, m édia em 16% e a lta em 25% . Não ho uve diferenças significativas nos resultados positivos em fu n ç ã o da idade dos pa cien tes, que variou de 14 a 82 anos. Nossos resultados dem onstram que a hem ocultura é u m a m etodologia sensível p ara o diagnóstico parasitológico da doença de Chagas e ideal p a ra m onitorar cura em pacie ntes subm etidos a tratamento .
P alavras-chaves: H em ocultura. Trypanosoma cruzi. Cura parasitológica. Paciente chagásico.
O diagnóstico da doença de C hagas, em pacientes ma fase crô n ica, é realizad o prin cip alm en te através de testes so ro ló g ico s convencionais tais com o, im u n o flu o rescên cia in d ire ta , h em ag lu tin ação e fixação do com plem ento. T al fato é decorrente dos baixos n ív eis de parasitem ia, característicos, dessa fase d a doença2. N o en tan to , ap ó s o tratam ento e s p e c íf ic o , a s o r o lo g ia c o n v e n c io n a l p o d e p e rm an ecer p o sitiv a p o r lo n g o s p e río d o s nos pacientes q u e ap arentem ente elim in aram o parasita7 10. C am u n d o n g o s tratad o s com, n ifu rtim o x ou b e n z o n id a z o l tam b ém a p re se n ta m a so ro lo g ia convencional p o sitiv a n a total ausência de infecção ativa1. P o rtan to , a in tro d u ção de m etodologias capazes d e ev id en ciar o T ry p a n o so m a c ru zi n o paciente chagásico, com o o b jetiv o de discrim inar in d iv íd u o s c u ra d o s d e n ã o c u ra d o s, to m a -se fundam ental. A h em o cu ltu ra e o xenodiagnóstico,
C entro d e Pesquisas R ené R achou/Fundação Oswaldo C ruz e Faculdade de M edicina da U niversidade Federal de M inas O erais, Belo H orizonte, M G .
Apoio financeiro: C N P q e Program a de Apoio à Pesquisa (PAPES) - FIO C R U Z
E n d ereç o p a r a co rre sp o n d ê n cia : Profa. A ntoniana U rsine Krettli. L aboratório de M alária - C entro de Pesquisas René
R achou/F IO C R U Z , Caixa Postal 1743 , 30161-970 Belo
H orizonte, M G ; Fax: (031) 295-3115. R ecebido para publicação em 13/01/94.
m étodos p arasitológicos m ais usados n a pesquisa do T. cru zi, em pacientes crô n ico s, d etectam o parasita em cerca d e 5 0 % dos casos, q u an d o o teste é realizado u m a ú n ica vez5. R ecentem ente, n a A rgentina, h em o cu ltu ras realizadas até 8 vezes em 90 chagásicos crônicos não tratados, foram positivas em 8 6 ,6% d os pacientes9. E m trab alh o recente, dem onstram os que h em o cu ltu ras realizadas u m a ún ica v ez em 101 pacientes não tratad o s resu ltaram em 47% d e p o sitiv id a d e , en q u an to co m duas hem oculturas em 13 chagásicos não tratad o s a p o sitiv id a d e fo i d e 5 6 % . E n tr e ta n to , to d as as h em oculturas foram p ersisten tem en te n egativas em p acien tes tratad o s e c u ra d o s a ssim co m o n os dissociados n o s quais a p esq u isa d e anticorpos líticos foi negativa apesar d a so ro lo g ia convencional p o sitiv a7.
L u z ZM P , Coutinho M G , C a n ça d o JR , K rettliA V . H em ocultura; técnica sensív el na d etecção do Trypanosoma cruzi em p a c ie n te s chagá sico s na fa s e crônica da doença de Chagas. R evista da Sociedade B rasileira de M edicina T ropic al 27:1 43-148, ju l-se t, 1994.
