ALTERAÇÕES DA JUNÇÃO NEUROMUSCULAR EM MIOPATIAS
EXPERIMENTAIS NO CAMUNDONGO
LUIZ FERNANDO BLEGGI TORRES *
R E S U M O — A s alterações m o r f o l ó g i c a s o b s e r v a d a s em junção neuromuscular de dois m o d e l o s de m i o p a t i a e m c a m u n d o n g o s s ã o estudadas p o r m é t o d o s h i s t o q u í m i c o s para d e m o n s t r a r a t i v i d a d e d a e n z i m a acetilcolinesterase e p o r m i c r o s c o p i a eletrônica. E m ambas as situações os resultados o b t i d o s são s i m i l a r e s , i n d i c a n d o q u e a j u n ç ã o neuromuscular p e r m a n e c e intacta m e s m o quando a f i b r a q u e i n e r v a está s o f r e n d o necrose. E m f i b r a s musculares r e g e n e r a d a s há acentuada s i m p l i f i c a ç ã o das p r e g a s pós-sinápticas, c o m redução d e a t é 50% dos v a l o r e s normais, c o m p r o v a d o p o r estudos m o r f o m é t r i c o s . A ausência d e repercussões f i s i o l ó g i c a s ou clínicas d e t e c t á v e i s nesses m o d e l o s , apesar d a s i g n i f i c a t i v a h i p o t r o f i a d a m e m b r a n a pós-¬ -sináptica, s u g e r e q u e a e x u b e r a n t e q u a n t i d a d e de p r e g a s pós-sinápticas n o r m a l m e n t e encon-t r a d a s nas junções mioneürais p o d e r e p r e s e n encon-t a r mecanismo a n a encon-t ô m i c o de segurança na transmissão q u í m i c a neuromuscular.
The neuromuscular junction in experimental myopathies in the mouse.
S U M M A R Y — M o r p h o l o g i c a l a b n o r m a l i t i e s of the neuromuscular junction in t w o murine m o d e l s w i t h p r i m a r y m y o p a t h y w e r e studied b y c o m b i n e d c h o l i n e s t e r a s e - s i l v e r i m p r e g n a t i o n techniques and electron m i c r o s c o p y . I n b o t h situations the r e s u l t s w e r e s i m i l a r s h o w i n g t h a t t h e neuromuscular j u n c t i o n r e m a i n e d unaffected even w h e n i n e r v a t i n g necrotic muscle f i b r e s . I n r e g e n e r a t e d muscle fibres, h o w e v e r , t h e r e w a s m a r k e d s i m p l i f i c a t i o n of the p o s t - s y n a p t i c m e m b r a n e w i t h reduction in number and depth of folds up to 50% of normal v a l u e s c o n f i r m e d b y m o r p h o m e t r i c analysis. Since after r e g e n e r a t i o n succeded no d e t e c t a b l e clinical o r p h y s i o l o g i c a l a l t e r a t i o n s w e r e o b s e r v e d in these e x p e r i m e n t s i t seems reasonable t o assume that t h e p r o m i n e n t b r a n c h i n g of p o s t - s y n a p t i c f o l d s in normal skeletal muscles m i g h t r e p r e s e n t an increased anatomical safety mechanism in chemical transmission.
A junção neuromuscular ( J N M ) é r e g i ã o especializada de transmissão do poten-cial de ação do nervo periférico para a musculatura esquelética. O conhecimento de seus mecanismos de adaptação e plasticidade diante de diversas doenças neuromuscu-Iares permanece no campo especulativo. N o presente estudo demonstramos alterações m o r f o l ó g i c a s significativas observadas na J N M de fibras musculares esqueléticas em dois modelos experimentais, o camundongo mutante 'mdx' portador de uma miopatia c o n g ê n i t a4 1
e camundongos tratados com fração fosfolipásica do veneno da serpente do mar Enhydrina schistosa8
.
