Ensaio cinético para reações de fixação de complemento no sistema moléstia de Chagas.

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ENSAIO CINÉTICO PARA REAÇÕES DE FIXAÇÃO DE

COMPLEMENTO NO SISTEMA MOLÉSTIA DE CHAGAS *

José Oliveira de Almeida * * Therezinha A. Cunha * * * Laurentina M. Souza * * *

U m e n s a io p a r a a a v a lia ç ã o d a r e a t i v i d a d e d e a n t í g e n o s d e T r y p a n o s o m a c r u z i , b a s e a d o n a m e d i d a d o c o m p l e m e n t o l i v r e p e l o t e m p o n e c e s s á r io à h e m ó lis e d e 5 0 % p ô d e s e r a p l i c a d o n a d e t e r m i  n a ç ã o d a d o s e d e m á x i m a r e a t i v i d a d e d e a n t í g e n o s , e m r e a ç õ e s c o m o s ô r o c h a g á s ic o d e r e f e r ê n c ia .

Q u a n d o s e a v a l i a , p o r m é t o d o c i n é t i c o , a s q u a n t i d a d e s d e c o m p l e m e n t o liv r e , e m r e a ç õ e s i n c u b a d a s , p o r v á r io s p e r í o d o s d e t e m p o e s e p r o j e t a m e m l o g a r i t m o s o s t e m p o s n e c e s s á r io s p a r a 5 0 % d e h e m ó l i s e , c o n t r a o s t e m p o s d e in c u b a ç ã o , d e t e r m i n a m - s e p o n t o s s o b r e u m a r e t a , c u jo s p a r â m e t r o s c a r a c t e r i z a m a c a p a c i d a d e f i x a d o r a d o c o m p l e m e n t o , d o s c o m p l e x o s im u n e s .

O m é t o d o c i n é t i c o s e r e c o m e n d a p e l a s u a p r e c is ã o , f á c i l e x e c u ç ã o e r a p i d e z , n a c o m p a r a ç ã o d e a n t í g e n o s , e m r e a ç õ e s d e f i x a ç ã o d o c o m p l e m e n t o .

INTRODUÇÃO

A fixação de com plem ento pelo com plexo antígeno-anticorpo pode ser apreciada pela medida do com plem ento livre durante o perío do de incubação, desde que se conheça a quan tidade de com plem ento inicialm ente presente. A medida do com plem ento livre é fe ita pelo tem po necessário para 50% de hemólise de um volum e estipulado de hemácias sensibiliza das (1,5).

Dessa fo rm a , o ensaio de antígenos de T. cruzi, pode ser feita em reações com um sôro de referência para m oléstia de Chagas, baseado nas seguintes premissas:

1? Reações de fixação de com plem ento feitas nas mesmas condições, e com os mes mos terão deixado livre a mesma quantidade de com plem ento que levará o mesmo tem po para hemólise de 50%.

2? Quando as reações são feitas, nas mes mas condições, mas com antígenos que d ife rem quali ou quantitativam ente, as suas veloci dade de hemólises são diferentes.

MATERIAL E MÉTODOS

Sôro Chagásico

Em todos os ensaios fo i empregado o sôro de referência chagásico da Organização Pana- mericana de Saúde2 . O sôro lio filiz a d o fo i re co n s titu íd o com água destilada e inativado a 56°C por 30 m inutos.

Antígenos de T. Cruzi

Os antígenos fo ra m preparados segundo a técnica descrita por A L M E ID A & F IF E 2, de form as de cultura de T. cruzi, cepa Y , lio fili- zadas e m antidas em vácuo. Desse material fo ram preparados o antígeno aquoso (n9 4 de A L M E ID A & F IF E 2 e o antígeno m etílico, segundo B A R A C C H IN I ET A L 3 ). Do antígeno aquoso n? 4 fo i isolada uma fração em coluna de SE P H A D E X G200. Todos os antígenos as sim preparados provinham de um único lote de tripanosom as liofilizados.

* T r a b a l h o r e a l i z a d o c o m o a u x í l i o d o C o n s e lh o N a c i o n a l d e D e s e n v o l v i m e n t o C i e n t í f i c o e T e c n o l ó g i c o . S Í P 0 8 / 0 5 3 .