M A T E R IA L E M É T O D O S
P a c ie n te s c h a g á sic o s: 52 pacientes não tratados na fase crô n ica da infecção p elo T. cru zi, com pelo m enos 3 reações sorológicas positivas p ara antígenos d o parasita, foram subm etidos a hem ocultura. D esse total 34 eram m ulheres e 18 eram hom ens, com idades varian d o de 14 a 82 anos (T abela I). O n ú m ero d e hem oculturas realizadas e o intervalo en tre as coletas de sangue foram definidos em função d a d isp o n ib ilid ad e dos pacientes sendo em m édia de 2 a 4 sem anas e de no m áxim o 3 m eses. T o d o s os chagásicos dessa am ostra não haviam se s u b m e tid o , a n te r io rm e n te , a q u a lq u e r te ste p arasito ló g ico para doença de C hagas e desses, 34 realizaram três testes seriados.
Tabela 1 - Total de hem ocultura s p o sitiva s em 52 pacientes chagásicos não tratados em fu n çã o da fa ix a etária subm etidos a uma única hemocultura.
Faixa Pacientes Positivos/Total
etária Masculino Feminino examinados
0 - 1 9 1 1 2/2 100%
2 0 - 3 9 9 12 19/21 90%
4 0 - 5 9 6 18 17/24 71%
> 6 0 2 3 4/5 80%
Hemocultura: A técnica utilizada foi baseada na d escrita p o r C h iari e cols. 1989® com m odificações. R esum idam ente, 30 m l de sangue foram coletados d e c a d a p a c ie n t e e m tu b o s “ V a c u t a in e r ” h ep arin izad o s, tran sferid o s p ara tubo F alcon 2070 e im ediatam ente centrifugados após a coleta (4000g
1 Omin 4 o C ). O plasm a foi cuidadosam ente rem ovido p a ra tu b o de 15m l F alco n 2095, a fim d e não ser a s p ira d a a cam ad a le u c o c itá ria , e n o v am en te c en trifu g ad o (4000g 2 0m in 4 °C ). O sobrenadante foi re tira d o , aliq u o tad o e estocado a -2 0 °C p ara as reações sorológicas p o sterio res. A o sedim ento do plasm a foram adicionados 4m l do m eio de cultura “ L iv e r In fu sio n T ry p to se ” (L IT )3. O sedim ento de hem ácias contendo a cam ada leucocitária foi lavado um a vez em L IT (4000g 20 m in 4 °C ),ressuspendido em 10 m l do m eio de cu ltu ra e distribuído em 6 tu b o s F alco n 2095 contendo 2m l do L IT cada. U sando esse p rocedim ento o tem po gasto p ara p ro cessar a h em o cu ltu ra foi de, n o m áxim o, 30 m inutos. A s cu ltu ras foram m antidas a 2 8 °C ,
hom ogeneizadas, suavem ente, um a vez p o r sem ana e alíquotas de lO /il da suspensão, de cada tubo, exam inadas m ensalm ente, en tre lâm ina e lam ínula, durante 120 dias ao m icroscópio ótico.
R E S U L T A D O S
D os 34 pacientes chagásicos não tratados que realizaram três hem oculturas sucessivas, 32 (94% ) foram positivos, sendo 27 (79 %) no p rim eiro teste, 4 (12% ) n o segundo e 1 (3% ) n o terceiro. A s hem oculturas d e d o is pacientes foram negativas após os três testes realizad o s. A p ercen tag em cum ulativa de positividade nos três testes está ilustrada n a F ig u ra 1. N a m aio r p arte dos pacientes os resultados foram po sitiv o s aos 30 dias (48 %) e 60 dias (34% ) respectivam ente. N o entanto, 14% foram p o sitiv o s som ente aos 90 dias e 4% aos 120 dias d e cultivo (F ig u ra 2).
A possível influência da idade do paciente na p o sitiv id ad e da hem o cu ltu ra foi analisada som ente após o prim eiro exam e. O n ú m ero de ind iv íd u o s estudados p o r faixa etária foi variável sendo que a m aioria deles (86 %) ficou con cen trad a no -intervalo de 20 a 59 anos. E m todas as faixas etárias havia hom ens e m ulheres. As hem oculturas foram positivas nos 2 pacientes m ais jo v e n s (14 e 19 a n o s ) ; em 19 dos 21 pacientes en tre 20 a 39 anos; em 17 d os 21 pacientes en tre 40 a 59 anos; e, em 4 dos 5 pacientes com sessenta anos ou m ais (T abela 1). P o rtan to , foi alto o p ercen tu al de resu lta d o s p o sitiv o s nas diferentes faixas etárias varian d o d e 71 % a 100 % . N ão h o u v e diferença estatística sig n ifican te en tre os grupos utilizando o teste do q u i-q u a d ra d o p = 0 ,0 6 .