M A T E R I A L E M É T O D O S
A n i m a i s — U m total d e 29 c a m u n d o n g o s 'mdx* c o m i d a d e s v a r i a n d o d e 3 semanas a 12 meses e 27 c a m u n d o n g o s C57B1/10 c o n t r o l e s f o r a m incluídos neste estudo. A l é m destes a n i m a i s 24 c a m u n d o n g o s B a l b C adultos r e c e b e r a m doses intramusculares de 0,03 m i c r o g r a -m a s d e fosfolipase A 2 d e r i v a d a d o v e n e n o d a serpente E n h y d r i n a schistosa d i l u í d o s e -m 1 -m l
* P h D , P r o f e s s o r A d j u n t o d o D e p a r t a m e n t o d e P a t o l o g i a Médica, H o s p i t a l d e Clínicas, U n i v e r s i d a d e F e d e r a l d o P a r a n á .
d e solução d e R i n g e r . P a r a r e s p e c t i v o g r u p o controle, 18 c a m u n d o n g o s r e c e b e r a m solução d e R i n g e r e m i g u a i s v o l u m e s . T o d o s os a n i m a i s c o n t r o l e s f o r a m , d e n t r o d o possível, ajusta-dos p a r a s e x o e i d a d e (39).
D e m o n s t r a ç ã o d e a t i v i d a d e da enzima a c e t i l c o l i n e s t e r a s e — F o i realizada pelos m é t o d o s de N a m b a et al. (30) e d e P e s t r o n k e D r a c h m a n (33), Os animais p r o f u n d a m e n t e anestesiados f o r a m p e r f u n d i d o s p e l o v e n t r í c u l o e s q u e r d o c o m f o r m o l c á l c i o g e l a d o . Os músculos g a s t r o c n ê -mio, plantaris e soleus f o r a m dissecados e r e t i r a d o s dos animais sendo cortados em eriostato a 20 e 30 m i c r ô m e t r o s e r e s p e c t i v a m e n t e corados p e l o s m é t o d o s do i o d e t o de acetiltiocolina e acetato de b r o m o i n d o x i l p a r a d e m o n s t r a r a a t i v i d a d e da colinesterase, seguidos p o r i m p r e g n a -ção a r g é n t i c a p a r a a x ô n i o s .
M i c r o s c o p i a eletrônica — P a r a estudos u l t r a e s t r u t u r a i s o f i x a d o r u t i l i z a d o foi solução m o d i f i c a d a de K a r n o v s k y (26), p o r perfusão intracardíaca. F r a g m e n t o s de soleus foram p ó s - f i x a d o s e m t e t r ó x i d o de ó s m i o a 1%, d e s i d r a t a d o s em álcool, processados e incluídos em a r a l d i t e . C o r t e s l o n g i t u d i n a i s e t r a n s v e r s a i s c o m 1 m i c r ô m e t r o f o r a m c o r a d o s com azul de toluidina e, após seleção da á r e a a p r o p r i a d a , os c o r t e s u l t r a f i n o s o b t i d o s f o r a m corados com acetato de u r a n i l a e c i t r a t o d e c h u m b o e o b s e r v a d o s em m i c r o s c ó p i o e l e t r ô n i c o J E O L 100CX com v o l t a g e m d e aceleração d e 80 k V .
M é t o d o s m o r f o m é t r i c o s p a r a J N M — A análise de u m n ú m e r o de p a r â m e t r o s d e f i n i d o s por E n g e l e Santa (15) e Santa e E n g e l (35) f o i r e a l i z a d a em cortes ultrafinos de músculo soleus. E s t e s cortes f o r a m ajustados n o m i c r o s c ó p i o e l e t r ô n i c o p a r a a l t u ra e m a g n i f i c a ç ã o constante e c a l i b r a d o s com uma g r a d í c u l a p a d r ã o c o n t e n d o 2160 l i n h a s / m m . Cada J N M o b s e r v a d a em cortes seriados a i n t e r v a l o s de 100 m i c r ô m e t r o s foi f o t o g r a f a d a e as fotos a m p l i a d a s a m a g n i f i c a ç ã o final de 20000. Cada a x ô n i o terminal, c o n s i d e r a d o neste estudo c o m o uma J N M i n d i v i d u a l , b e m c o m o sua respectiva m e m b r a n a pós-sináptica, f o r a m estudados com a u x í l i o de a n a l i s a d o r d e i m a g e m K o n t r o n - M O P A M - 3 l i g a d o a m i c r o c o m p u t a d o r R M L 380Z especialmente p r o g r a m a d o p a r a este f i m (39).