* * P r o f e s s o r c a t e d r á t i c o d o D e p . d e P a r a s it o lo g ia . M i c r o b i o l o g i a e I m u n o l o g i a d a F a c u l d a d e d e lM e d ic in a d e R i b e i r ã o P r e t o U n . S ã o P a u Io .

* * * T é c n ic a s e m I m u n o l o g i a d o D e p . d e P a r a s it o lo g ia , M i c r o b i o l o g i a e I m u n o l o g i a d a F a c u l d a d e d e M e d i c i n a d e R i b e i r ã o P r e t o .

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Com plemento

0 com plem ento lio filiza d o , reconstituído com água destilada, fo i preservado pelo m éto do de A L M E ID A & F IF E 2. Todos os ensaios foram feitos com com plem ento de um único lote (n9 291).

D iluente, Hemácias e Hemolisina

O diluente empregado era a solução salina boratada, adicionada de cálcio e magnésio4 . O sistema hem olítico fo i preparado de acordo com as especificações de A L M E ID A & F IF E 2, empregando-se a hemolisina em dose de máxima sensibilização e as hemácias a 5%, aferidasfo- tometricam ente.

Métodos

A medida do grau de hemólise fo i feita com as hemácias em suspensão, de acordo com A L M E ID A 1. Padrões foram preparados para hemólises de 0% a 100%, medindo-se a transmissão em fo to -c o lo rím e tro C O LEM AN JU N IO R , em com prim ento de onda de 580.

O volume da m istura de antígeno, sôro e complem ento era de 1,4ml e o das hemácias sensibilizadas de 0,6. Tão logo se juntavam as hemácias sensibilizadas, o tem po era medido por cronógrafo de precisão, mantendo-se o tu bo (de 12 x 75m m) no adaptador construído para p e rm itir a circulação de água a 37°C , mantendo-se, em to do o ensaio, a mesma tem peratura.

Na determ inação da dose de m áxim a

reati-vidade do antígeno, este é d ilu íd o em série ■geométrica, razão 0,5, e cada d iluição é posta a reagir com o sôro chagásico de referência e com excesso de com plem ento. Depois de 30 m inutos de incubação a 37°C , juntam-se as hemácias sensibilizadas e determina-se o tem po necessário para 50% de hemólise, em foco- -colorím etro .

Na medida da capacidade fixa do ra do com plem ento imune, a dose de máxim a reatividade do antígeno é empregada com o sôro cha gásico, convenientem ente d ilu íd o e em exces so de com plem ento. Tomam-se então a líqu o tas da m istura, m antida em banho-maria a 37°C , depois de 10, 30, 50, 70 m inutos de incubação, juntam-se as hemácias sensibiliza das e medem-se os tempos necessário para 50% de hemólise.

R ES U LTAD O S

Determinação da Dose

de M áxim a Reatividade do A ntígeno

O antígeno CDC 10-75 fo i reconstituído com solução salina e d ilu íd o em série de 1/20 à 1/2560, d istrib u íd o s 0,5m l de cada diluição de antígeno a que se ju n to u sôro chagásico di- lu íd o a 1/5 num volum e de 0,5 m l. Depois de 5 m inutos, juntou-se 1 ml de com plem ento d i luído a 1/20. A incubação a 3 7°C fo i de 10, 30 e 50 m inutos. A 1,4ml da m istura fo ram adicionados 0,6m l de hemácias sensibili zadas e o tem po necessário para 50% de he mólise fo i m edido. Os resultados obtidos es tão apresentados ria T A B E L A 7( F IG U R A 1.

TABELA 1

Derterm inação da dose de m áxim a reatividade do antígeno

Tem po de

incubação 20 40

Diluições do antígeno CDC 10-75 1/

80 160 320 640 1280

10 min. 307 351 298 288 280 320 296

30 min. 432 495 368 340 311 371 313

50 min. 580 610 430 377 352 398 350

A dose de m áxim a reatividade está na diluição a 1/40.

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F IG U R A 1

A N TÍG E N O DE T. C R U ZI C. D. C. 10 - 75

I i i ■_____ i______ i l 1--- 1—

20 40 80 160 320 640 12802560

LOG. D IL U IÇ Õ E S DE A N T fG E N O

Verificou-se que na diluição de 1/40 o com plexo im une fix o u mais com plem ento que os outros, e d a í sobrar menos com plem ento li vre, denunciado pelo m aior tem po necessário para 50% de hemólise.