O nível d e parasitem ia dos pacientes foi estim ado através da po sitiv id ad e dos 6 tubos u tilizad o s p ara cada exam e. P acientes com apenas 1 o u 2 tubos positivos foram considerados d e b aix a parasitem ia; com 3 tubos positivos de m édia parasitem ia, e, com 4 ou m ais tubos po sitiv o s d e alta parasitem ia. U tilizando esse p arâm etro , v erificam o s q u e en tre os 52 p a c ie n te s, 31 (5 9 % ) a p re s e n ta ra m b a ix a p arasitem ia, 8 (1 6 % ) m éd ia e 13 (2 5 % ) alta parasitem ia (F ig u ra 3).
Q uando analisam os o núm ero d e tubos positivos em função d a faixa etária dos pacientes observam os que os 2 chagásicos m ais jo v e n s e os 5 m ais idosos apresentaram b aix a parasitem ia. N o s o u tro s d o is g rupos etários (20 a 39 e 4 0 a 5 9 anos) totalizando
L u zZ M P , Coutinho M G , Cançado JR , KrettliA U . H em ocultura: técnica se nsível na d etecção do Trypanosom a cruzí em p a c ie n te s chagá sico s na fa s e crônica da doença de Chagas. R evista da Socie dade B rasile ira de M ed icin a T ro p ica l 27:143-1 48, ju l-se t, 1994.
45 pacientes 23 (51% ) apresentaram baixa parasitemia, 7(15% ) pacientes média parasitemia e 12 (27%) pacientes alta parasitemia. Portanto, a maioria dos pacientes apresentou parasitemia baixa, independentemente da sua idade (Figura 4).
DISCUSSÃO
Evidenciar o T r y p a n o s o m a c r u z i no paciente chagásico, através de testes parasitológicos, é a forma definitiva de caracterizar a infecção ativa; no
L u zZ M P , C outinho M G , Cangado J R , K rettti A U. H em ocultura: técnica se n sív e in a detecçã o d o Trypanosom a cruzi em p a c ie n te s ch a g á sico s na fa s e crônica d a doença de Chagas. R evista da S ociedade B rasileira de M ed icin a T ro p ica l 27:143-148, ju l-se t, 1994.
diagnóstico exige insetário cora grande número de insetos que sejam biologicamente constantes4.
Na hemoculturaa positividade parece depender tanto da natureza do meio de cultura como da técnica empregada e modificações na metodologia têm proporcionado resultados mais positivos. Assim coletar maiores volumes de sangue do paciente, retirar fatores inibidores do crescimento do parasita, prolongar o tempo de cultivo e realizar o teste repetidas vezes têm sido as abordagens mais usadas com sucesso6 u . Os resultados nesse trabalho mostraram que três hemoculturas foram capazes de
detectar o
T . c r u z iem 94% dos pacientes. No
L u z Z M P , C o u t i n h o M G , C a n ç a d o J R , K r e t t l i A U . H e m o c u l t u r a : t é c n i c a s e n s í v e l n a d e t e c ç ã o d o Trypanosoma cruzi • m p a c i e n t e s c h a g á s i c o s n a f a s e c r ô n i c a d a d o e n ç a d e C h a g a s . R e v i s t a d a S o c i e d a d e B r a s i l e i r a d e M e d i c i n a T r o p i c a l 2 7 : 1 4 3 - 1 4 8 , j u l - s e t , 1 9 9 4 .
responsáveis pela elevada sensibilidade da hemocultura descrita nesse trabalho.