R E S U L T A D O S
1. A s p e c t o s n o r m a i s d a J N M — A i n e r v a ç ã o m o t o r a de fibras musculares extrafusais em camundongos t e m v á r i a s s i m i l a r i d a d e s c o m aquela o b s e r v a d a em outras espécies de m a m í f e r o s (6). N e r v o s mistos s e n s i t i v o m o t o r e s p e n e t r a m p e l o hilo v á s c u l o n e r v o s o e, após d i v i d i -r e m - s e -repetidamente,, a t i n g e m a p o -r ç ã o m é d i a ent-re a o -r i g e m e inse-rção do músculo. N e s t e p o n t o os fascículos n e r v o s o s espalham-se num leque de f i b r a s m i e l i n i z a d a s p r é - t e r m i n a i s , cada uma das quais i n d o i n e r v a r uma única f i b r a muscular. O a x ô n i o p r é - t e r m i n a l p e r d e sua capa de m i e l i n a e p e n e t r a na J N M ( t a m b é m conhecida como placa t e r m i n a l ) . P r e p a r a ç õ e s d e m o n s t r a n d o a a t i v i d a d e d a e n z i m a a c e t i l c o l i n e s t e r a s e ( F i g . 1 ) , a qual concentra-se nor-m a l nor-m e n t e nas g o t e i r a s d a J N M , p e r nor-m i t e nor-m a v a l i a ç ã o adequada do padrão d e i n e r v a ç ã o nor-m o t o r a muscular, b e m c o m o a estrutura d o a p a r e l h o subneural de Couteaux (11), o qual v a r i a em f o r m a e tamanho c o n f o r m e o t i p o d e fibra muscular a que pertença. Os p r i n c i p a i s aspectos u l t r a e s t r u t u r a i s d e J N M f o r a m e x t e n s i v a m e n t e r e v i s t o s p o r d i v e r s o s autores (6,10,15,18,32). O a x ô n i o t e r m i n a l , c o n t e n d o g r a n d e q u a n t i d a d e d e vesículas sinápticas e m i t o c ô n d r i a s , repousa numa depressão da m e m b r a n a sarcolemal que é acentuadamente p r e g u e a d a ( F i g . 1 ) . A super-fície e x t e r n a d o a x ô n i o é r e c o b e r t a p o r c i t o p l a s m a d a célula d e Schwann e há g r a n d e quanti-d a quanti-d e quanti-d e m e m b r a n a basal p r e e n c h e n quanti-d o a g o t e i r a sináptica. U s u a l m e n t e , o b s e r v a - s e a g l o m e r a quanti-d o d e núcleos e de o r g a n e l a s sarcoplasmáticas s u b j a c e n t e m e n t e à J N M . E x i s t e m diferenças ultra-estruturais entre J N M de fibras d e contração l e n t a e rápida. N a s p r i m e i r a s , os a x ô n i o s t e r m i n a i s são m e n o r e s e a r r e d o n d a d o s e o sarcoplasma d a placa t e r m i n a l contém m a i o r quantidade d e o r g a n e l a s e m e n o r n ú m e r o de p r e g a s pós-sinápticas (9,12,22,Jf2).
de J N M notou-se que, em a m b o s os e x p e r i m e n t o s , fibras musculares em graus avançados d e necrose e d e s o r g a n i z a ç ã o interna p e r m a n e c i a m quase s e m p r e i n e r v a d a s p o r a x ó n i o s t e r m i n a i s a p a r e n t e m e n t e n o r m a i s ( F i g . 2 ) . E s t e s t e r m i n a i s n e r v o s o s c o n t ê m m i t o c ô n d r i a s , vesículas sinápticas e outras o r g a n e l a s de aspecto habitual e as p r e g a s pós-sinápticas da m e m b r a n a sarcolemal p e r m a n e c i a m a p a r e n t e m e n t e i n a l t e r a d a s p e l o processo d e g e n e r a t i v o . N o s animais t r a t a d o s com fosfolipase A 2 intramuscular notaram-se ocasionais i n d e n t a ç õ e s da m e m b r a n a a x o n a l e r a r a s vesículas encapadas, nunca a um g r a u t ã o s e v e r o como o b s e r v a d o em animais t r a t a d o s com doses sistêmicas desta t o x i n a (8).