Podemos notar que o excesso de antígeno (1/20) exigiu m enor tem po para hemólise, sig

nificando m enor fixação de com plem ento, por um fenôm eno de zona.

Determinação Cinética dá Atividade dos Antígenos

Três antígenos fo ra m comparados em pro vas de cinética, em reações com doses de má xim a reatividade, mantendo-se constantes as quantidades de sôro chagásico e de com ple m ento. O antígeno m e tílic o 3 fo i d ilu íd o a 1/160, o antígeno aquoso a 1/40 e a fração 1 do antígeno aquoso a 1/20.

Foram postos a reagir, 0,5m l do antígeno d ilu íd o para ter a máxim a reatividade, 0,5ml da diluição a 1/5 do sôro chagásico.

Depois de 5 m inutos, juntou-se comple m ento (2m l da diluição a 1/20), complemen tando-se o volum e para 5ml. Dessa mistura, m antida a 37°C , foram retirados 1,4ml a que se juntaram 0,6m l de hemácias sensibilizadas, depois de 10, 30, 50 e 70 m inutos. Mediram- se os tempos necessário para 50% de hem óli se. Os resultados obtidos estão apresentados na T A B E L A 2.

Quando se projetam os logaritm os dos tempos necessário para 50% de hemólise, em ordenadas, contra os tempos de incubação a 370C, determinam-se pontos sobre uma linha de regressão, cujos parâmetros definem o an tígeno.

DISCUSSÃO

Na determ inação da reatividade de antíge no, a reação que exige mais tem po para

hemó-TABELA 2

Tempos necessários para 50% de hemólise em reações incubadas a 370C por 10, 30, 50 e 70 m inutos

A ntígeno de

T. Cruzi 10

Tem po de incubação a 3 7°C , em m inutos

30 50 70

M e tílico n9 761213

Aquoso 760130

Fração I

Tem po em segundos necessários para 50% de hemólise

310 501 810 1405

240 290 352 425

252 306 360 452

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F IG U R A 2

CINÉTICA DA FIXAÇÃO DE COMPLEMENTO

- o _ ANT ÍGENO MET f l J CO DE T. CRUZI

MINUTOS A 37oc

lise de 50%, indica a dose de m áxim a reativi dade da antígeno, que na experiência da T A BELA 1 corresponde à diluição de 1/40 para o antígeno CDC 10-75.

Na comparação de antígenos, pelo m étodo cinético, as linhas de regressão no sistema lo- g aritm ico de tem po contra tem po de incuba ção, podem se apresentar superpostas, parale las ou divergentes.

Antígenos iguais, em concentração e com posição, apresentam linhas superpostas, com o mostra a F IG U R A 2 , para os antígenos aquoso e a fração 1. A fração, separada do antíge no aquoso, por crom atografia em SEP H A — DEX G-200, reagiu da mesma fo rm a que o an- tígeno aquoso, to ta l, caracterizando a especifi cidade da fração 1, com o sôro chagásico de referência.

Já o antígeno m e tílico , a sua linha de re gressão é divergente da do aquoso. Dos 3 antíge nos experim entados nesse ensaio, o m e tílico apresentou m aior reatividade que os aquosos.

A interpretação de reações com linhas para lelas, como na F IG U R A 3, deve ser fe ita con siderando:

19 As retas são paralelas no sentido das orde nadas (de A ' a B '), sendo essa diferença, em logaritm os, indicando então quantas vezes o antígeno A fix a mais com plem ento que o an tígeno B, em um mesmo tem po de incubação a 37°C.

F IG U R A 3

C O M P A R A Ç Ã O DE A N TfG E N O S

M IN U TO S A 3 7°C

29 As retas são paralelas no sentido das abscissas. A diferença entre C e D (F IG U R A 3) cor responde aproxim adam ente à diferença entre 30 e 10 m inutos de incubação. Ora, isso signi fica que o antígeno A em 10 m inutos já fixo u com plem ento na mesma quantidade que o an tígeno B em 30 m inutos, tendo assim um atraso de 20 m inutos. Assim as reações com o antígeno B devem ser incubadas 20 m inutos a mais que aquela do antígeno A .