O tempo prolongado de cultivo (120 dias) demonstrou ser importante. De modo geral a maior parte dos autores fazem o último exame da hemocultura aos 45 ou 60 dias do cultivo. Entretanto, nesse trabalho cerca de 20% dos pacientes só se positivaram mais tardiamente, após os 60 dias da cultura, corroborando dados anteriores7. Outra possibilidade para explicar a maior positividade, com apenas uma hemocultura, poderia ser a parasitemia elevada dos pacientes com os quais trabalhamos, Se na nossa amostra prevalecessem chagásicos de alta parasitemia, mesmo com uma tónica hemocultura o índice de positividade dos tubos examinados seria elevado. Entretanto, nos nossos resultados 59 % dos pacientes foram de baixa parasitemia, isto é, com um ou dois tubos positivos dos seis examinados. Portanto não trabalhamos somente com pacientes de alta positividade. Na classificação da parasitemia dos pacientes, entretanto, não levamos em consideração possíveis dificuldades adaptativas e nutricionais que poderiam influenciar no crescimento do parasita nas condições do nosso trabalho12.
A hemocultura foi capaz de detectar o T . c r u z i mos pacientes, independentemente do tempo de infecção já que não foram observadas diferenças significativas na positividade das hemoculturas nas várias faixas etárias dos pacientes. Nos diferentes grupos verificamos um alto percentual depositivos, mesmo entre os mais idosos, entre 64 a 82 anos. Apesar da amostra ser pequena nesse grupo, 80% deles foram positivos na primeira hemocultura e 100% ao final dos três testes. Todos apresentaram, mo entanto, baixa parasitemia, isto é, um a dois tubos positivos. Esses pacientes, provavelmente possuem a doença há mais de 50 anos se considerarmos que todos se infectaram na primeira década de vida. Os dois pacientes mais jovens (14 e 19 anos), positivos pela hemocultura, também apresentaram baixa parasitemia a j ulgar pelo número iáe tubos positivos. No entanto, como o número de indivíduos nesses dois grupos foi baixo, possíveis inferências relacionadas ao grau de parasitemia versus idade necessitam ser melhor investigadas n u ma amostragem maior de pacientes.
Nossos resultados, mostram que a técnica de hemocultura, com as modificações na metodologia
aqui introduzidas, revelou parasitas num percentual elevado de pacientes chagásicos não tratados, na fase crônica, a despeito da sua idade e da sua parasitemia, medida pelo número de tubos positivos, em geral, baixa. A hemocultura demonstrou portanto, ser um teste sensível no diagnóstico da doença de Chagas sendo ideal como critério de cura de chagásicos submetidos a tratamento. Nesses pacientes, hemoculturas persistentemente negativas são um forte indicador de cura parasitológica, mesm o que a sorologia con ven cion al seja persistentemente positiva.
SUMMARY
The sensitivity o fh e m o c u ltu r e s, p e r fo rm e d o n c e o r th ree tim es, w a s in v estig a ted in 5 2 p a tie n ts in th e c h ro n ic p h a s e o f C hagas d isease. M o d ifica tio n s w e re in tro d u ced in th e tech n iq u e su c h a s, p ro c e ss in g th e b lo o d m o re ra pid ly, gently h o m o g en izin g th e cu ltu re s a n d exam in in g them a fte r 1 2 0 d a y s o f cu ltu re. O ur resu lts s h o w a h ig h p e r c e n t a g e o f p o sitivity i.e. 79% a n d 94% o f p a tie n ts subm itted, resp ectively, to one o r th ree tests. N o sig nificant d ifferen ces re la te d to th e p a tie n ts a g e w ere d etected , w hich va ried fr o m 14 to 82 y e a r s old. O ur resu lts dem o n stra te th a t h em o c u ltu re is a sen sitiv e m e th o d f o r th e p a ra sito lo g ic a l d ia g n o sis o f C ha g a s d ise a se a n d is id e a l f o r m onito rin g cu re in tr e a te d pa tien ts.
K ey-w o rd s: H em o c u ltu re . Trypanosom a cruzi.
P a rasitolo gic al cure. C hagasic p a tie n ts.
AGRADECIMENTO
Ao Prof. Zigman Brener pela leitura crítica do manuscrito e sugestões.
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