3. A l t e r a ç õ e s o b s e r v a d a s na J N M na fase crônica — N e s t e g r u p o incluímos animais t r a t a d o s com fosfolipase A 2 e estudados d e 4 semanas a 3 meses a p ó s i n t o x i c a ç ã o , b e m c o m o c a m u n d o n g o s ' m d x ' adultos com m i o p a t i a avançada, c o m g r a n d e p e r c e n t a g e m de fibras muscu-lares r e g e n e r a d a s (H). E m ambas as situações, as fibras muscumuscu-lares selecionadas apresenta-v a m - s e em fase aapresenta-vançada de r e g e n e r a ç ã o com i n t e r n a i i z a ç ã o nuclear ( q u e persiste no c a m u n d o n g o como sinal de d e g e n e r a ç ã o muscular p r é v i a ) e p r o l i f e r a ç ã o de o r g a n e l a s intracitoplasmáticas. P r e p a r a ç õ e s coradas p a r a d e m o n s t r a r a t i v i d a d e d a acetileolinesterase c o n f i r m a r a m q u e o p a d r ã o de i n e r v a ç ã o m o t o r a p e r m a n e c e i n a l t e r a d o apesar do g r a u a v a n ç a d o destas miopatias. E n t r e t a n t o , a m o r f o l o g i a do a p a r e l h o subneural de Couteaux sofreu acentuada m o d i f i c a ç ã o , o p a d r ã o contínuo o b s e r v a d o em placas t e r m i n a i s n o r m a i s s e n d o t o t a l m e n t e substituído p o r p a d r ã o f r a g m e n t a d o em pequenos g r u p o s d e máculas c o l i n e s t e r a s e - p o s i t i v a s , intercalados por á r e a s d e s p r o v i d a s de a t i v i d a d e enzimática ( F i g . 3 ) . A p e s a r disto, estas subunidades persis-t i r a m i n e r v a n d o f i b r a s musculares i n d i v i d u a i s a não se e v i d e n c i o u i n e r v a ç ã o c o l a persis-t e r a l . A nível u l t r a e s t r u t u r a l observou-se d i m i n u i ç ã o no n ú m e r o e c o m p l e x i d a d e das p r e g a s pós-si-nápticas de fibras musculares r e g e n e r a d a s ( F i g . 3 ) . O g r a u desta alteração pareceu ser d i r e t a m e n t e p r o p o r c i o n a l à fase r e g e n e r a t i v a muscular, sendo mais acentuado nos processos avançados. Estudos m o r f o m é t r i c o s com a u x í l i o d e analisador de i m a g e m e m i c r o c o m p u t a d o r v i e r a m a c o n f i r m a r estatisticamente as o b s e r v a ç õ e s m o r f o l ó g i c a s o b t i d a s a n í v e l ultraestrutural, c o n f o r m e d e m o n s t r a d o na t a b e l a 1. Os resultados i n d i c a m que n ã o há diferença s i g n i f i c a t i v a no tamanho de a x ô n i o s t e r m i n a i s , d e n s i d a d e d e vesículas sinápticas e c o m p r i m e n t o pré-si-náptico entre os animais estudados e r e s p e c t i v o s g r u p o s c o n t r o l e s . E n t r e t a n t o , em ambas as m i o p a t i a s e x p e r i m e n t a i s estudadas n o p r e s e n t e t r a b a l h o , o c o m p r i m e n t o pós-sináptico ( q u e r e f l e t e o n ú m e r o e p r o f u n d i d a d e das p r e g a s ) , a á r e a pós-sináptica d o sarcoplasma e a relação entre o c o m p r i m e n t o das m e m b r a n a s p ó s e pré-sinápticas a t i n g i r a m v a l o r e s m a r c a d a m e n t e r e d u z i d o s , as v e z e s r e p r e s e n t a n d o somente 50% do n o r m a l . É i m p o r t a n t e salientar ainda que raras placas terminais, m e s m o e m fibras r e g e n e r a d a s , a p r e s e n t a v a m aparência normal.