De acordo com a relação entre tem po de hemólise e concentração de com plem ento (1, 5), podem ser calculadas as quantidades de com plem ento livres, durante os vários perío dos de incubação, determ inando-se então as quantidades de com plem ento fixadas, como mostra a F IG U R A 4. Pode-se constatar que as duas curvas vão se aproxim ando de um ponto com um , correspondente a 70 m inutos de incu bação. Esse tip o de reação somente ocorre quando os antígenos d iferem somente em sua concentração, não em sua composição.

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F IG U R A 4

COMPARAÇÃO DE AN TIÍ3E N 0S

M INUTOS A 37oc

F IG U R A 5

M IN U TO S A 370C

comparação do antígeno aquoso com o a n tí geno m e tílico . Nesse caso, prolongando-se o tem po de incubação, não se igualam as rea ções com o ocorre quando as linhas são parale las.

Calculando-se as quantidades de comple m ento livre, depois dos vários tempos de in cubação, e aquelas fixadas, e projetando es ses valores em ordenadas (com plem ento fix a do) e em abscissas os tem pos de 37oC, verifica- -se que as linhas são paralelas, indicando me nor reatividade do antígeno C em relação ao antígeno A-. (F IG U R A 6).

F IG U R A 6

C O M P A R A Ç Ã O DE ANTl'G ENOS

10

-o

o

<

X

U-O

(-z LU S LU

_ l

O. 5 O o

10 30 50

M IN U TO S A 370C

Quando um mesmo antígeno é ensaiado em várias diluições, suas linhas são paralelas, indi cando tratar-se de reações com diversa intensi dade, mas possíveis de serem igualadas, se o tem po de incubação fo r suficientem ente pro longado (F IG U R A 7).

As linhas de regressão traçadas pelos pon tos determ inados pelos logaritm os dos tem pos necessários para 50% de hemólise (em ordenadas) e pelos tempos de incubação (em abscissas) traduzem as reações exponenciais. expressas com o:

y = a (1 0)bx

onde y = tem po necessário para 50% de he mólise

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F IG U R A 7

A N T ÍG E N O AQUOSO 760130

M IN U TO S A 370C

a = intercessão da linha com o eixo das ordenadas

b = inclinação da linha de regressão.

Da expressão

log y = log a + bx

determ inam -se os valores de a e de 6 com o os parâmetros que caracterizam as reações de fixação de com plem ento.

A plicando o m étodo cinético ao estudo de vários antígenos, os seguintes resultados foram obtidos T A B E L A 3

Podemos apreciar, pelos valores do parâme tro b, que os antígenos BW 89 a BW 105 não diferem entre si, de m odo significativo. A o co ntrário, há bastante diferença entre o a n tí geno m e tílico 761213 e os antígenos aquosos CDC e BW. Os antígenos aquosos 760130 e 760825 apresentam reatividade comparável.

S U M M A R Y

A n assay fo r the evaluation o f the antigens reactivity, based in the determination o f free complement b y the time required fo r 50% he- molysis, couid be applied fo r detection o f the m axim ally reactive dose o f T. cruzi antigens, in reactions w ith the reference Chagasic serum.

When the iogarithms o f the time required fo r 50% hemoiysis are p io tte d against the time o f incubation, the points describe a reggression Une, whose parameters characterized the com- bining capacity o f the immune-complexes, in reactions w ith complement.

The kinectic m ethod is recommended for the preiim inary evaluation of. T. cruzi anti gens, fo r its precision and reliability.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. A L M E ID A , J.O.: o tem po de hemólise nas reações de fixação do com plem ento.

Relações quantitativas entre tem

TABELA 3

Comparação da reatividade de antígenos de T. cruzi pelos valores de seus parâmetros no en saio cinético, com o sôro Chagásico.

AN TÍG E N O D IL U IÇ Ã O a b R Observação

Aq. B.W.89 1/20 91 0,0027 0,99 Os parâmetros a e

Aq. B.W.105 1/20 99 0,0030 0,97 b foram calculados

Aq. C.D.C.10-75 1/20 91 0,0034 0,97 pelo m étodo dos

Aq. 760130 1/20 91 0,0041 0,95 m ínim os quadra

A q . 760825 1/20 100 0,0045 0,98 dos.

Met, 761213 1/160 96 0,0067 0,99

Aq = antígeno aquoso. Met. = antígeno m e tílico . a e b = R = coeficiente de correlação.

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Rev. Soc. Bras. Med. Trop.

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po de hemólise e concentração de com plem ento. Rev. Brasil. Biol. 9: 249-260, 1549

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