m d x c o n t r o l e F L A - I M c o n t r o l e
número J N M 37 72 62 44
área pré-sináptica 6,4 + 5,9 7,8 + 6,1 6,5 4- 5,5 7,8 + 6,7
área pós-sináptica 2,1 + 1,5** 4,2 + 2,5 1,3 + 1,2** 3,6 + 3,2
área m i t o c o n d r i a l 0,8 + 0,9 l.C + 1,1 0,8 + 0,9 1,1 J- 1,2
c o m p r i m e n t o pré-sináptico 5,7 + 2,5 6,3 4- 3,2 5,6 + 3,4 6,5 + 3,9
c o m p r i m e n t o pós-sináptico 10 + 6,1** 21,3 + 1 1 , 3 8,3 4- 5,8** 16,9 + 1 5 , 1
n ú m e r o de vesículas 374 + 280 470 + 338 269 4- 163 454 + 359
densidade v e s i c u l a r 66 + 30 75 + 82 50 + 20 71 + 34
c o m p r i m e n t o jpós/pré-sináptico 1,7 + 0,7** 3,5 + 1.4 1,4 + 0,3** 2,4 + 1,0
C O M E N T Á R I O S
Existem vários tipos de miopatias em animais laboratoriais, atualmente classifi-cados em três grandes grupos de o r i g e m : nutricionais, tóxicas e hereditárias 5,7,24,25,38. As miopatias nutricionais foram produzidas em quase todos os tipos de mamíferos e aves, utilizando-se deficiências dietéticas de vitamina E, ácidos g r a x o s não saturados, potássio, selênio e amino ácidos sulfurados, entre outros 5. A s miopatias tóxicas podem ser induzidas por miotoxinas primárias, tais como aquelas derivadas de bactérias, artrópodes e cobras ou por diversas drogas, como hormônios, antimaláricos, antibióticos,
anestésicos, narcóticos, catecolaminas 2
nervos periféricos 4 0
. O camundongo mutante 'mdx' é particularmente valioso por ser modelo laboratorial afetado por processo miopático puro sem envolvimento do sistema nervoso central ou periférico 39-41. A grande maioria das miopatias mencionadas, apesar de geradas por mecanismos totalmente distintos, determina reações patológicas básicas semelhantes a nível de fibras musculares. Nessas situações ocorre degeneração muscular com alterações de organelas como mitocôndrias, retículo endoplasmático e miofibrilas, com eventual formação de coágulos retracionais. T a l agressão muscu-lar é seguida por fagocitose de restos celumuscu-lares, proliferação de células satélites com formação de mioblastos, os quais se fundem para regenerar fibras musculares utili-zando o arcabouço delimitado pela membrana basal muscular raramente afetada em tais processos.
A nível de junção neuromuscular as alterações observadas nos dois modelos mio-páticos estudados no presente trabalho foram semelhantes entre si. Durante episódios de necrose muscular os axônios terminais permaneceram intactos, apesar de as fibras musculares que eles inervavam estarem totalmente desestruturadas. Em estadios mais avançados dessas miopatias, observou-se alteração em J N M inervando fibras muscula-res regeneradas (persistência de núcleos centralizados, por distribuição irregular de acetilcolinesterase e significante redução no número e complexidade das pregas pós-si-nápticas da membrana sarcolemal. A l t e r a ç õ e s semelhantes foram descritas em outras
situações experimentais, como após injeção de c r o t o x i n a3 4
, c a r d i o t o x i m a1 3
, bupiva-caína 23, no camundongo mutante 'dystrophia muscularis' 2,14,28,3^ bem como em
pacien-tes humanos com distrofia muscular tipo D u c h e n n e1 6
.2 1
. U m denominador comum à maioria das situações mencionadas é que fibras musculares foram submetidas a episó-dios de necrose seguidos por regeneração. Este fato permite especular que a falta de diferenciação da membrana sarcolemal, com consequente atrofia nas pregas pós-si-nápticas, pode ser consequência direta da regeneração muscular. Estudos reali-z a d o s no modelo 'mdx' e em camundongos tratados com fosfolipase A 2 demonstra-ram ausência de alterações clínicas, morfológicas e eletrofisiológicas indicativas de comprometimento neurogênico simultâneo nessas miopatias 8.39,41. Portanto, nossas observações favorecem ainda mais a presente hipótese de que as alterações observadas em J N M são provavelmente secundárias a necrose e regeneração muscular.
Os mecanismos de modulação e plasticidade da J N M permanecem desconhecidos. Sabe-se que alterações na forma e estrutura da J N M ocorrem regularmente e podem
ser decorrência de influências hormonais, senilidade, doenças ou desuso 1 9
. P o r
exem-plo, Snell e M c l n t y r e 36,37 e K o e n i g
2
? demonstraram que, após denervação, há perda e anormalidades progressivas nos locais de atividade da acetilcolinesterase muscular.
Fahim e R o b b i n s1 7
e Banker et a l .1
demonstraram alterações ultraestruturais na mor-fologia da J N M em camundongos idosos, com idade variando de 27 a 34 meses. Entre diversos fatores influenciando a reorganização da J N M , a membrana basal parece
desempenhar papel importante 4
-29. A constituição molecular da membrana basal jun-cional é diferente daquela em regiões distantes da J N M . N a área sináptica há maior
concentração de receptores de acetilcolina e canais de sódio 3
>2 9
. Implantação de fibras nervosas motoras em áreas aneurais de fibras musculares esqueléticas induz
modifica-ção da membrana basal com formamodifica-ção de J N M 6
-2
° . N o s modelos experimentais aqui estudados não há evidência clínico-laboratorial de denervação M l . Portanto apesar de atrofia significativa das pregas pós-sinápticas sarcolemais devida a regeneração muscular, parece haver mecanismo adaptativo da membrana basal juncional nesses animais, a qual possivelmente concentra quantidade suficiente de receptores de acetil-colina e canais iónicos para manutenção da fisiologia normal de transmissão neuro-muscular.
Finalmente, parece razoável aceitar que, em vista das observações relatadas, a exuberante quantidade de pregas pós-sinápticas normalmente encontrada nas J N M deve representar mecanismo anatômico de segurança na transmissão química nervosa. Esta hipótese explicaria porque fibras musculares, contendo aproximadamente metade do comprimento de membrana pós-sináptica, são ainda capazes de manter função apa-rentemente normal.
R E F E R Ê N C I A S
1. B a n k e r B Q , K e l l y SS, R o b b i n s N — N e u r o m u s c u l a r t r a n s m i s s i o n and c o r r e l a t i v e m o r p h o -l o g y in y o u n g and o -l d mice. J P h y s i o -l 339:355, 1983.
2. B a n k e r B Q , H i r s t N S , Chester CS, F o k R Y — H i s t o m e t r i c and electron c y t o c h e m i c a l study of muscle in the d y s t r o p h i c mouse. A n n N e w Y o r k A c a d Sci 317:374, 1979.
3. B e a m K G , C a l d w e l l J H , C a m p b e l l D T — N a channels in skeletal muscle concentrated near the neuromuscular j u n c t i o n . N a t u r e 313:588, 1985.
4. B e t z W , Sakmann B — E f f e c t s of p r o t e o l y t i c e n z y m e s on function and structure of f r o g neuromuscular j u n c t i o n s . J P h y s i o l 230:673, 1973.
5. B l a x t e r K L — M y o p a t h i e s in animals. I n W a l t o n J : D i s o r d e r s of V o l u n t a r y M u s c l e . Churchill L i v i n g s t o n e , E d i n b u r g h , 1974.
6. B o w d e n , R E M , D u c h e L W — T h e a n a t o m y and p a t h o l o g y o f the neuromuscular j u n c t i o n . I n Z a i m i s E : H a n d b o o k of E x p e r i m e n t a l P h a r m a c o l o g y . S p r i n g e r , B e r l i n , 1976.
7. B r a d l e y R , F e l l B F — M y o p a t h i e s in animals. I n W a l t o n J: D i s o r d e r s of V o l u n t a r y Muscle. Churchill L i v i n g s t o n e , E d i n b u r g h , 1981.
8. B r o o k G, T o r r e s L F , G o p a l a k r i s h n a k o n e P , Duchen L W — E f f e c t s of phospholipase of E n h y d r i n a schistosa v e n o m on n e r v e , m o t o r e n d - p l a t e and muscle of the mouse. Quart J E x p e r i P h y s i o l 72:571, 1987.
9. Buchthal F , Schmalbruch H — M o t o r u n i t o f m a m m a l i a n muscle. P h y s i o l R e v 60:90, 1980.
10. Coers C — M o r p h o l o g i e de la j o n c t i o n neuro-musculaire. A r c h B i o l ( L i e g e ) 75 ( s u p p l ) : 905, 1964.
11. Couteaux R — M o r p h o l o g i c a l and c y t o c h e m i c a l o b s e r v a t i o n s on t h e p o s t - s y n a p t i c m e m b r a n e at m o t o r end-plates and g a n g l i o n i c synapses. E x p e r Cell R e s 5 ( s u p p l ) :294, 1958.
12. Duchen L W — A n electron m i c r o s c o p i c c o m p a r i s o n of m o t o r end-plates of s l o w and fast skeletal muscle f i b r e s o f the mouse. J N e u r o l Sci 14:37, 1970.
13. Duchen L W , E x c e l l B J , P a t e l R , S m i t h B — C h a n g e s in m o t o r end-plates r e s u l t i n g from muscle f i b r e necrosis and r e g e n e r a t i o n : a l i g h t and electron m i c r o s c o p i c study of the effects of the d e p o l a r i z i n g fraction of D e n d r o a s p i s j a m e s o n i v e n o m . J N e u r o l Sci 21 :391, 1974.
14. E l l i s m a n M H — T h e m e m b r a n e m o r p h o l o g y of the neuromuscular j u n c t i o n , sarcolemma, sarcoplasmic r e t i c u l u m and t r a n s v e r s e t u b u l e s y s t e m in m u r i n e muscular d y s t r o p h y studied b y f r e e z e - f r a c t u r e electron m i c r o s c o p y . B r a i n R e s 214:261, 1981.
15. E n g e l A G , Santa T — H i s t o m e t r i c a n a l y s i s of the u l t r a s t r u c t u r e of the neuromuscular j u n c t i o n in m y a s t h e n i a g r a v i s and in the m y a s t h e n i c s y n d r o m e . A n n N e w Y o r k A c a d Sci 183 : 46, 1971.
16. E n g e l A G , J e r u s a l e m F , T s u j i h a t a M , G o m e z M R — T h e neuromuscular j u n c t i o n i n m y o p a t h i e s : a q u a n t i t a t i v e ultrastructural study. R e c e n t A d v a n c e s in M y o l o g y 360:132, 1974.
17. F a h i m M A , R o b b i n s N — U l t r a s t r u c t u r e studies of y o u n g and old mouse neuromuscular junctions. J N e u r o c y t o l 11:641, 1982.
18. F a r d e a u M — U l t r a s t r u t u r e des j o n c t i o n s n e u r o m u s c u l a i r e s dans la musculature sque-_ l e t t i q u e du c o b a y e . I n I s r a e l M , M a n a r a n c h e R : L a T r a n s m i s s i o n C h o l i n e r g i q u e de L ' E x c i t a t i o n . I n s e r m , P a r i s , 1973.
19. G r i n n e l l A D , H e r r e r a A A — S p e c i f i c i t y and p l a s t i c i t y of neuromuscular c o n n e c t i o n s : l o n g - t e r m r e g u l a t i o n of m o t o r neuron function. P r o g r e s s in N e u r o b i o l 17:203, 1981.
20. G w y n D G , A i t k e n J T — T h e f o r m a t i o n o f n e w e n d - p l a t e s in m a m m a l i a n skeletal muscle. J A n a t o m y 100 : 116, 1966.
22. H o p k i n s W G , B r o w n M C , K e y n e s R J — P o s t n a t a l g r o w t h of m o t o r nerve t e r m i n a l s in muscles of the mouse. J N e u r o c y t 14 :525, 1985.
23. J i r m a n o v a I — U l t r a s t r u c t u r e of m o t o r end-plates d u r i n g p h a r m a c o l o g i c a l l y induced d e g e n e r a t i o n and subsequent r e g e n e r a t i o n of skeletal muscle. J N e u r o c y t o l 4:141, 1975.
24. K a k u l a s B A — E x p e r i m e n t a l M y o p a t h i e s . I n W a l t o n J : D i s o r d e r s of V o l u n t a r y Muscle. Churchill L i v i n g s t o n e , E d i n b u r g h , 1981.
25. K a k u l a s B A — T o x i c and d r u g - i n d u c e d m y o p a t h i e s . In M a s t a g l i a F L , W a l t o n J: Skeletal Muscle P a t h o l o g y . Churchill L i v i n g s t o n e , E d i n b u r g h , 1982.
26. K a r n o v s k y M J — A f o r m a l d e h y d e - g l u r a r a l d e h y d e f i x a t i v e of h i g h o s m o l a r i t y for use in electron m i c r o s c o p y . J Cell B i o l 27 :137A, 1965.
27. K o e n i g J — M o r p h o g e n e s i s of m o t o r end-plates 'in v i v o ' and 'in v i t r o ' . B r a i n R e s 62:361, 1973.
28. L a w P K , Saito A , F l e i s c h e r S — U l t r a s t r u c t u r a l changes in muscle and m o t o r e n d - p l a t e of the d y s t r o p h i c mouse. E x p e r N e u r o l 80:361, 1983.
29. M c M a h a n UJ, E d g i n g t o n D R , K u f f l e r D P — F a c t o r that influence r e g e n e r a t i o n of the neuromuscular junction. J E x p e r B i o l 89:31, 1980.
30. N a m b a T , N a k a m u r a T , G r o b D — S t a i n i n g f o r n e r v e f i b r e and cholinesterase a c t i v i t y in fresh frozen sections. A m J Clin P a t h o l 47:74, 1967.
31. Ontell M , H a l l e r E — N e c r o t i c extrafusal muscle f i b r e s of the d y s t r o p h i c mutant m o u s e : the u l t r a s t r u c t u r e of the m y o n e u r a l j u n c t i o n . A n a t R e c 197:397, 1980.
32. P a d y k u l a H A , Gauthier G F — T h e u l t r a s t r u c t u r e of the neuromuscular junction of m a m m a l i a n red, w t h i t e and i n t e r m e d i a t e skeletal muscle f i b r e s . J Cell Biol 46:27, 1970.
33. P e s t r o n k A , D r a c h m a n D — A n e w stain f o r q u a n t i t a t i v e m e a s u r e m e n t of s p r o u t i n g at neuromuscular j u n c t i o n s . M u s c l e and N e r v e , 1:70, 1978.
34. Q u e i r o z L S — E f f e c t s of n e u r o t o x i n s on muscle and n e r v e in the m o u s e : m o r p h o l o g i c a l and p h y s i o l o g i c a l studies. T e s e P h D . U n i v e r s i d a d e de L o n d r e s , I n g l a t e r r a , 1981.
35. Santa T , E n g e l A G — H i s t o m e t r i c a n a l y s i s of neuromuscular j u n c t i o n u l t r a s t r u c t u r e in rat red, w h i t e and i n t e r m e d i a t e muscle f i b r e s . I n D e s m e d t J E : N e w D e v e l o p m e n t s in E M G and Clinical N e u r o p h y s i o l o g y . K a r g e r , Basel, 1973.
36. Snell R S , M c l n t y r e N — E f f e c t o f d e n e r v a t i o n on the histochemical appearance of cholinesterase at the m y o n e u r a l j u n c t i o n . N a t u r e 176:884, 1955.
37. Snell R S , M c l n t y r e N — C h a n g e s in the histochemical appearances of cholinesterase at the m o t o r e n d - p l a t e f o l l o w i n g d e n e r v a t i o n . B r J E x p e r P a t h o l 37 ( 1 ) , 1956.
38. T e l f o r d I R , E i n a r s o n L — E x p e r i m e n t a l muscular d y s t r o p h i e s in a n i m a l s . Charles T h o m a s , U S A , 1971.
39. T o r r e s L F B — Muscle, m o t o r e n d - p l a t e and n e r v e s in h e r e d i t a r y and e x p e r i m e n t a l m y o p a t h i e s in the mouse. T e s e P h D . U n i v e r s i d a d e de L o n d r e s , I n g l a t e r r a , 1986.
40. T o r r e s L F B — I n h e r i t e d neuromuscular diseases in the m o u s e : a r e v i e w of the l i t e r a t u r e . A r q N e u r o - P s i q u i a t ( S ã o P a u l o ) 46:298, 1988.
41. T o r r e s L F B , Duchen L W — T h e m u t a n t ' m d x ' : i n h e r i t e d m y o p a t h y in the mouse. M o r p h o l o g i c a l studies of nerves, muscles and end-plates. B r a i n 110-269, 1987.
